Protocolo para la producción de un cruce genético de los parásitos de la malaria de roedores

Summary

Cruces genéticos de los parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo por la alimentación de dos parásitos genéticamente distintos a los mosquitos. Recombinante progenie clonada a partir de la sangre del ratón después de permitir que los mosquitos que pican ratones infectados. Este vídeo muestra cómo se producen los cruces genéticos de

Abstract

Variación en la respuesta a los medicamentos antimaláricos y en la patogenicidad de los parásitos de la malaria es de importancia biológica y médica. Mapas de los vínculos ha llevado a la identificación exitosa de los genes o loci subyacente varios rasgos en los parásitos del paludismo de los roedores y los humanos ^{1-3 4-6.} El parásito de la malaria Plasmodium yoelii es una de las especies de malaria muchos aislado de roedores silvestres de África y ha sido adaptado para crecer en el laboratorio. Esta especie se reproduce muchas de las características biológicas de los parásitos del paludismo humano; marcadores genéticos como los microsatélites y marcadores de fragmentos amplificados polimorfismo en la longitud (AFLP) también se han desarrollado para el parásito de ^7-9. Así, los estudios genéticos de los parásitos del paludismo de roedores se pueden realizar para complementar la investigación sobre el Plasmodium falciparum. En este sentido, demostrar las técnicas para la producción de un cruce genético de P. yoelii que fueron los primeros por primera vez por los Dres. David Walliker, Richard Carter, y sus colegas de la Universidad de Edimburgo ^10.

Cruces genéticos de P. yoelii y otros parásitos de la malaria de roedores se llevan a cabo mediante la infección de ratones Mus musculus con un inóculo que contiene gametocitos de dos clones genéticamente distintas que se diferencian en fenotipos de interés y permitiendo que los mosquitos que se alimentan de los ratones infectados cuatro días después de la infección. La presencia de gametocitos masculinos y femeninos en la sangre del ratón es microscópicamente confirmados antes de alimentar. Dentro de las 48 horas después de comer, en el intestino medio del mosquito, los gametocitos haploides se diferencian en gametos masculinos y femeninos, fertilizar, y forma un cigoto diploide (Fig. 1). Durante el desarrollo de un cigoto en un oocineto, meiosis parece ocurrir ^11. Si el cigoto se deriva a través de la fertilización cruzada entre los gametos de los dos parásitos genéticamente distintos, los intercambios genéticos (recombinación cromosómica y cross-overs entre las cromátidas no hermanas de un par de cromosomas homólogos;. Fig. 2) puede ocurrir, resultando en la recombinación de material genético en loci homólogos. Cigoto experimenta dos divisiones nucleares sucesivas, dando lugar a cuatro núcleos haploides. Un oocineto más se convierte en un ooquiste. Una vez que el ooquiste madura, miles de esporozoitos (la descendencia de la cruz) se forman y se liberan en hemoceal mosquito. Esporozoitos se cosechan a partir de las glándulas salivales y se inyecta en un nuevo huésped murino, donde el desarrollo de la etapa pre-eritrocítica y eritrocítica se lleva a cabo. Formas eritrocíticas se clonan y se clasifican con respecto a los caracteres distintivos de las líneas parentales antes de mapeo de ligamiento genético. Control de las infecciones de los distintos clones de los padres se llevan a cabo en la misma forma que la producción de un cruce genético.

Protocol

Técnicas de asepsia deben ser aplicadas a todos los materiales que serán administrados a los animales para evitar la introducción accidental de agentes infecciosos exógenos en los ratones que se pueden confundir los resultados experimentales.

