Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bakteriyofaj Görüntüleme Kütüphane Peptitler Mezenkimal Hücreler Gen ekspresyonunu modüle ve Unicortical Kemik Hastalıkları Osteogenezi potansiyalize

Published: December 10, 2010 doi: 10.3791/2362
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 1
1Orthopaedics Research, University of Virginia, 2Biological Sciences, University of Delaware, 3Orthopaedic Surgery, University of Virginia

Summary

Bir faj gösterim kütüphanesi hedef kemiği de peptit dizileri tanımlamak için kullanılır oldu. Amacı, mezenkimal hücre farklılaşması, bu peptitler etkisini araştırmak ve kemik rejenerasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için.

Abstract

İki yeni sentetik peptidlerin kemik oluşumunu hızlandıran ve kollajen matriks kullanılarak teslim edilebilir. Bu çalışmanın amacı, bir unicortical defekt modeli, kemik onarım üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Tedavi mezenkimal hücreler, alkalin fosfataz aktivitesinde bir artış, üretilen bu hücreler tarafından nodül oluşumu gösterdi ve Runx2, Osterix, kemik sialoprotein, ve osteokalsin için genlerin ifade arttı. Kontrolü daha az etkili iken kollajen sünger, kemik defektleri peptid terfi onarım ile ıslatılır. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, in vitro peptit ile tedavi edilen mezenkimal hücreler, kollajen sünger kullanarak in vivo teslim peptidler unicortical kusurlar tamir teşvik, osteogenesis doğru farklılaştırmak, ve gösterdi.

Protocol

1 in vivo olarak Faj yalıtın Biopanning Bu Hedef Uzun Kemikler

Faj DNA dizilimini ve buna karşılık gelen bir dizisi ile Peptitler sentezlenmiştir. Peptitler Gly-Gly-Gly-ser-lizin Bağlayıcı (linker / iz peptidler izlemek için yardımcı çift floresan kromoforlar tabi) sentezlenmiştir.

  1. 10 haftalık Balb / c fare anestezi, kalp maruz.
  2. Doktora-12 Faj ekran peptit kütüphanesi kiti (New England Biolabs, Beverly, MA) in vivo biopanning, 10 x 1010 pfu için kullanılan ve kalbin içine enjekte edildi.
  3. Yaklaşık 5 dakika sonra, fare ötenazi edildi. Femur maruz kalan ve disseke, femur ucu kesildi ve kemik iliği kaldırıldı.
  4. Sol femur içinde ve dışında 10 kez PBS ile yıkandıktan sonra, femur ER2537 bakteriler eklendi (non-yıkandı, faj olarak adlandırılır, 6. adıma atlayın).
  5. Sağ femur intramedüller kanal, 21-gauge iğne ile bağlı olmayan faj kaldırmak için bir şırınga% 2 kurutulmuş yağsız süt ile on kez durulanır. Bound faj, HCl glisin tamponu, pH 2.2, 1M Tris ile nötralize ile intramedüller kanal yıkandı, ER2537 bakteri ve faj (kolonda sürüklenecektir olarak anılacaktır) yükseltmek için 4.5 saat süreyle kültüre.
  6. Bakteriler, 4 ° C ve faj PEG / NaCl çözeltisi ilave edilerek 4 ° C'de gece çöktürülmüş 10 dakika santrifüj sedimentasyon çıkarıldı. Faj santrifüj tarafından toplanan ve asma ve 1 / 6 hacmi PEG / NaCl ilave edilerek iki kez çöktürülmüş oldu. Son pelet% 0,02 NaN3 TBS içinde yeniden süspanse edildi.
  7. Ve non-yıkandı, yıkandı, faj amplifiye Eluatlar ayrı farelere enjekte edildi ve faj yukarıdaki gibi izole edilmiştir. Sadece sol femur olmayan yıkandı, faj enjekte ve femur (bkz. yukarıda adım 4) bakteriler doğrudan yerleştirilir fare kaldırıldı. Yıkandı, faj fare sadece sağ femur ve (bkz. yukarıdaki adım 5), bakteri eklemeden önce HCI-glisin tampon tarafından yayımlanan faj izole edilmiştir.
  8. Bu in vivo biopanning prosedürü astar (Faj ekran kiti ile sağlanan)-98 kullanarak DNA sıralama önce üç kez tekrarlandı.
  9. Pooled faj, saflaştırılmış, bakteri kültürleri amplifiye quantitated ve sonra dördüncü bir fare enjekte edildi. Sıralama tekrarlanır oldu.
  10. Kemik ve kemik iliği peptid özgüllüğü göstermek için, faj, böbrek yıkandı, ve karaciğer yukarıda açıklandığı gibi analiz edildi. Tüm etaplarda bu organların (% 10'dan az) bulunan faj küçük miktarda vardı.
  11. Peptitler, ve biyotin, hücre ve doku boyama için kullanılacak gibi in vivo çalışma olmadan, Gly-Gly-Gly-ser-lys sırası ile sentezlenmiştir .

