פרוטוקול עבור הפקה של הצלב גנטית של טפילי מלריה מכרסמים

Summary

חוצה גנטי של טפילי מלריה מכרסם מבוצעות על ידי האכלה two טפילים שונים גנטית יתושים. הצאצאים רקומביננטי הם משובטים מהדם לאחר עכבר המאפשר יתושים לנשוך עכברים נגועים. סרט הווידאו הזה מראה איך לייצר צלבי הגנטי של

Abstract

וריאציה בתגובה תרופות נגד מלריה ו pathogenicity של טפילי מלריה היא ביולוגיים והחשיבות רפואי. מיפוי הצמדה הוביל זיהוי מוצלח של גנים או לוקוסים הבסיסית תכונות שונות טפילי מלריה של מכרסמים ובני אדם ^{1-3 4-6.} טפיל המלריה Plasmodium yoelii הוא אחד מיני רבים מלריה מבודד מכרסמים אפריקאי פראי הותאם לגדול במעבדות. מין זה מתרבה רבים מן המאפיינים ביולוגית של טפילי מלריה אדם; סמנים גנטיים כגון microsatellite ו מוגבר אורך קטע פולימורפיזם (AFLP) סמנים יש גם פותחו עבור טפיל ^7-9. לכן, מחקרים גנטיים טפילי מלריה מכרסם ניתן לבצע כדי להשלים את המחקר על Plasmodium falciparum. הנה, אנחנו מדגימים את הטכניקות לייצור הכלאה גנטית פ yoelii כי היו הראשונים חלוץ ידי בני הזוג. דוד Walliker, ריצ'רד קרטר, ועמיתיו באוניברסיטה של אדינבורו ^10.

חוצה גנטיים פ yoelii ושאר טפילי מלריה מכרסם נערכים על ידי הדבקה של עכברים מ.א.ס. מאסכאלאס עם inoculum המכיל gametocytes של שני שיבוטים שונים גנטית שונה פנוטיפים של עניין על ידי מתן יתושים להאכיל על עכברים נגועים 4 ימים לאחר ההדבקה. הנוכחות של gametocytes זכר ונקבה בדם העכבר הוא אישר מיקרוסקופית לפני האכלה. בתוך 48 שעות לאחר האכילה, ב midgut של היתוש, gametocytes הפלואידים להתמיין הגמטות, הזכרית והנקבית, להפרות, וליצור זיגוטה דיפלואידי (איור 1). במהלך הפיתוח של הזיגוטה לתוך ookinete, המיוזה נראה להתרחש ^11. אם הזיגוטה נגזר באמצעות הפריה הדדית בין הגמטות של שני טפילים שונים גנטית, חילופי גנטי (reassortment כרומוזומליות ו צולבות בין תורות אי - אחות chromatids של זוג כרומוזומים הומולוגיים;. איור 2) עלולה להתרחש, וכתוצאה מכך רקומבינציה של החומר הגנטי בבית הומולוגיים לוקוסים. הזיגוטה עוברת כל שתי חטיבות הגרעיני רצופים, המוביל four גרעינים הפלואידים. Ookinete נוסף מתפתח oocyst. לאחר oocyst מתבגר, אלפי sporozoites (צאצאיו של הצלב) נוצרות ומשוחרר hemoceal יתושים. Sporozoites נקצרים מן בלוטות הרוק ו מוזרק לארח Murine חדש, שבו פיתוח שלב טרום האריתרוציטים ו האריתרוציטים מתרחש. צורות האריתרוציטים הם משובטים ומסווגים לגבי הדמויות להבחין בקווים ההורים לפני הצמדה מיפוי גנטי. זיהומים בקרה של שיבוטים הורים יחידים מבוצעים בצורה זהה הייצור של צלב גנטית.

Protocol

טכניקות אספטי חייב להיות מיושם על כל החומרים יהיה המנוהלים על בעלי חיים כדי למנוע הכנסת מכוונת של גורמים מזהמים חיצוניים לעכברים שיכול לבלבל את תוצאות הניסוי.