1. La infección de ratones de laboratorio con parásitos de la malaria el estadio en sangre

1. A temperatura ambiente, descongelar dos viales que contienen la sangre congelada parásitos de la malaria etapa que se cruzaron. En este ejemplo, dos cepas de roedores parásito de la malaria utiliza son el Plasmodium yoelii yoelii y nigeriensis Plasmodium yoelii.
2. Adaptarse a una jeringa con un calibre 22-30 (G) la aguja y elaborar 400 l de agua estéril, farmacéutica grado PBS (pH 7,4).
3. Utilizando la misma jeringa, elaborar 100 L de la sangre infectada descongelado; invierta la jeringa hacia arriba y abajo hasta que el contenido es homogéneamente mezclado. (Opcional: una pipeta se puede utilizar para la transferencia de PBS y la sangre infectada en un tubo de recogida antes de transferir a una jeringa para inyección).
4. Inyectar 200 uL de parásito que contiene la solución directamente en el peritoneo de un ratón. Cuando termine, deseche la jeringa en un contenedor de objetos punzantes. (Véase también materiales complementarios para el mantenimiento de los ratones de laboratorio). En general, el tamaño estándar de la inoculación es de entre 100 a 500 l, en función de los niveles de infecciones del parásito en los materiales congelados original.
5. Inyectar las dos cepas de parásitos que se cruzaron en dos ratones cada uno. Los ratones se convertirá en positivo microscópicamente 3 a 5 días después de las inyecciones. Al llegar a parasitemias entre 1-5%, continúe con el siguiente paso.

2. Infección mixta de clonar ratones

1. Antes de la infección clon mixto, recoger la sangre de la cola de los dos ratones donantes infectados con cepas de parásitos diferentes para el examen microscópico de frotis teñidos con Giemsa diluir la sangre (Fig. 3), y para la medición de la densidad de glóbulos rojos (ver material complementario para los procedimientos detallados) .
2. Calcular el volumen de una solución salina fisiológica (1,5% w / v de citrato trisódico dihidrato, 0.85% w / v de cloruro de sodio) y la sangre de ratón para producir una mezcla de inóculo, utilizando la parasitemia y el rojo las mediciones de densidad de células sanguíneas obtenidas anteriormente.
3. Ajustar la solución de los parásitos a una concentración final de un millón de células rojas de la sangre infectada por 100μl.
4. Combine la sangre infectada de los dos donantes en una proporción de 1:1 para obtener un inóculo mixto clon. Cuando los dos clones parentales difieren en la tasa de crecimiento, ajustar las proporciones de una. De más rápido crecimiento de los padres a un clon de crecimiento más lento de los padres a 01:02 o 01:05
5. Inyectar 100 l de la muestra mezclada en el peritoneo de los ratones de la infección. (Véase también el paso 3.9 para determinar el número de ratones que se inyecta)
6. Usando este método, infectar a dos ratones cada uno con las cepas parentales individuales. Las infecciones de un solo clon permitirá la determinación de la transmisión con éxito de las dos cepas parentales.

3. Los mosquitos de alimentación

1. Prepare tres cajas que contienen 300 a 500 adultos (hombres y mujeres) los mosquitos Anopheles stephensi cada uno, edad 5-7 días después de la aparición de pupas. Los contenedores están cubiertos con una red segura por un plástico o una tapa de metal. Dos jaulas para alimentarse de clones parentales, la tercera jaula es para la preparación de un cruce genético.
2. A partir cuatro días después de la infección mixta-clone, preparar Giemsa frotis finos de sangre de la cola de los ratones infectados.
3. Examinar los frotis en el microscopio de barrido por lo menos 50 campos microscópicos con un aumento de 1000x y determinar si gametocitos masculinos y femeninos están presentes.
4. Gametocitos masculinos y femeninos son reconocibles por la presencia de grandes gránulos y grandes vacuolas (Fig. 3). Gametocitos masculinos y femeninos tienen un citoplasma de color rosa y azul, respectivamente. Si gametocitos presentes, siga el Paso 3.6.
5. Si gametocitos están ausentes, mantener la vigilancia diaria hasta que aparezcan. Si gametocitos presentes, continuar con el siguiente paso.
6. Inyectar 50 L de cóctel de fármacos anestésicos que contienen 33 mg / ml de ketamina y de 3 mg / ml de xilazina en el peritoneo de un ratón para anestesiar a cada ratón infectado (por cada 20 gramos de peso corporal del ratón). Última dosis de ketamina y xilazina es de 82.5 y 7.5 mg / Kg, respectivamente.
7. Coloque el ratón boca abajo en la parte superior de una jaula que contenía un adulto mosquitos Anopheles stephensi que han sido privadas de abastecimiento de azúcar de 24 horas y permitir a los mosquitos para alimentarse durante 30 minutos sin interrupción.
8. Mantener a los mosquitos en un insectario en condiciones normales (temperatura se mantiene entre 24-26 ° C; ver también métodos complementarios para el mantenimiento del laboratorio de los mosquitos).
9. Utilice un ratón infectado por cada 50 a 100 hembras de los mosquitos. La eutanasia a los ratones por dislocación cervical inmediatamente después de la alimentación, mientras que los ratones están todavía bajo la anestesia.