2. Osteojenik Hücre Farklılaşma Deneyler Mezenkimal Hücre Kültürü

  1. Laboratuarımızda 1 izole edilen klonlanmış bir fare çoklu potansiyel kemik iliği stroma (D1) in vitro deneylerde hücre hattı kullanılmıştır . Hücreleri Dulbecco'nun modifiye temel, orta, DMEM,% 10 fetal sığır serumu (Gibco kedi # 16.000-044), elli miligram sodyum askorbat mililitrede (ile desteklenmiş düşük glikoz (Gibco kedi # 11.885-084) kültüre edildi Sigma kedi # A7631 ), ve 100 U / ml penisilin G ve 100 mg / ml streptomisin (Gibco kedi # 15.140-122).
  2. Kültürler 37 tutuldu ° C,% 5 CO 2 su ceketli inkübatörler ve alt-kültür nemlendirilmiş bir atmosferde hücreleri yaklaşık 90% konfluent kadar .
  3. Hücre, tripsinize pelet için santrifüj sayılır ve plasticware tedavi 5x10 3 hücre / doku kültürü cm 2 'lik bir konsantrasyon numaralı seribaşı idi.

3. Doku ve Hücre ve Doku Peptid Boyama

  1. D1 veya kemik iliği hücreleri, fibronektin veya jelatin kaplı oda kaplanmıştır DMEM ve 24 saat boyunca% 10 fetal sığır serumu içeren slaytlar.
  2. Hücreler PBS ile yıkandı. 30 dakika boyunca% 4 paraformaldehid hücre / doku ile tespit edildi
  3. Aşırı aldehit, 10 dakika için 0.5 M Glisin (pH 7.5) ile bloke edildi.
  4. Endojen avidin ve biyotin reseptörleri hücre yüzeyinde, 1 saat süreyle% 5 BSA + Avidin engelleme çözüm ek tarafından bloke edildi, sonra 1 saat süreyle% 5 BSA + Biotin engelleme çözümü bloke 5 dakika boyunca bir kez PBS ile durulanır.
  5. Daha sonra 100 mcM biotinlenmiş L7 ve R1 peptidler, 30 dakika boyunca kuyulara ilave edildi.
  6. Hücreler ve Alexa Un Streptavidin 1:1000 dilüsyon eklenir ve 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edildi 5 dk PBS ile üç kez yıkandı.
  7. Hücreler yıkanmış ve lamelleri vectashield montaj medya ile monte edilmiş ve bir floresan mikroskop altında incelenir.

4. Alkalin Fosfataz Aktivitesi Testi

  1. Alkalin fosfataz cüretici tarafından önerilen bir alkalin fosfataz kiti (BioRad) kullanarak mono tabakaları olorimetric tahlil yapıldı.
  2. D1 hücreleri x 10 3 hücre / cm 2, 6 kuyu kültür plakalar üzerinde bir yoğunluk 5 kaplama ve R1 peptit ile tedavi edildi, ALP aktivitesi gün 4, 8, 12, 16 ve 20 belirlendi .
  3. Hücre lizatları hazırlamak için, hücre tabakaları PBS ile üç defa yıkanır ve sonra PBS içine kazınmış sonication ve hücresel enkaz kaldırmak için santrifüj izledi.
  4. Eşit miktarda lizat (100 mcL) 100 mcL taze hazırlanmış kolorimetrik substrat para-nitrofenil fosfat ile karıştırdı ve 37 inkübe ° C de 30 dakika boyunca.
  5. 0.2 N NaOH çözümleri 100 mcL ekleyerek enzimatik reaksiyon durduruldu. ALP aktivitesi ELISA okuyucu (Bio-Rad) kullanılarak 405 nm'de ölçüldü.
  6. Protein konsantrasyonu hücre lizatları BioRad Protein Testi Kiti ile ölçüldü ve AP aktivitesi sonra para-nitrofenol nmol / dak / mg protein olarak ifade edildi.
  7. ALP aktivitesi üreticinin özellikleri (Sigma, Inc.) Göre hesaplanmıştır.
  8. ALP aktivite birimleri hücre lizat BCA yöntemi (Pierce, Rockford, IL) ile toplam protein içeriği miligram normalize edildi.