1. זיהום של עכברי מעבדה עם דם בשלב טפילי מלריה

1. בטמפרטורת החדר, להפשיר שני בקבוקונים המכילים בשלב קפוא דם טפילי מלריה להיות חצו. בדוגמה זו, שני זנים טפיל המלריה מכרסם בהם נעשה שימוש הם Plasmodium yoelii yoelii ו nigeriensis Plasmodium yoelii.
2. Fit מזרק עם מחט מד 22-30 (G) להכין 400 μL של סטרילית, התרופות כיתה PBS (pH 7.4).
3. שימוש במזרק זהה, להכין 100 μL של דם נגוע מופשר, להפוך את המזרק למעלה ולמטה עד התוכן מעורבב homogenously. (אופציונאלי: פיפטה ניתן להשתמש כדי להעביר PBS ודם נגוע לתוך צינור איסוף לפני העברת לתוך מזרק להזרקה).
4. להזריק 200 μL של טפיל המכיל פתרון ישירות הצפק של עכבר. בסיום, להשליך את המזרק לפח החדים. (ראה גם חומרים משלימים לתחזוקה של עכברי מעבדה). באופן כללי, בגודל סטנדרטי של inoculum הוא בין μL 100-500, תלוי ברמות של זיהומים טפיל בחומרים קפואים המקורי.
5. להזריק את שני זנים טפיל להיות חצה לשני עכברים כל אחד. עכברים תהפוך חיובית מיקרוסקופית 3 עד 5 ימים לאחר זריקות. כאשר parasitemias להגיע בין 1-5%, המשך לשלב הבא.

2. Clone זיהום מעורב של עכברים

1. לפני זיהום שיבוט מעורבים, לאסוף דם זנב משתי התורמות עכברים נגועים עם זנים שונים של הטפיל בבדיקה מיקרוסקופית של כתמי Giemsa מוכתמת דם דקים (איור 3), למדידת צפיפות תא דם אדום (ראה חומרים משלים עבור נהלים מפורט) .
2. חישוב נפח של תמיסת מלח פיזיולוגית (1.5% w / v dihydrate trisodium ציטרט, 0.85% w / v נתרן כלורי) ודם עכבר הנדרש כדי לייצר תערובת inoculum, באמצעות parasitemia ו כדוריות דם אדומות מדידות צפיפות שהושגו קודם לכן.
3. התאם את הפתרון טפיל לריכוז סופי של 1,000,000 תאים נגועים דם אדומים לכל 100μl.
4. מערבבים את דם נגוע משני תורמים ביחס של 1:1 לקבל inoculum מעורב לשבט. כאשר שני ההורים שיבוטים שונים קצב הצמיחה, להתאים את הפרופורציות של מהיר גידול הורים לשבט איטי בצמיחה הורים 01:02 או 01:05.
5. להזריק 100 μL המדגם מעורב לתוך הצפק של עכבר כל להיות נגועים. (ראה גם צעד 3.9 כדי לקבוע את מספר העכברים להיות מוזרק)
6. באמצעות שיטה זו, להדביק שני עכברים עם כל הזנים ההורים יחיד. יחיד לשבט זיהומים יאפשר קביעת שידור מוצלח של שני זני ההורים.