4. Mosquito disección Midguts y ooquistes Contando

1. Nueve días después de la alimentación, los mosquitos se examinarán de ooquistes en el intestino del insecto. La presencia de ooquistes en los mosquitos que se alimentan de un solo clon de ratones infectados indica que los gametocitos de las dos cepas parentales son infecciosos.
2. Para la disección de un intestino medio del mosquito, use un aspirador conectado a un pequeño recipiente para recoger 5 a 10 mosquitos infectados de la jaula.
3. Utilizando el gas CO _2, anestesiar a los mosquitos y transferirlos a un plato de Petri de vidrio en el hielo. Separados y desechar los mosquitos machos. Las antenas de los machos son notablemente más tupidas, en comparación con las hembras.
4. Llenar dos jeringas con PBS y en forma con calibre 26 de media pulgada (G ^½) agujas. Depósito de 100 l de PBS a partir de una jeringa en un portaobjetos de vidrio.
5. La transferencia de 5 a 10 hembras de los mosquitos anestesiado sobre la gota de PBS y colocar la placa en un microscopio de disección.
6. Utilizando las mismas agujas, quitar las alas cada mosquito y las piernas, luego, manteniendo al insecto en el abdomen, tórax y posterior, retire el cuerpo de otro hasta el intestino medio, de color blanco en forma de saco del cuerpo, se libera. Separar el intestino medio y desechar el resto del cuerpo.
7. Añadir más PBS en el intestino medio, si las diapositivas se seca. El intestino medio se degeneran si deja secos. Coloque un cubreobjetos sobre el intestino medio.
8. Examinar el intestino medio con un microscopio óptico con un aumento de 100x. Cuente el número de ooquistes en cada intestino medio (Fig. 3). Ooquistes son reconocibles como de pared gruesa estructuras circulares que se encuentran en la superficie externa de la midguts.
9. Cuando haya terminado, disponer de jeringas, agujas, y se deslizan en un recipiente de objetos punzantes.
10. Si los ooquistes están ausentes en el intestino medio, los mosquitos se alimentan con ratones infectados con el mayor número de gametocitos y dar más tiempo de alimentación. La temperatura es crítica para este paso. Asegúrese de que la temperatura se ha fijado en 24 a 26 ° C.

5. Recogida de esporozoítos de los mosquitos por centrifugación

1. Prepare los tubos de recogida de esporozoito de la siguiente manera: cortar la tapa de un tubo de centrífuga limpio de 0.5 ml y un agujero (0.1-0.2 mm de diámetro) en la parte inferior del tubo con una aguja de 19 G flameado.
2. Llene 1 / 3 del tubo con lana de vidrio. Introduzca el tubo de filtro en un tubo de recogida de 1,5 ml (un tubo es suficiente para la cosecha de esporozoitos ~ 100 mosquitos)
3. Sobre la alimentación después de 17 días, recoger los mosquitos (paso 4) de las jaulas en un recipiente pequeño con un aspirador.
4. El uso de CO ₂ del gas para anestesiar a los mosquitos.
5. Separados de las hembras de los mosquitos machos. La transferencia de los mosquitos hembras anestesiados desde el contenedor a un plato de Petri de vidrio en el hielo.
6. Preparar dos jeringas con agujas de 26 G ^½ lleno de PBS. Depósito de 100 l de PBS a partir de una jeringa en un portaobjetos de vidrio.
7. La transferencia de los mosquitos en un portaobjetos de microscopio. Quitar la cabeza de los mosquitos, las alas, piernas y abdomen, debajo de un microscopio de disección.
8. Utilizando unas pinzas de punta fina transferir el tórax en 0,5 ml de PBS en un homogeneizador de 1,5 mL (mortero). Guarde el tórax en el hielo (esporozoito permanece infectante durante 2-3 h).
9. Homogeneizar el tórax en el hielo para liberar esporozoitos de las glándulas salivales (ver Figura 3), y la transferencia de los lisados ​​(homogeneizados) en el tubo lleno de lana de vidrio (Paso 5.1 a 5.2) usando una pipeta de vidrio.
10. Centrífuga de 10 a 20 segundos a 1000 rpm a temperatura ambiente.
11. Recoger el flujo a través de (la suspensión de esporozoito purificado) con una jeringa con una aguja de 22-30 G. (Opcional: caída de 10 a 50 L de la corriente a través de una lámina de microscopio, coloque una hoja de cubierta y visualizar los esporozoitos vivir bajo un microscopio óptico estándar, 400X ampliación, véase también la Fig. 3)
12. Inyectar ip 0,1-0,5 ml de la suspensión de esporozoitos en ratones (hasta 200.000 parásitos pueden ser cosechados de un mosquito, ver ref 12). En un caso de éxito, el animal se infectan 72 horas después de una inyección.