5. L7 ve R1 kullanarak Mezenkimal Hücre Farklılaşması

  1. Akışkan mezenkimal hücreler (D1) confluency yaklaşık% 90 büyüdü ve 5nm L7 ve R1 peptid ile tedavi edildi.
  2. Hücreler, 0.5, 2, 6, 24 ve 48 saat hasat edildi ve RNA üreticinin talimatlarına kullanarak Qiagen RNeasy kiti kullanılarak hazırlanmıştır.
  3. Ters transkriptaz (RT) reaksiyonlar tavlanmış (37 ° C, 10 dakika) ve ilk iplikçik cDNA sentezi (42 ° C, 30 dakika) ve ısı inaktivasyonu (5 dakika boyunca 95 ° C) ile takip edildi. Ortaya çıkan cDNA donmuş depolanan (-70 ° C), gerçek zamanlı PCR ile test kadar.
  4. Real Time PCR QuantiTect SYBR Green PCR kiti (Qiagen) kullanılarak yapıldı. Reaksiyonlar, 25 SYBR Green kiti ana karışımı mcL ve ileri ve Runx2 örneğin, Osterix, Osteokalsin, Kemik sialoprotein ve-katenin olarak wnt yol genler için kemik spesifik genlerin ters primerler (300 nmol / L) ile yapıldı LRP6, Wnt 5a, 7b, 10b, DKK1 ve OPG ve RANKL (bkz. Tablo 1).
  5. CDNA örnek 3 mcL RT tepki sulandırılmamış nihai reaksiyon karışımına eklendi. 96-iyi real-time PCR formatı plazmid DNA standartları yinelenen altı 10 kat dilüsyonlarının dahildir. Plaka kuyu optik yapıştırıcı kapakları (BioRad) ile mühürlü ve tam karıştırma sağlamak için düşük hızda (300 g, 5 dakika) santrifüj edildi.
  6. Her numune en az iki nüsha iCycler aleti (BioRad Laboratories, Hercules, CA) ile incelendi.
  7. PCR protokolleri 94 40 döngü denatürasyon AmpliTaq Gold DNA polimeraz ilgili aktivasyon ° C 30 saniye, 30 saniye boyunca 72 ° C'de 30 saniye, ve uzatma ilgili tavlama sıcaklığı. Her bir örnek için PCR eşik devir sayısı (BT), floresan eşik sınırı aşıldı noktada hesaplanmıştır. Eşik sınırı, ortalama bir arka plan floresan üzerinde 10 ila 20 standart sapma (SD) floresan eğrileri doğrusal logaritmik faz boyunca tespit edildi. Standart eğri denklemleri toplam RNA günümüze kadar cDNA göreli log10 karşısında ortalama BT regresyon analizi ile hesaplandı. Hedef genlerin Bağıl ifade kemik spesifik genler 18S normalize ve b-aktin Wnt yolunun gen için kullanılır.

6 Gelfoam Kompozit in vivo Hazırlık

  1. Aseptik rutinleri kullanarak, gelfoam silindir (Pharmacia & Upjohn kedi # 09-0353-01), 3 mm çapında 8 mm uzunluğunda, kendi kendine tasarlanmış bir alet kullanılarak oluşturuldu.
  2. Cerrahi yirmi dört saat önce, gelfoam silindir emmek-yüklü L7 veya peptid olmadan R1 peptid (PBS içinde 20 mcM) veya PBS. Gelfoam silindirler steril 12 kuyu kültür kaplarına aktarılır ve gece -4 ° C'de muhafaza edildi
  3. Cerrahi zamanda, kültür yemekler gelfoam kompozit buzdolabı taşındı ve ameliyat kadar buz koymak.