3. יתושי

1. הכן את שלושת הכלובים המכיל 300-500 הבוגרים (זכרים ונקבות) אנופלס stephensi יתושים כל אחד, בגיל 5-7 ימים שלאחר הופעתה של גלמים. מכולות מכוסים רשת מאובטחת על ידי פלסטיק או מכסה מתכת. שני כלובים הם עבור האכלה על שיבוטים של ההורים; את הכלוב השלישי הוא הכנה של צלב גנטית.
2. החל ארבעה ימים לאחר ההדבקה מעורב המשובט, להכין Giemsa מוכתם זנב דק כתמי דם של עכברים נגועים.
3. בדוק את מריחות במיקרוסקופ על ידי הסריקה לפחות 50 שדות בהגדלה מיקרוסקופית 1000x ולקבוע אם gametocytes זכר ונקבה נוכחים.
4. Gametocytes זכר ונקבה ניכרים בשל נוכחותם של גרגרי vacuole גדול גדול (איור 3). Gametocytes זכר ונקבה יש הציטופלסמה ורוד וכחול, בהתאמה. אם gametocytes קיימים, בצע את שלב 3.6.
5. אם gametocytes נעדרים, לשמור על מעקב יומיומי עד שהם יופיעו. אם gametocytes נוכחים, להמשיך את הצעד הבא.
6. הזרק 50 μL של קוקטייל תרופות הרדמה המכיל 33 מ"ג / מ"ל ​​של קטמין ו - 3 מ"ג / מ"ל ​​של xylazine לתוך הצפק של עכבר להרדים כל עכבר נגועים (לפי 20 גרם משקל גוף העכבר). המינון הסופי של קטמין ו xylazine הוא 82.5 ו - 7.5 מ"ג / ק"ג, בהתאמה.
7. המקום העכברים עם הפנים כלפי מטה על החלק העליון של כלוב ובו יתושים בוגרים אנופלס stephensi כי כבר מורעבים אספקת סוכר במשך 24 שעות ולאפשר היתושים להאכיל במשך 30 דקות ללא הפרעה.
8. שמירה על היתושים insectary בתנאים סטנדרטיים (חום נשמר בין 24-26 מעלות צלזיוס; גם לראות שיטות משלים לצורך תחזוקה של המעבדה יתושים).
9. השתמש באחת עכבר נגוע לכל 50-100 יתושים ממין נקבה. להרדים את העכברים מיד נקע בצוואר הרחם לאחר האכלה בזמן העכברים הם עדיין תחת הרדמה.

4. יתוש הביתור MidgUTS ו שביצים ספירת

1. תשעה ימים לאחר ההאכלה, היתושים תיבחן עבור שביצים ב midgut של חרקים. הנוכחות של שביצים ב היתושים הניזונים יחיד לשבט עכברים נגועים מצביעה על כך gametocytes של שני זני ההורים הם זיהומיות.
2. כדי לנתח midgut יתושים, השתמש aspirator קשור מיכל קטן לאיסוף 5-10 יתושים נגועים מהכלוב.
3. באמצעות גז CO _2, להרדים היתושים ולהעביר אותם לתוך צלחת פטרי מזכוכית על הקרח. הפרד וזורקים יתושים ממין זכר. אנטנות של הזכרים באופן ניכר bushier לעומת הנקבות.
4. מילוי שני מזרקים עם PBS ולהתאים אותם עם מד 26 סנטימטר (G ^½) מחטים. על הפקדה של 100 μL PBS מתוך מזרק לשקופית זכוכית.
5. העברת 5-10 יתושים נקבה הרדים על ירידה של PBS והמקום להחליק על מיקרוסקופ לנתח.
6. שימוש במחטים אותו, להסיר את הכנפיים של כל יתוש והרגליים, ולאחר מכן, מחזיק את הבטן חרקים בבית החזה האחורי, למשוך את הגוף בנפרד עד midgut, גוף לבן דמויי כיס, הוא שוחרר. לנתק את midgut וזורקים את שאר הגוף.
7. הוסף PBS יותר על midgut אם השקופיות יבשים. Midgut יהיה מנוון אם לתת יבשים. מניחים פיסת לכסות על midguts.
8. בדוק את midguts במיקרוסקופ אור בהגדלה 100x. לספור את המספרים של כל שביצים ב midgut (איור 3). שביצים ניכרים בעובי קיר מבנים עגולים הנמצאים על פני השטח החיצוני של midguts.
9. בסיום, להיפטר מזרקים, מחטים, והחלק לפח החדים.
10. אם שביצים נעדרים midguts, להאכיל יתושים עם עכברים נגועים עם מספר גבוה יותר של gametocytes ולתת זמן האכלה יותר. טמפרטורה היא קריטית בשלב זה. ודא את הטמפרטורה מוגדר 24-26 ° C.

5. איסוף Sporozoites מ יתושים על ידי צנטריפוגה

1. הכן צינורות אוסף sporozoite כדלקמן: לחתוך את המכסה של צינור 0.5-מ"ל נקי צנטריפוגות ולהכות חור (קוטר 0.1-0.2 מ"מ) בחלקו התחתון של הצינור באמצעות flamed 19 G מחט.
2. ממלאים 1 / 3 של הצינור עם צמר זכוכית. הכנס את הצינור לתוך צינור מסנן 1.5-מ"ל אוסף (אחד שפופרת מספיקה sporozoites הקציר מ ~ 100 יתושים)
3. על האכלה 17 יום הודעה, לאסוף יתושים (שלב 4) מן הכלובים לתוך מיכל קטן באמצעות aspirator.
4. השתמש גז CO ₂ להרדים יתושים.
5. הפרד את הנקבות מן יתושים ממין זכר. העברת היתושים נקבה הרדים מהקופסה כדי בצלחת פטרי מזכוכית על הקרח.
6. הכן שני מזרקים עם 26 מחטים G ^½ מלא PBS. על הפקדה של 100 μL PBS מתוך מזרק לשקופית זכוכית.
7. העברת היתושים לשקופית מיקרוסקופ. הסר את הראש של היתושים, כנפיים, רגליים, בטן תחת מיקרוסקופ לנתח.
8. באמצעות קנס שקצהו מלקחיים העברת thoraxes לתוך 0.5 מ"ל PBS ב homogenizer 1.5-מ"ל (מכתש ועלי). חנות thoraxes על הקרח (sporozoite נשאר זיהומיות עבור 2-3 שעות).
9. Homogenize thoraxes על הקרח כדי לשחרר sporozoites של בלוטות הרוק (ראה איור 3), ולהעביר את lysates (homogenates) לתוך הצינור מלא צמר זכוכית (שלב 5.1-5.2) באמצעות פיפטה מזכוכית.
10. צנטריפוגה במשך 10 עד 20 שניות ב 1000 סל"ד בטמפרטורת החדר.
11. אסוף את flow-through (ההשעיה sporozoite מטוהרים) באמצעות מזרק עם מחט G 22-30. (אופציונאלי: ירידה 10-50 μL של זרימה דרך בשקופית מיקרוסקופיים, במקום לכסות להחליק לדמיין את sporozoites לחיות תחת מיקרוסקופ אור רגיל, הגדלה 400X, ראה גם איור 3)
12. הזרק מ"ל ip של 0.1-0.5 ההשעיה sporozoite לעכברים (עד 200,000 טפילים ניתן לקצור מן יתוש אחד; לראות נ"צ 12). במקרה המוצלח, החיה יהיה להידבק 72 שעות לאחר ההזרקה.

6. שיבוט צאצאיהם באמצעות דילול מוגבל

1. שבעים ושתיים שעות לאחר זריקות sporozoite, לאסוף דם זנב משתי התורמות עכברים נגועים עם זנים שונים של הטפיל בבדיקה מיקרוסקופית לאחר צביעה Giemsa של כתמי דם דקים למדידת צפיפות תא דם אדום (ראה חומרים משלים עבור נהלים מפורט).
2. פיק עכבר הצגת parasitemia 0.1-1% ותאי דם אדומים נגועים אשר מכילים טפילים חד בעיקר תורם של תהליך השכפול. חזור על שלב 6.1 הימים הבאים אם עכברים הם מיקרוסקופית שלילית. אם בעלי החיים אינם נגועים בתוך 14 ימים, חזור על שלב 2 עד 5 לקבוע את הנוכחות של sporozoites בשלב 5.11).
3. לדלל את הדם זנב שנקטפו בפתרון 01:01 הקר של פתרון Ringer עגל בסרום של היונקים (2.7 mM אשלגן כלוריד, קלציום כלוריד 1.8 מ"מ, 154 נתרן כלוריד mM) כדי להשיג קוןcentration של 0.6 לתא דם נגוע 1 אדום לכל μL 100, ולאחסן את inoculum על הקרח. באופן זה, רוב עכבר הפרט צריך לקבל אחד או אפס טפילים.
4. להזריק לווריד 100 μL של דם נגוע בדילול מלא בכל אחד של 50 עד 100 עכברים.
5. חמישה עד שבעה ימים לאחר מכן, המסך עכברים נוכחות של טפילים על ידי בדיקת דם בשלב Giemsa מוכתם כתמי דם דק. בניסוי מוצלח, 20-50% של העכברים להידבק ו יראה parasitemia של 0.1-5.0% על זיהום 8 יום פוסט.

7. אפיון צאצאיהם באמצעות סמנים גנטיים

1. איסוף 20-40 μL דם זנב עכבר בצינור 1.5-מ"ל microcentrifuge המכיל 0.2 מ"ל של תמיסת מלח פיזיולוגית צונן ציטרט, בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 3000 סל"ד בטמפרטורת החדר כדי גלולה בתאי הדם. תמצית ה-DNA באופן מיידי או לשמור את גלולה ב -80 ° C.
2. הכן את ה-DNA הטפיל באמצעות מיצוי כל השיטות הסטנדרטיות DNA. עבור בידוד המהירה של ה-DNA, יש להשתמש גבוהה טהור הכנה PCR תבנית Kit (Roche Applied Bioscience).
3. הצאצאים רקומביננטי מזוהים לאחר genotyping באמצעות microsatellite (MS) או פולימורפיזם של נוקלאוטיד יחיד (SNP) על כרומוזומים שונים שיכולים להבחין בין שני זני ההורים הצלב גנטית. שיטה פשוטה באמצעות primers ניאון שכותרתו יחיד עבור MS genotyping של פ yoelii ניתן להשתמש (ראו נ"צ 8,9).

8. Cryopreservation של דם בשלב טפילי מלריה

1. איסוף 0.5-1 מ"ל של דם נגוע לנקב לב מהעכבר הרדים עם parasitemia של 5-20% ב 5-10 מ"ל מקורר תמיסת מלח פיזיולוגית.
2. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 2000 סל"ד בטמפרטורת החדר. בטל supernatant.
3. הוסף ירידה מבחינת נפח 2x של פתרון 57 Glycerolyte (Fenwal Laboratories) על גבי כדוריות הדם ומערבבים היטב.
4. מעבירים את ההשעיה על cryotubes (0.2-0.5 מ"ל לכל צינור).
5. חנות דם cryopreserved ב -80 ° C (עד חודש 1) או חנקן נוזלי.

9. נציג תוצאות:

בניסוי מוצלח, 5-10% של קווי משובטים יהיו צאצאים רקומביננטי עצמאית.

באיור 1. ייצוג סכמטי של מחזור החיים ואירועים רקומבינציה גנטית במהלך לחצות גנטי. אירועי רקומבינציה גנטית להתרחש בשלב מוקדם של התפתחות היתוש. לאחר הפריה של גמטות "הפלואידים" זכר ונקבה של רקע גנטי שונה midgut של היתוש, zygotes "דיפלואידי" נוצרים. הזיגוטה מהווה שלב דיפלואידי רק מחזור החיים של טפיל; המיוזה כדלקמן בתוך 12 שעות של הפריה, וכל בשלבים הבאים של היתוש ויונקים להישאר הפלואידים. Zygotes כתוצאה להתפתח ookinetes ו שביצים. צמיחה וחלוקת mitotic של oocyst כל מייצרת אלפי sporozoites, אשר מתפזרות hemoceal "יתושים. אלה sporozoites כי להגר בלוטות הרוק נמצאים בעמדה להיות משודר לארח יונקים, שם התפתחות של הכבד, אדום דם תאים בשלבים מתרחשת. במהלך המחזורים תא דם אדום, טפילים מסוימים יכולים להתמיין gametocytes זכר ונקבה בוגרת. מחזור החיים של הטפיל יושלם כאשר אלה gametocytes נתפסות על ידי שידור אחר יתושים, להנציח.

איור 2. ירושה של גנים גרעיניים טפילי מלריה וייצור של הצאצאים רקומביננטי. רקומבינציה גנטית ניתן להפיק באמצעות reassortment כרומוזומליות או על ידי אירועים מוצלב. הצאצאים הומוזיגוטים המיוצר על ידי selfing בין הגמטות של ההורים לשבט אותו 1 או 2 (A ו-D), בהתאמה. ב) הצאצאים הטרוזיגוטיים המיוצר על ידי הפריה הדדית בין הגמטות של שני ההורים שיבוטים שונים, גרעינים רקומביננטי (אליפסות כחול) שהוא נוצר על ידי reassortment כרומוזומליות בלבד. ג) הצאצאים הטרוזיגוטיים המופק הפריה הדדית בין הגמטות של שני ההורים שיבוטים שונים, גרעינים רקומביננטי (אליפסות אדום) מתהווה על ידי crossovers בין אי - אחות chromatids של כרומוזומים הומולוגיים.

איור 3. מורפולוגיה של טפיל המלריה מכרסם Plasmodium yoelii. א) שלב טבעת, B) trophozoite, C) schizont, ד) merozoites, E) gametocyte זכר בוגר, F) gametocyte זכר בוגר, G) gametocyte נקבה בוגרת, H) gametocyte נקבה בוגרת, אני) midgut עם שביצים על מוצב ביום 10 האכלה (שביצים בוגרת מסומנים על ידי חצים; 200x הגדלה), J) בלוטות הרוק יתוש (בהגדלה 100x), K) sporozoites (400x הגדלה).

Discussion

אנו מדגימים את הטכניקות לייצור צלב גנטי המלריה Plasmodium מכרסם yoelii, שגם הוא החלים על ייצור של צלבים גנטי malarias מכרסמים אחרים. זיהומים של עכברים עם שיבוטים אחד ההורים מבוצעים בדרך כלל כדי לקבוע שידור מוצלח של טפילים ההורים על מנת להבטיח כי ההורים הם המוסמכים בייצור הגמטות פונקציונלי לפני ביצוע צלב.

שידור מוצלח באמצעות יתוש מושפע מגורמים רבים, כולל טמפרטורה של insectary, מינים של מלריה טפילים מכרסם בשימוש, את המינון של טפיל דם הבמה (גודל inoculum). בזמן שידור של פ berghei מושגת בדרך כלל על 19-21 ° C ^13, שידור P. yoelii ו פ chabaudi מבוצע באופן שגרתי על 23-25 ​​° C ^14. Ookinetes של פ berghei מצליחים להתפתח שביצים בטמפרטורות נמוכות מ -16 ° C או גבוהה יותר מאשר 24 ° C ^15. בנוסף לטמפרטורה, גודל inoculum יכולים להשפיע על קצב הכפלה של טפילי מלריה בדם. למרות זריקות בגודל inoculum גדול (5 x 10 ⁶ iRBC או יותר) יניבו parasitemia גבוה בשלבים מוקדמים מאוד של זיהום, זה לא בהכרח מספרים גדולים יותר של gametocytes או infectivity גבוה יותר יתושים. Gadsby ואחרים (2009) הראה כי ¹⁶ gametocytes של פ chabaudi adami נמצאים בדם 3 מיום ליום 20 (שיא ביום 13) זיהום פוסט של 1 x 10 ⁶ iRBC, אולם 6 יום זיהום פוסט הוא רק יום שעליו יתושים להידבק. כמו כן, הממשל בגודל inoculum גדול של זנים טפיל בצמיחה מהירה ארסית כמו שיבוטים N67 (nigeriensis), 17XL, ואת י"מ של פ yoelii, לשבט אנקה של פ berghei ו DS שיבוט של פ chabaudi adami לעתים קרובות תוצאות אנמיה חמורה והפתולוגיה בעכברים, אשר יכול לגרום לירידה משמעותית של חום הגוף העכבר. כתוצאה מכך, עכברים להפוך מזהם פחות יתושים (תצפיות לא פורסם). עם זאת, העברת טפילי מלריה מכרסם התנהל עם גודל inoculum סטנדרטי (10 iRBC ^6). זה נמצא כי berghei פ ו פ yoelii הם העברה כדי יתושים מ 3-5 ימים לאחר ההדבקה דם בשלב המושרה בעכברים ^17, ואילו פ 'chabaudi chabaudi ו פ chabaudi adami הם העברה רק יתושים ביום 6 אחרי שלב הנגרמת זיהומים בדם ^{16 עכברים, 18.}