6. La clonación de progenie con dilución limitada

1. Setenta y dos horas después de las inyecciones de esporozoito, recoger la sangre de la cola de los dos ratones donantes infectados con cepas de parásitos diferentes para el examen microscópico después de la tinción de Giemsa de frotis de sangre delgado y para la medición de la densidad de glóbulos rojos (ver material complementario para los procedimientos detallados).
2. Elija un ratón mostrando una parasitemia 0,1 a 1% y cuyas células rojas de la sangre infectada contener parásitos en su mayoría solo como donante para el proceso de clonación. Repita el paso 6.1 próximos días si los ratones son microscópicamente negativos. Si los animales no están infectados dentro de 14 días, repita los pasos 2 a 5 y determinar la presencia de esporozoitos en el paso 5.11).
3. Diluir la sangre recogida en la cola de un resfriado 01:01 solución de Ringer suero de ternera y de mamíferos (2,7 mM de cloruro de potasio, cloruro de calcio 1,8 mM, 154 mM de cloruro de sodio) con el fin de alcanzar una estafaconcentración de 0,6 a 1 célula infectada rojas de la sangre por cada 100 l, y almacenar el inóculo en el hielo. De esta manera, la mayoría de los mouse persona debe recibir uno o cero parásitos.
4. Por vía intravenosa se inyectan 100 l de sangre diluida infectados en cada uno de 50 a 100 ratones.
5. De cinco a siete días más tarde, la pantalla de los ratones de la presencia de parásitos en el estadio de sangre mediante el examen de Giemsa frotis finos de sangre. En un experimento exitoso, el 20-50% de los ratones infectados y se mostrará la parasitemia de 0.1-5.0% después de la infección en el día 8.

7. Caracterización de la progenie con marcadores genéticos

1. Recoge 20 a 40 l de sangre del ratón de cola en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 0,2 ml de solución salina fisiológica fría citrato, agitar brevemente y centrifugar durante 3 minutos a 3000 rpm a temperatura ambiente para que sedimenten las células de la sangre. Extraer el ADN de inmediato o guardar el pellet a -80 ° C.
2. Prepare el ADN del parásito utilizando cualquier método de extracción de ADN estándar. Para el aislamiento rápido de ADN, utilizar un High Pure PCR plantilla de la preparación del kit (Roche Applied Bioscience).
3. Recombinante progenie son identificados después de genotipado con microsatélites (MS) o polimorfismo de nucleótido único (SNP) en diferentes cromosomas que se pueden diferenciar las dos cepas de los padres de la cruz genética. Un método simplificado con una sola primers marcadas con fluorescencia para MS genotipo de P. yoelii se puede utilizar (ver ref 8,9).