7. Kemik defektleri

  1. Tüm hayvan prosedürleri, Virginia Üniversitesi, Sağlık Sistemi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, önceki yapılmaktadır tarafından kabul edildi. On dokuz aylık yetişkin singeneik erkek Fischer 344 sıçanlar (350-400 g), ketamin (gram vücut ağırlığı başına 50 g) ve xylazine (5 g gram vücut ağırlığı başına) karışımı ile anestezi intraperitoneal.
  2. Tibianın anteromedial yönü ile ikili bir cerrahi yaklaşım yapıldı. Sıçanlar bu yaşta veya daha büyük kesit alanı önemsiz artışlar, kortikal kemik alanı, kemik kütlesi, kemik yoğunluğu ve anteromedia aksiyel uzunluk gösterirtibia l yönü. Tuzlu sulama altında; büyük bir dikdörtgen unicortical defekt uzun bir pnömatik çapak (Zimmer Hall High Speed ​​Drill) kullanarak 8 mm 3 mm genişliğinde ölçülen oluşturuldu.
  3. Kemik defekti peptidler içeren veya içermeyen ya gelfoam ile tedavi edildi. 1.5 mm derinlik 8 mm uzunluğunda 3 mm genişliğinde ölçüm implante Tüm iskeleler, nazik dokunarak yerleştirildi. Hayır harici veya dahili uzuv fiksasyon cihazlarının ameliyat sonrası kullanılır ve herhangi bir kısıtlama olmaksızın ambulasyon izin hayvanların ameliyattan hemen takip ediyorlardı.

8. Histoloji ve morfometrisi

Kemik rejenerasyonu brüt morfolojisi ve alınan dijital görüntüler ile değerlendirildi.

  1. Sıçanlar ötenazi ve tibiaları 5, 3 toplandı ve 12 hafta hasarına yanıt olarak oluşturulan yeni kemik miktarını ölçmek için.
  2. Hasat tibia kemik defekti dikkatle kontrol ettikten sonra, sonra boyuna rutin olarak işlenmiş ve parafine ve kesitli, 72 saat boyunca RDO hızlı decalcifier Tankı, nötr formalin tamponlu% 10 fikse edildi.
  3. Kemik rejenerasyonu brüt ve ışık mikroskobik muayene ile değerlendirildi.
  4. On hayvanlar her koşul için (yani boş kusur, gelfoam tek başına ve gelfoam artı R1 peptid) kullanılmıştır. 8mm unicortical kusur, 8 mikron kalınlığında, her biri ~ 40 doku bölümleri, çapında temsil edildi. Bu 40 bölümden, yeni kemik miktarını ölçmek için en az 6 bölümden kullandı.
  5. Tüm doku kesitlerinde osteoid matriks etiketler Hematoksilen / eozin (H & E) ile boyandı.
  6. Tüm slaytlar mikroskobu ile incelendi.

9 - Kemik Onarım

Genel bakış

Kemik onarım açıkça göz kas-iskelet doku rejenerasyonu alanında çok önemli bir alan. Peptidler hedef yıl olmasa bile on yıllar boyunca kalıcı olabilir protez kullanımı özellikle kemik, Ortopedi ve Travmatoloji pratiğinde önemli bir yardımcı program olabilirdi ki. Kemik tropik faktörlerin biyomimetik doku mühendisliği alanında teknolojik bir adım, hem de kemik protez ameliyatı için yaratabilir. Sentetik ya da doğal polimerleri kemik faktörleri hedef alması dolayısıyla, onarım ve yenilenme gören dokuların içinde endojen hücreler temizleyici, hücre bağlılık özgüllüğü yardımcı olabilir. Ek bir amaç, bir faj gösterim kütüphanesi biopanning in vivo tarafından tespit peptidler hedefleme benzersiz kemik, kemik ve kemik iliğinden izole hücreleri bağlamak olsaydı kurmak ve osteogenezis vitro ve in vivo olarak kemik rejenerasyon modüle potansiyeline sahip oldu.

Deneylerde, kemik rejenerasyonu peptid faaliyetin ayrıntıları aydınlatmak için, histoloji, biyokimya, gen ekspresyonu, mikro-CT ve sipariş biyomekanik tarafından incelenir, doğal ve sentetik polimer matrisler ve kemik rejenerasyonu kullanarak sıçan femoral kusurları peptidler teslim etti. Bu yaklaşım daha da geliştirilmesi, biyolojik olarak aktif bileşikler hedef kemik keşfi ve geliştirilmesi için yol ve hücresel ve moleküler düzeyde biyolojik olarak karakterize edilirler mekanizmalar aracılığıyla onarım potansiyalize.