הגורמים המשפיעים על הייצור של הצאצאים רקומביננטי כוללים את הפרופורציות של gametocytes של שני זני ההורים בעכברים. בתיאוריה, הייצור המקסימלי של הצאצאים רקומביננטי מתרחשת כאשר gametocytes משני המינים של שיבוטים ההורים נמצאים מספר שווה עצמית הפריה הפריה להתרחש באותו התדר. תחת תנאי זה, ממחצית zygotes שיתקבלו יהיו היברידיות והשאר יכלול בשיעורים שווים של שני הקווים לשבט ההורים. הפקה של שיבוטים הצאצאים רקומביננטי תהיה פחותה בהרבה, כאשר חלקם של gametocytes מוטה כלפי שיבוט one ההורית, המוביל פרופורציונלי הפריה עצמית. יתר על כן, לעתים קרובות יש טפילים שיעורי צמיחה שונים ייתכן יכולת שונה בייצור gametocytes ^{16, 19.} לכן, יש צורך לייעל את הפרופורציות של טפילים ההורים בתערובת להיות מוזרק לתוך עכברים להאכלה יתושים.

בפעם לשבט טפילים מן הדם לאחר האכלה יתוש הוא גם גורם חשוב לשקול. עדיף לשבט צאצאיו של הצלב גנטי כאשר parasitemia הוא בין 0.1-1.0% (לפני מחזורים רבים מדי של שכפול בדם), כדי למנוע שיבוט שיבוטים כפולות. טפילים מהיר או איטי בצמיחה עשויה לצאת במספרים גדולים בתקופות מסוימות של זמן, שיבוט על הפסגות של טפילים מהיר או איטי גדל בסופו של דבר עם שיבוטים בעל פנוטיפים זהה.

לסיכום, ביצוע חוצה גנטי באמצעות מלריה טפילים מכרסם היא יחסית קלה הרבה יותר זול מאשר ביצוע לחצות הגנטי של טפיל המלריה האנושי פ falciparum, המחייב זיהום של פרימטים לא אנושיים. רקומביננטי הצאצאים של חוצה גנטית הם כלי שימושי לבניית מפות הצמדה גנטיים מיפוי של תכונות מלריה חשוב כולל פיתוח טפיל, עמידות לתרופה, ועל ארסיות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glyerolyte 57 solution	Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus	Charles River Laboratories		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum	Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution	Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit	Roche Group	11 796 828 001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine	Akorn Inc	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool	VWR international	32848-003
Glass capillary (1 μL)	VWR international	53440-001
Hemocytometer	VWR international	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer	VWR international	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL
SUPPLEMENTARY MATERIALS: Maintenance of laboratory mice Maintenance of laboratory mosquit–s Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Measurement of red blood cell density Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquit–s Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.