8. Criopreservación de parásitos de la malaria el estadio en sangre

1. Recoger 0,5-1 ml de sangre infectada por punción cardiaca a partir de un ratón anestesiado con parasitemia de 20.5% en 5-10 ml de suero fisiológico frío.
2. Centrifugar durante 5 min a 2000 rpm a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante.
3. Añadir gota a gota, el volumen de 2x 57 Glycerolyte solución (Fenwal Laboratories), en pellets de sangre y se mezcla bien.
4. Transferir la suspensión a criotubos (0,2-0,5 ml por tubo).
5. Almacenar la sangre criopreservados a -80 ° C (hasta 1 mes) o en nitrógeno líquido.

9. Los resultados representativos:

En un experimento exitoso, el 5-10% de las líneas de clonado será descendencia recombinante independiente.

Figura 1. Representación esquemática del ciclo de vida y los eventos de recombinación genética en un cruce genético. Eventos de recombinación genética llevará a cabo durante la fase inicial de desarrollo en el mosquito. Después de la fertilización de "haploide" gametos masculinos y femeninos de diferentes bases genéticas en el intestino medio del mosquito, "diploide" cigotos se forman. El cigoto constituye la etapa diploide sólo del ciclo vital del parásito, la meiosis se produce dentro de 12 horas de la fertilización, y todas las fases posteriores en el mosquito y los mamíferos permanecen haploides. Los cigotos resultantes se convierten en ookinetes y ooquistes. El crecimiento y la división mitótica de cada ooquiste produce miles de esporozoitos, que son liberados en hemoceal mosquitos. Los esporozoitos que migran a las glándulas salivales se encuentran en condiciones de ser transmitido a un huésped mamífero, donde el desarrollo del hígado y el rojo las etapas de células sanguíneas se lleva a cabo. Durante el curso de los ciclos de los glóbulos rojos, algunos parásitos pueden diferenciarse en madurar gametocitos masculinos y femeninos. El ciclo vital del parásito se completa cuando estos gametocitos son tomadas por otro mosquito, perpetuando la transmisión.

Figura 2. Herencia de genes nucleares de parásitos de la malaria y la producción de progenie recombinante. Recombinación genética se pueden generar a través de recombinación cromosómica o por eventos de cruce. Progenie homocigótica producida por autofecundación entre gametos de un mismo clon parental 1 o 2 (A y D), respectivamente. B) progenie heterocigota producida por la interacción entre los gametos de los dos clones distintos de los padres, los núcleos recombinante (óvalos azules) está formado por recombinación cromosómica solo. C) descendencia heterocigota produce a partir de la fertilización cruzada entre los gametos de los dos clones de padres diferentes, los núcleos recombinante (óvalos de color rojo) se forma por cruces entre las cromátidas no hermanas de los cromosomas homólogos.

Figura 3. Morfología del roedor parásito de la malaria Plasmodium yoelii. A) Fase de anillo, B) trofozoíto, C) esquizonte, D) merozoitos, E) gametocitos machos inmaduros, F) gametocitos varón maduro, G) gametocitos hembra inmadura, H) gametocitos hembra madura, I) del intestino medio con ooquistes en el día 10 después de alimentación (ooquistes maduros indicado por las flechas; 200x aumentos), J) las glándulas salivales del mosquito (100x), K) esporozoitos (400x aumentos).

Discussion

Nos demuestran las técnicas para la producción de un cruce genético de los roedores malaria Plasmodium yoelii, que también es aplicable a la producción de cruces genéticos en malarias roedores. Infecciones de los ratones con un solo clones parentales usualmente se realizan para determinar la transmisión correcta de los parásitos de los padres para asegurarse de que los padres son competentes en la producción de gametos funcionales antes de realizar una cruz.

Transmisión con éxito a través de un mosquito está influenciada por múltiples factores, incluyendo la temperatura del insectario, las especies de parásitos de la malaria de roedores utilizadas, y las dosis de parásito de la sangre-fase (tamaño del inóculo). Mientras que la transmisión de P. berghei se logra normalmente a 19-21 ° C ^13, la transmisión de P. yoelii y chabaudi P. se realiza rutinariamente a 23-25 ​​° C ^14. Ookinetes de P. berghei no se desarrollan en los ooquistes a temperaturas inferiores a 16 ° C o superior a 24 ° C ^15. Además de la temperatura, el tamaño del inóculo pueden influir en la tasa de multiplicación de los parásitos de la malaria en la sangre. A pesar de las inyecciones de un gran tamaño del inóculo (5 x 10 ⁶ iRBC o más) dará mayor parasitemia en etapas muy tempranas de la infección, no conduce necesariamente a un mayor número de gametocitos o mayor infectividad a los mosquitos. Gadsby y otros (2009) ¹⁶ demostró que los gametocitos de P. chabaudi adami están presentes en la sangre desde el día 3 al día 20 (máximo en el día 13) después de la infección de 1 x 10 ⁶ iRBC, sin embargo, el día 6 después de la infección es la única día en que los mosquitos se infectan. Además, la administración de un gran tamaño del inóculo de las cepas de parásitos de crecimiento rápido y virulento como clones N67 (nigeriensis), 17XL, y YM de P. yoelii, ANKA clon de P. berghei, y DS clon de P. chabaudi adami a menudo da lugar a anemia severa y la patología en los ratones, lo que puede provocar una caída significativa de la temperatura del cuerpo del ratón. Como resultado, los ratones son menos infecciosos para los mosquitos (observaciones no publicadas). Sin embargo, la transmisión de parásitos de la malaria de roedores se ha realizado con un tamaño estándar de inóculo (10 ⁶ iRBC). Se ha encontrado que P. berghei y P. yoelii son transmisibles a los mosquitos de 3 a 5 días después de la etapa de la sangre inducida por la infección en ratones ^17, mientras que P. y P. chabaudi chabaudi chabaudi adami sólo son transmisibles a los mosquitos en el día 6 después de la sangre inducidos fase-infecciones en ratones ^{16, 18.}

Los factores que influyen en la producción de progenie recombinante son las proporciones de los gametocitos de las dos cepas de los padres en los ratones. En teoría, la máxima producción de progenie recombinante se produce cuando los gametocitos de ambos sexos de los clones de los padres se encuentran en igual número y la auto-fecundación y fertilización cruzada se producen en la misma frecuencia. Bajo esta condición, la mitad de los cigotos resultantes serán híbridos, y el resto consistirá en proporciones iguales de las dos líneas de clones parentales. La producción de clones progenie recombinante se reduce considerablemente cuando la proporción de gametocitos se inclina hacia un clon de los padres, lo que desproporcionadamente la autofecundación. Por otra parte, los parásitos a menudo tienen diferentes tasas de crecimiento y pueden tener diferentes capacidades en la producción de gametocitos ^{16, 19.} Por lo tanto, es necesario optimizar las proporciones de los parásitos de los padres en la mezcla que se inyecta en los ratones para la alimentación de los mosquitos.

La hora de clonar a los parásitos de la sangre después de comer los mosquitos es también un factor importante a considerar. Es preferible para clonar la progenie del cruce genético cuando la parasitemia es entre 0,1 a 1,0% (antes de muchos ciclos de replicación en la sangre) para evitar la clonación de clones duplicado. Parásitos rápido o de crecimiento lento puede llegar en gran número en ciertos períodos de tiempo, y la clonación en los picos de los parásitos de rápido o lento crecimiento va a terminar con clones que tienen los mismos fenotipos.

En conclusión, la realización de cruces genéticos con los parásitos de roedores malaria es relativamente fácil y más barato que realizar un cruce genético del parásito del paludismo humano p. falciparum, que requiere la infección de un primate no humano. Recombinante progenie de los cruces genéticos son herramientas útiles para la construcción de mapas de ligamiento genético y para la asignación de importantes rasgos de la malaria, incluyendo el desarrollo del parásito, resistencia a los medicamentos, y la virulencia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glyerolyte 57 solution	Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus	Charles River Laboratories		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum	Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution	Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit	Roche Group	11 796 828 001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine	Akorn Inc	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool	VWR international	32848-003
Glass capillary (1 μL)	VWR international	53440-001
Hemocytometer	VWR international	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer	VWR international	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL
SUPPLEMENTARY MATERIALS: Maintenance of laboratory mice Maintenance of laboratory mosquit–s Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Measurement of red blood cell density Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquit–s Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.