Boyanma

Peptidler mezenkimal hücreler için bağlayıcı ve lokalizasyonu belirlemek için biotin etiketleri ile sentezlenmiştir. Floresein izotiyosiyanat (FITC) avidin, in vitro olarak yetiştirilen hücreler mikroskobik peptidlerin bağlama yerelleştirmek kullanılan etiketli . Peptidlerin yanı sıra kültür mezenkimal hücreler in vitro fare kaburga doku kesitlerinde (Şekil 1) ve kemik iliği bağlanırlar.

Von Kossa Boyama

Mezenkimal hücre (D1), kemik iliği klonlanmış ve peptidlerin osteojenik Vitro hücreleri üzerinde etkisini belirlemek için kullanılmıştır . Hücreleri, hücre morfolojisi ve gen ekspresyonu değişiklikleri belirlemek için peptidler L7 ve R1 ile tedavi edildi. 4. günde, hücrelerin toplam başlamıştı, ve agrega, nodüller, kültür kemik hücreleri (Şekil 2) benzer bir hücre davranış kalıbı oluşturmak için zaman genişletilmiştir .

Peptid L7 ek veya von Kossa ile kültürlerin hücreleri gelişmiş boyama R1. Hücreler daha sonra 16 gün kültür peptid L7 veya R1 farklı konsantrasyonları ile tedavi edildi. In vitro 5 nM peptid en etkili olduğu tespit edilmiştir. Peptid ile tedavi edildi kültürlerde Alkalin fosfataz aktivitesi 2 ila 3,5 kat arttı. Kat artış peptid konsantrasyonu ve kültür tedavi süresi bağlıydı.

Real-time PCR

L7 ile muamele edilen hücreler ve R1 peptidler Gerçek Zamanlı P kullanılarak analiz edildiCR için, bilinen iki kemik hücresi transkripsiyon faktörleri (Osterix ve Runx2) ve üç kemik matriks proteinleri (kemik sialoprotein, osteokalsin ve kollajen tip I) gen ekspresyonu. R1 ile tedavi Osterix ve Runx2 gen ekspresyonu artış gösterdi. Kollajen tip 1 gen ekspresyonu değişmemiştir. L7 ile tedavi, BSP ve osteokalsin gen ekspresyonu bir artışın yanı sıra, tip I kollajen gen ekspresyonu gösterdi. Bu hem peptidler, mezenkimal hücre kültürlerinde osteogenezis oluşumu ve ilerlemesinde ilgili genler üzerinde bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir.

Peptidler R1 ve L7 ile in vitro hücre kültürleri tedavi mezenkimal hücreler kullanarak kemik oluşumu ile ilgili bir anabolik etkisi ortaya çıkarmıştır . RANKL için osteoprotegerin oranında bir artış osteoklastlar olarak bilinen kemik yıkıcı hücreler işe bir azalma gösterir. Peptitler ile hücrelerin tedavisi ayrıca kemik oluşumu ile ilişkilidir ve osteogenezis inhibe eden faktörleri azalır genlerin ifadesinde bir artışa yol açar.

Histoloji

Kemik miktarını belirlemek için, biz böylece otofloresans μLtraviolet ışık üreten kemik dilim maruz. Bu niceliklendirme 2 amaç için, kemik ve non-kemik dokuları arasında daha fazla kontrast sağlar . Bölümlerde aynı büyütme (x10 objektif) bir Nikon dijital görüntüleme sistemi ile parlak bir alan ve UV ışığı (Şekil 3) Nikon ve UV ışığı kullanarak fotoğrafları çekildi. Sonuçta elde edilen dijital görüntüler Metavue görüntüleme yazılımı (Moleküler Cihazlar) ile analiz edildi. 8 mm unicortical kusur içeren sabit bir faiz, dikdörtgen bölge (ROI) seçti. Yaralanma site her zaman, her görüntünün doğru pozisyonda elle kutuya koyarak bu ROI içinde temsil ediliyordu. H & E-pozitif piksel kısmen, bir renk tolerans sihirli değnek aracı kullanarak otomatik. H & E-boyanan kesitler kemik dokusunun histolojik görünümü ile tam denk yeşil bir dizi vurgulanır piksel sonuçlandı Bu tolerans ayarı. H & E-pozitif piksel her bölüm için toplam sayısı kaydedildi. Tibial her numune için ayrı ayrı bölümlerden piksel sayıları ortalamaları alındı ​​ve bu ortalamalara göre tedavi grupları içinde ve arasındaki farkları alınarak hesaplanmıştır. Tüm numuneler için alanlarda daha sonra yeni kortikal kemik miktarı (Şekil 4) dayalı olarak karşılaştırıldı .

Karşılaştırıldığında tek başına gelfoam gelfoam + peptit ile tedavi edilen kusurlar kemik onarım belirlemek için kemik bölümlerde varlığı belirlendi. Gelfoam + R1 peptit ile doluydu Kusur 3. en büyük 10 ile kortikal onarım tutarı, 7 ve 2 kat artarak, 5, 12 hafta sırasıyla gösterdi. Gelfoam kortikal kemik onarım farklar + peptid yalnız gelfoam ile karşılaştırıldığında peptid kortikal kemik rejenerasyonu (Şekil 5) teşvik gösteren 3 ve 5 hafta en dikkat çekici.

10 Osteojenik Peptitler Anabolik Etkisi

OPG / RANKL oranı peptidler osteoblastlar üzerinde doğrudan bir etkisi var ve kemik rezorpsiyonu düzenleyen anlaşılacağı RANKL / OPG oranı, daha büyüktür.

Sentetik peptidlerin hazırlık hız, moleküler istikrar, uzun raf ömrü ve potansiyel terapötik uygulamalar gibi daha büyük moleküller daha fazla avantaj olabilir. Önemli bir ilerleme kontrol sitokinler ve büyüme faktörleri, kemik kaybı ve rejenerasyon modüle girişimleri yapılmıştır. Bu osteotropic peptitler, kemik anabolizmasını ve kemik rejenerasyonu teşvik mevcut tedaviler için cazip alternatifler sunabilir.

Şekil 1
Şekil 1 in vitro fare kaburga doku bölümünde kemik iliği ve bağlayıcıdır Peptid.

Şekil 2
Şekil 2 mezenkimal hücreler (D1) peptid tedaviden sonra nodüller oluşturur.

Şekil 3
Şekil 3 osteojenik peptidler, L7 ve R1 ile kemik onarım Histoloji.

Şekil 4
Şekil 4. Kemik bölümler otofloresans neden olan UV ışık altında H & E ile boyandı. Bu kantitatif amaçlar için, kemik ve non-kemik dokuları arasında daha fazla kontrast sağlar.

Şekil 5
Şekil 5 kantitasyonu histoloji bölümlerinde kemik kortikal onarım en büyük miktar ile 5 hafta olduğunu gösterdi10 katlık bir değişiklik, 7 ve 2 kat, 3 ve 5 hafta peptid kortikal kemik rejenerasyonu teşvik gösteren.

Disclosures

Bu video üretim, Inc, New England Biolabs Bu makalede kullanılan bazı reaktiflerin üreten sponsor oldu.

Acknowledgments

Sağlık, AR53579, Osteogenezi National Institutes: Kemik Tropic Peptitler potansiyelize
Ulusal Sağlık Enstitüleri, AR056422 osteojenik Peptitler Anabolik Etkisi
Ulusal Sağlık Enstitüleri, T32 AR050960, Kas-iskelet Doku Onarımı ve Rejenerasyon
DOD, PC051219 Nucleolin: Prostat Kanseri ve Kemik İliği Endotel Hücre Adezyon Romanı Arabulucu
Savunma Bakanlığı, PC061508 Prostat Kanseri Metastaz Hücre Kemik İliği yapışma Arabulucular

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phage Display Peptide Library Kit-Ph.D-12 New England Biolabs E8110S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Diduch, D. R., Coe, M. R., Joyner, C., Owen, M. E., Balian, G. Two cell lines from bone marrow that differ in terms of collagen synthesis, osteogenic characteristics, and matrix mineralization. J. Bone Joint Surg. Am. 75, 92-105 (1993).
  2. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A. E., Davies, C. M., Richards, R. G. Viability in ex vivo cultured cancellous. Eur. Cells. Mater. 13, 69-70 (2007).
  3. Lehr, J. E., Pienta, K. J. Preferential adhesion of prostate cancer cells to a human bone marrow endothelial cell line. J. Natl. Cancer Inst. 90, 118-123 (1998).
  4. Schuster, N., Götz, C., Faust, M., Schneider, E., Prowald, A., Jungbluth, A., Montenarh, M. Wild-type p53 inhibits protein kinase CK2 activity. J. Cell Biochem. 81, 172-183 (2001).
  5. Cwirla, S. E., Peters, E. A., Barrett, R. W., Dower, W. J. Peptides on phage: a vast library of peptides for identifying ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87, 6378-6382 (1990).
  6. Doorbar, J., Winter, G. Isolation of a peptide antagonist to the thrombin receptor using phage display. J. Mol. Biol. 244, 361-369 (1994).
  7. Ellerby, H. M., Arap, W., Ellerby, L. M., Kain, R., Andrusiak, R., Rio, G. D., Krajewski, S., Lombardo, C. R., Rao, R., Ruoslahti, E., Bredesen, D. E., Pasqualini, R. Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides. Nat. Med. 5, 1032-1038 (1999).
  8. Goodson, R. J., Doyle, M. V., Kaufman, S. E., Rosenberg, S. High-affinity urokinase receptor antagonists identified with bacteriophage peptide display. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7129-7133 (1994).
  9. Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. A peptide isolated from phage display libraries is a structural and functional mimic of an RGD-binding site on integrins. J. Cell Biol. 130, 1189-1196 (1995).
  10. Pasqualini, R., Koivunen, E., Ruoslahti, E. Alpha v integrins as receptors for tumor targeting by circulating ligands. Nat. Biotechnol. 15, 542-546 (1997).
  11. Pasqualini, R., Koivunen, E., Kain, R., Lahdenranta, J., Sakamoto, M., Stryhn, A., Ashmun, R. A., Shapiro, L. H., Arap, W., Ruoslahti, E. Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides and a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 60, 722-727 (2000).
  12. Rajotte, D., Arap, W., Hagedorn, M., Koivunen, E., Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Molecular heterogeneity of the vascular endothelium revealed by in vivo phage display. J. Clin. Invest. 102, 430-437 (1998).
  13. Rajotte, D., Ruoslahti, E. Membrane dipeptidase is the receptor for a lung-targeting peptide identified by in vivo phage display. J. Biol. Chem. 274, 11593-11598 (1999).
  14. Wang, B. Isolation of high-affinity peptide antagonists of 14-3-3 proteins by phage display. Biochemistry. 38, 12499-12504 (1999).
  15. Sugahara, K. N., Teesalu, T., Karmali, P. P., Kotamraju, V. R., Agemy, L., Greenwald, D. R., Ruoslahti, E. Coadministration of a tumor-penetrating peptide enhances the efficacy of cancer drugs. Science. 328, 1031-1035 (2010).
  16. Sikes, R. A., Cooper, C. R., Beck, G. L., Pruitt, F., Brown, M. L., Balian, G. Bone Stromal Cells as Therapeutics Targets in Osseous Metastasis. Cancer Growth and Progression. "Integration/Interaction of Oncologic Growth". Meadows, G., Kluwer, K. H. , Academic Publishers. Boston, MA. 369-386 (2005).
  17. Santos, J. L., Pandita, D., Rodrigues, J., Pêgo, A. P., Granja, P. L., Tomás, H., Balian, G. Receptor-Mediated Gene Delivery in Mesenchymal Stem Cells using PAMAM Dendrimers conjugated with Osteotropic Peptides. Molecular Pharmaceutics. , Forthcoming (2010).

Tags

Hücresel Biyoloji Sayı 46 osteogenezisi peptid kemik onarımı anabolik etkisi
Bakteriyofaj Görüntüleme Kütüphane Peptitler Mezenkimal Hücreler Gen ekspresyonunu modüle ve Unicortical Kemik Hastalıkları Osteogenezi potansiyalize
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Balian, G., Beck, G., Madhu, V.,… More

Balian, G., Beck, G., Madhu, V., Sikes, R., Cui, Q., Liang, H., Bush, J. Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects. J. Vis. Exp. (46), e2362, doi:10.3791/2362 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter