Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

doi: 10.3791/2365 Published: January 3, 2011

Summary

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen van

Abstract

Variatie in reactie op antimalariamiddelen en pathogeniteit van malariaparasieten is van biologische en medische belang. Koppeling in kaart brengen heeft geleid tot succesvolle identificatie van de genen of loci die ten grondslag liggen verschillende eigenschappen in malariaparasieten van knaagdieren 1-3 en mensen 4-6. De malariaparasiet Plasmodium yoelii is een van de vele soorten malaria geïsoleerd van wilde Afrikaanse knaagdieren en is aangepast om te groeien in laboratoria. Deze soort reproduceert veel van de biologische kenmerken van de menselijke malariaparasieten, genetische merkers zoals microsatellieten en versterkt fragment lengte polymorfisme (AFLP) markers zijn ook ontwikkeld voor de parasiet 7-9. Zo kunnen genetische studies in knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd om het onderzoek naar Plasmodium falciparum te vullen. Hier tonen we de technieken voor het produceren van een genetische kruis in P. yoelii die voor het eerst werden ontwikkeld door Drs. David Walliker, Richard Carter, en collega's aan de universiteit van Edinburgh 10.

Genetische kruizen in P. yoelii en andere knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het infecteren van muizen Mus musculus met een inoculum met gametocyten van twee genetisch verschillende klonen die verschillen in fenotypen van belang en door muggen te voeden op de geïnfecteerde muizen 4 dagen na infectie. De aanwezigheid van mannelijke en vrouwelijke gametocyten in de muis bloed is microscopisch bevestigd voor het voeden. Binnen 48 uur na de voeding, in de middendarm van de mug, de haploïde gametocyten differentiëren in mannelijke en vrouwelijke gameten, bemesten, en vormen een diploïde zygote (afb. 1). Tijdens de ontwikkeling van een zygote in een ookinete, meiose lijkt voor te komen 11. Als de zygote is afgeleid door middel van kruisbestuiving tussen gameten van de twee genetisch verschillende parasieten, genetische uitwisseling van (chromosomale herschikking en cross-overs tussen de niet-zuster chromatiden van een paar homologe chromosomen;. Fig. 2) kan optreden, wat resulteert in recombinatie van genetisch materiaal op homologe loci. Elke zygote ondergaat twee opeenvolgende nucleaire divisies, wat leidt tot vier haploïde kernen. Een ookinete ontwikkelt zich verder in een oocysten. Zodra de oocysten rijpt, zijn duizenden sporozoieten (de nakomelingen van het kruis) gevormd en komen vrij in de mug hemoceal. Sporozoieten worden geoogst uit de speekselklieren en geïnjecteerd in een nieuwe muis host, waar de pre-erytrocytaire en erytrocytaire fase van ontwikkeling plaatsvindt. Erytrocytaire vormen zijn gekloond en geclassificeerd met betrekking tot de personages onderscheiden van de ouderlijnen voorafgaand aan de genetische linkage in kaart brengen. Controle infecties van de individuele ouders klonen worden uitgevoerd op dezelfde manier als de productie van een genetische kruis.

Protocol

Aseptische technieken moeten worden toegepast op alle materialen die worden toegediend in de dieren om onbedoelde introductie van exogene ziekteverwekkers in muizen die kunnen verwarren experimentele resultaten te vermijden.

1. Infectie van laboratoriummuizen met Blood-traps malariaparasieten

  1. Bij kamertemperatuur, dooi twee flacons met daarin de bevroren bloed podium malariaparasieten te worden overschreden. In dit voorbeeld, twee knaagdier malaria parasiet gebruikte stammen zijn Plasmodium yoelii yoelii en Plasmodium yoelii nigeriensis.
  2. Past een injectiespuit met een 22 tot 30 gauge (G) naald en het opstellen van 400 pi van een steriele, farmaceutische kwaliteit PBS (pH 7,4).
  3. Met dezelfde injectiespuit, het opstellen van 100 pi van de ontdooide geïnfecteerd bloed; keren de spuit op en neer tot de inhoud is homogeen gemengd. (Optioneel: een pipet kan worden gebruikt om PBS en besmet bloed voor te zetten in een collectie buis op de overdracht met een spuit voor injectie).
  4. Injecteer 200 pi van de parasiet bevattende oplossing direct in de peritoneum van een muis. Wanneer u klaar bent, gooi de spuit in een scherpe voorwerpen bak. (Zie ook aanvullende materialen voor het onderhoud van laboratorium-muizen). In het algemeen is de standaard grootte van het inoculum is tussen de 100 tot 500 uL, afhankelijk van het niveau van parasitaire infecties in de originele bevroren materialen.
  5. Injecteer de twee stammen parasiet te worden gekruist in twee muizen per stuk. Muizen zullen microscopisch positief worden 3 tot 5 dagen na de injecties. Wanneer parasitemias bereiken tussen de 1-5%, verder met de volgende stap.

2. Gemengde Clone Infectie van Muizen

  1. Voorafgaand aan de gemengde klonen infectie, verzamel staart bloed van de donor twee muizen geïnfecteerd met de parasiet verschillende stammen voor microscopisch onderzoek door Giemsa gekleurde dunne bloeduitstrijkjes (afb. 3), en voor de meting van de rode bloedcellen dichtheid (zie aanvullende materialen voor gedetailleerde procedures) .
  2. Bereken het volume van een fysiologische zoutoplossing (1,5% w / v trinatriumcitraat dihydraat, 0,85% w / v natriumchloride) en de muis bloed nodig zijn om een ​​inoculum mengsel te produceren, met behulp van de parasitemie en rode bloedcellen dichtheid van metingen eerder verkregen.
  3. Stel de parasiet oplossing tot een uiteindelijke concentratie van een miljoen geïnfecteerde rode bloedcellen per 100μl.
  4. Combineer het geïnfecteerde bloed van de twee donoren in een verhouding van 1:1 voor een mixed-kloon inoculum te verkrijgen. Wanneer de twee ouders klonen verschillen in groei, past u de proporties van een sneller groeiende ouders naar een langzamer groeiende ouderlijk kloon op 1:2 of 1:5.
  5. Injecteer 100 pi van de gemengde monster in het buikvlies van elke muis te worden besmet. (Zie ook stap 3.9 van het aantal muizen te bepalen worden geïnjecteerd)
  6. Met behulp van deze methode, besmetten twee muizen elk met de single ouderstammen. De single-kloon infecties zal de bepaling van de succesvolle uitzending van de twee ouders stammen.

3. Feeding Muggen

  1. Bereid drie kooien met 300 tot 500 volwassen (mannelijke en vrouwelijke) Anopheles muggen stephensi elk, leeftijd 5-7 dagen na de opkomst van de poppen. De containers zijn bedekt met gaas beveiligd door een plastic of metalen deksel. Twee kooien zijn voor het voeden over de ouderlijke klonen, de derde kooi is voor de voorbereiding van een genetische kruis.
  2. Vanaf vier dagen na de mixed-kloon infectie, voor te bereiden Giemsa-gekleurde dunne staart bloed uitstrijkjes van de geïnfecteerde muizen.
  3. Onderzoek de uitstrijkjes onder een microscoop door het scannen van ten minste 50 microscopische velden op 1000x vergroting en vast te stellen of mannelijke en vrouwelijke gameten aanwezig zijn.
  4. Mannelijke en vrouwelijke gametocyten zijn herkenbaar door de aanwezigheid van grote vacuole en grote korrels (figuur 3). Mannelijke en vrouwelijke gametocyten hebben roze en blauw cytoplasma, respectievelijk. Als gametocyten aanwezig zijn, volgt stap 3.6.
  5. Als gametocyten afwezig zijn, blijven monitoren dagelijks tot ze verschijnen. Als gametocyten aanwezig zijn, blijven de volgende stap.
  6. Injecteer 50 ul van anestheticum cocktail bevat 33 mg / ml ketamine en 3 mg / ml van xylazine in het peritoneum van een muis aan elke geïnfecteerde muis (per 20 gram muis lichaamsgewicht) verdoven. Uiteindelijke dosis van ketamine en xylazine is 82,5 en 7,5 mg / kg, respectievelijk.
  7. Leg de muizen gezicht naar beneden op de bovenkant van een kooi met daarin volwassen Anopheles stephensi muggen die zijn van suiker leveren uitgehongerd voor 24 uur en laat de muggen te voeden gedurende 30 minuten zonder onderbreking.
  8. Houden de muggen in een insectary onder standaard condities (temperatuur wordt gehouden tussen 24-26 ° C, ook aanvullende methoden te zien voor het onderhoud van laboratorium muggen).
  9. Gebruik een besmette muis voor elke 50 tot 100 vrouwelijke muggen. Meteen euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie na de voeding, terwijl de muizen nog steeds onder narcose.

4. Ontleden Mosquito MidgUTS en Counting Oöcysten

  1. Negen dagen na de voeding, zal de muggen worden onderzocht op oöcysten in middendarm van het insect. De aanwezigheid van oöcysten in de muggen die zich voeden met single-kloon geïnfecteerde muizen die gametocyten van de twee ouders stammen aangeeft zijn besmettelijk.
  2. Te ontleden een mug middendarm, gebruik een aspirator verbonden met een kleine container 5 tot 10 geïnfecteerde muggen uit de kooi halen.
  3. Met behulp van CO 2 gas, verdoven de muggen en breng ze in een glazen petrischaal op ijs. Apart en gooi mannelijk muggen. De antennes van de mannetjes zijn opvallend bushier in vergelijking met de vrouwtjes.
  4. Vul twee spuiten met PBS en monteer ze met 26 gauge half-inch (G ½) naalden. Borg ongeveer 100 pi PBS uit een spuit op een glasplaatje.
  5. Overdracht 5-10 verdoofd vrouwelijke muggen op de daling van PBS en plaats de schuif op een dissectie microscoop.
  6. Met dezelfde naalden, dan is elke mug de vleugels en de benen te verwijderen, en houdt de insecten op de thorax en posterior buik, uit elkaar te trekken van het lichaam tot aan de middendarm, een witte zak-achtig lichaam, wordt vrijgegeven. Maak de middendarm en gooi de rest van het lichaam.
  7. Voeg meer PBS op de middendarm als de dia's zijn droog. De middendarm zal degenereren als laat gedroogd. Plaats een deksel glijden over de midguts.
  8. Onderzoek de midguts onder een lichtmicroscoop bij een 100x vergroting. Tel het aantal oöcysten in elk middendarm (afb. 3). Oöcysten herkenbaar is als een dikke muur cirkelvormige structuren die liggen aan de buitenkant van de midguts.
  9. Wanneer u klaar bent, gooi spuiten, naalden, en schuif in een scherpe voorwerpen bak.
  10. Als oöcysten zijn afwezig in de midguts, feed muggen met geïnfecteerde muizen met het hogere aantal gametocyten en geven een langere voedertijd. Temperatuur is van cruciaal belang voor deze stap. Zorg ervoor dat de temperatuur is vastgesteld op 24 tot 26 ° C.

5. Het verzamelen van sporozoieten van Muggen door centrifugeren

  1. Bereid sporozoiet verzameling buizen als volgt: knip het deksel van een schone 0,5-ml centrifugebuis en punch een gat (0,1-0,2 mm diameter) aan de onderkant van de buis met behulp van een gevlamd 19 G naald.
  2. Vul 1 / 3 van de buis met glaswol. Plaats de filter buis in een 1.5-mL collectie buis (een buis voldoende is om te oogsten sporozoieten van ~ 100 muggen)
  3. Op dag 17 na het voeden, het verzamelen van muggen (Stap 4) uit de kooien in een kleine container met behulp van een afzuiger.
  4. Gebruik CO 2-gas aan muggen verdoven.
  5. Scheid de vrouwtjes van de mannelijke muggen. Breng de verdoofde vrouwelijke muggen uit de container naar een glazen petrischaal op ijs.
  6. Bereid twee spuiten met 26 G ½ naalden gevuld met PBS. Borg ongeveer 100 pi PBS uit een spuit op een glasplaatje.
  7. Overdracht van de muggen op een microscoopglaasje. Verwijder de muggen 'hoofd, vleugels, poten en buik, onder een dissectie microscoop.
  8. Met behulp van fijne punt pincet overdracht van de thoraxes in 0,5 ml PBS in een 1.5-mL homogenisator (mortier en stamper). Bewaar de thoraxes op ijs (sporozoiet blijft besmettelijk voor 2-3 uur).
  9. Homogeniseer de thoraxes op het ijs te sporozoieten vrijlating uit de speekselklieren (zie figuur 3), en breng de lysaten (homogenaten) in de buis gevuld met glaswol (Stap 5.1 tot 5.2) met behulp van een glazen pipet.
  10. Centrifuge voor 10 tot 20 seconden bij 1000 rpm bij kamertemperatuur.
  11. Verzamel de flow-through (het gezuiverde sporozoiet schorsing) met behulp van een injectiespuit met een 22 tot 30 G naald. (Optioneel: druppel 10 tot 50 pi van de doorstroming op een microscopisch preparaat, plaats een deksel glijden en het live sporozoieten visualiseren onder een standaard lichtmicroscoop, 400X vergroting, zie ook Fig 3)
  12. Injecteer ip 0.1-0.5 ml van de suspensie sporozoiet in muizen (tot maximaal 200.000 parasieten kunnen worden geoogst uit een enkele mug, zie ref 12). In een succesvolle case, zal het dier besmet raken 72 uur na een injectie.

6. Klonen Nakomelingen met behulp van beperkte verdunning

  1. Tweeënzeventig uur na de sporozoiet injecties, verzamel staart bloed van de donor twee muizen geïnfecteerd met de parasiet verschillende stammen voor microscopisch onderzoek na de Giemsa kleuring van dun bloed uitstrijkjes en voor het meten van de rode bloedcellen dichtheid (zie aanvullende materialen voor gedetailleerde procedures).
  2. Kies een muis het weergeven van een 0,1 tot 1% parasitemie en waarvan de geïnfecteerde rode bloedcellen bevatten meestal enkele parasieten als donor voor het klonen procedure. Herhaal stap 6.1 komende dagen als de muizen zijn microscopisch negatief. Als de dieren niet besmet zijn binnen 14 dagen, herhaal stap 2 tot 5 en bepalen van de aanwezigheid van sporozoieten in stap 5.11).
  3. Verdun de geoogste staart bloed in een koude 01:01 oplossing van de oplossing kalfsserum en zoogdieren Ringer's (2,7 mM kaliumchloride, 1,8 mM calciumchloride, 154 mM natriumchloride) om een ​​con te bereikencentratie van 0,6 tot 1 geïnfecteerde rode bloedcellen per 100 ul, en bewaar het inoculum op het ijs. Op deze manier moeten de meeste van individuele muis ontvangen, hetzij een of nul parasieten.
  4. Spuit 100 pi van de verdunde besmet bloed in elk van 50 tot 100 muizen.
  5. Vijf tot zeven dagen later, het scherm van de muizen voor de aanwezigheid van bloed fase parasieten door het onderzoeken van Giemsa-gekleurde dunne bloeduitstrijkjes. In een geslaagd experiment, wordt 20-50% van de muizen geïnfecteerd en zal parasitemie van 0.1-5.0% show op dag 8 na infectie.

7. Karakterisering van Nageslacht met behulp van genetische merkers

  1. Verzamel 20 tot 40 ul van de muis staart bloed in een 1.5-mL microcentrifugebuis dat 0,2 mL van gekoelde fysiologische zoutoplossing citraat, vortex kort en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 3000 rpm bij kamertemperatuur pellet de bloedcellen bevat. Onmiddellijk uittreksel DNA of houden de pellet bij -80 ° C.
  2. Bereid parasiet DNA met behulp van een standaard DNA-extractie methoden. Voor een snelle isolatie van DNA, gebruik dan een High Pure PCR-template voorbereiding kit (Roche Applied Bioscience).
  3. Recombinant nakomelingen worden geïdentificeerd na het genotypering met behulp van microsatelliet (MS) of single nucleotide polymorfisme (SNP) op verschillende chromosomen die kunnen onderscheiden van de twee ouders stammen van de genetische kruis. Een vereenvoudigde methode met behulp van een fluorescent gelabelde primers voor MS genotypering van P. yoelii kan worden gebruikt (zie ref 8,9).

8. Invriezen van bloed-stage malariaparasieten

  1. Verzamel 0,5-1 ml van besmet bloed door het hart doorboren van een verdoofd muis met parasitemie van 5-20% 5-10 ml gekoelde fysiologische zoutoplossing.
  2. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2000 rpm bij kamertemperatuur. Gooi supernatant.
  3. Voeg druppelsgewijze 2x volume van Glycerolyte 57 oplossing (Fenwal Laboratories) op bloed pellets en meng goed.
  4. Breng de suspensie cryotubes (+0.2-0,5 ml per buis).
  5. Bewaar de gecryopreserveerde bloed bij -80 ° C (maximaal 1 maand) of in vloeibare stikstof.

9. Representatieve resultaten:

In een geslaagd experiment, zal 5-10% van de gekloonde lijnen onafhankelijk zijn recombinant nageslacht.

Figuur 1
Figuur 1. Een schematische weergave van de levenscyclus en genetische recombinatie gebeurtenissen tijdens een genetische kruis. Genetische recombinatie evenementen vinden plaats tijdens de vroege fase van de ontwikkeling in de mug. Na de bevruchting van de "haploïde" mannelijke en vrouwelijke gameten van verschillende genetische achtergronden in de middendarm van de mug, zijn "diploïde" zygoten gevormd. De zygote vormt de enige diploïde stadium van de parasiet levenscyclus; meiose volgt binnen de 12 uur van de bevruchting, en alle volgende fasen in de mug en zoogdieren blijven haploïde. De resulterende zygoten ontwikkelen tot ookinetes en oöcysten. Groei en mitotische deling van elke oocysten produceert duizenden sporozoieten, die vrijkomen in hemoceal muggen '. Die sporozoieten die migreren naar speekselklieren zijn in de positie om worden doorgegeven aan een zoogdier gastheer, waarbij de ontwikkeling van de lever en rode bloedcellen fasen plaatsvindt. In de loop van de rode bloedcellen cycli, kunnen sommige parasieten differentiëren tot volwassen mannelijke en vrouwelijke gametocyten. De parasiet levenscyclus is voltooid wanneer deze gametocyten worden overgenomen door een andere mug, bestendigen transmissie.

Figuur 2
Figuur 2. Erfenis van de nucleaire genen in malaria parasieten en productie van recombinante nageslacht. Genetische recombinatie kunnen worden gegenereerd door middel van chromosomale herschikking of door het cross-over gebeurtenissen. Homozygote nakomelingen geproduceerd door zelfbestuiving tussen gameten van dezelfde ouders kloon 1 of 2 (A en D), respectievelijk. B) heterozygote nakomelingen geproduceerd door kruisbestuiving tussen gameten van de twee verschillende ouders klonen, recombinant kernen (blauwe ovalen) wordt gevormd door chromosomale herschikking alleen. C) heterozygote nakomelingen geproduceerd uit kruisbestuiving tussen gameten van de twee verschillende ouder klonen, recombinant kernen (rode ovalen) wordt gevormd door cross-overs tussen de niet-zuster chromatiden van de homologe chromosomen.

Figuur 3
Figuur 3. Morfologie van het knaagdieren malariaparasiet Plasmodium yoelii. A) ring stadium, B) trophozoite, C) schizont, D) merozoïeten, E) onvolwassen mannelijk gametocyt, F) volwassen mannetje gametocyt, G) onvolwassen vrouwelijke gametocyt, H) volwassen vrouwelijke gametocyt, I) middendarm met de oöcysten op dag 10 na voeding (rijpe oöcysten aangegeven met pijlen, 200x vergroting), J) mug speekselklieren (100x vergroting), K) sporozoieten (400x vergroting).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tonen we de technieken voor de productie van een genetische kruis in het knaagdier malaria Plasmodium yoelii, die ook van toepassing op de productie van genetisch kruisen in andere knaagdieren malarias. Infecties van muizen met enkele ouders klonen worden doorgaans uitgevoerd om een ​​succesvolle overdracht van het ouderlijk parasieten te bepalen om ervoor te zorgen dat de ouders bevoegd zijn in het produceren van functionele gameten voor het uitvoeren van een kruis.

Succesvolle transmissie via een mug wordt beïnvloed door meerdere factoren, zoals temperatuur van de insectary, soorten knaagdieren worden gebruikt malariaparasieten, en de doses van het bloed-parasiet stage (aantal kiemen). Terwijl de transmissie van P. berghei wordt normaal bereikt bij 19-21 ° C 13, de overdracht van P. yoelii en P. chabaudi wordt routinematig uitgevoerd bij 23-25 ​​° C 14. Ookinetes van P. berghei niet om in oöcysten te ontwikkelen bij temperaturen lager dan 16 ° C of hoger dan 24 ° C 15. In aanvulling op de temperatuur, inoculum grootte kan vermenigvuldigingsfactor van malariaparasieten invloed in het bloed. Hoewel de injecties van een groot aantal kiemen (5 x 10 6 iRBC of meer) hoger zal parasitemie rendement op een zeer vroeg stadium van de infectie, is het niet per se leiden tot grotere aantallen gametocyten of hoger infectiviteit aan muggen. Gadsby en anderen (2009) toonde aan dat 16 gametocyten van P. chabaudi Adami aanwezig zijn in het bloed van dag 3 tot dag 20 (piek op dag 13) na de infectie van 1 x 10 6 iRBC, maar dag 6 na infectie is de enige dag waarop muggen besmet raken. Ook de toediening van een groot aantal kiemen van snel groeiende en virulente parasiet stammen zoals klonen N67 (nigeriensis), 17XL, en YM van P. yoelii, kloon ANKA van P. berghei, en de DS kloon van P. chabaudi Adami resulteert vaak in ernstige bloedarmoede en pathologie in muizen, die een significante daling van de muis de lichaamstemperatuur kan veroorzaken. Als gevolg hiervan, muizen minder infectieuze aan muggen (niet gepubliceerde waarnemingen). Toch is de overdracht van knaagdieren malariaparasieten uitgevoerd met een standaard inoculum formaat (10 6 iRBC). Het is gebleken dat P. berghei en P. yoelii overdraagbaar zijn aan muggen van dag 3-5 na het bloed fase-geïnduceerde infectie in muizen 17, terwijl P. chabaudi chabaudi en P. chabaudi Adami zijn slechts overdraagbaar aan muggen op dag 6 na de bloed-geïnduceerde fase infecties in muizen 16, 18.

Factoren die de productie van recombinant nakomelingen beïnvloeden zijn: de verhoudingen van gametocyten van de twee ouders stammen in muizen. In theorie is de maximale productie van recombinante nakomelingen doet zich voor wanneer gametocyten van beide geslachten van de ouderlijke klonen zijn in gelijk aantal en zelf-bevruchting en kruisbestuiving plaatsvinden op dezelfde frequentie. Onder deze voorwaarde, zal de helft van de resulterende zygoten worden hybriden en de rest zal bestaan ​​uit gelijke delen van de twee ouders kloon lijnen. Productie van recombinante klonen nageslacht zal sterk worden verlaagd als het aandeel van gametocyten is beïnvloed in de richting van een ouderlijk kloon, wat leidt tot disproportionele zelf-bevruchting. Bovendien, parasieten hebben vaak verschillende groeicijfers en kunnen verschillende capaciteiten hebben in het produceren van gametocyten 16, 19. Daarom is het noodzakelijk om de verhoudingen van het ouderlijk parasieten te optimaliseren in het mengsel te injecteren in de muizen voor de mug het voeden.

De tijd om parasieten kloon uit het bloed na muggen voeden is ook een belangrijke factor om te overwegen. Het verdient de voorkeur om het nageslacht van de genetische kruis kloon als parasitemie is tussen de 0.1-1.0% (niet al te veel cycli van replicatie in het bloed) om het klonen gedupliceerd klonen te voorkomen. Snel of langzaam groeiende parasieten kunnen komen in grote getale in bepaalde perioden van tijd, en klonen op de toppen van snel of langzaam groeiende parasieten zal eindigen met klonen met dezelfde fenotypes.

Tot slot, het uitvoeren van genetische kruisingen van knaagdier malariaparasieten is relatief eenvoudig en veel goedkoper dan het uitvoeren van een genetische kruising van de menselijke malariaparasiet P. falciparum, die infectie van een niet-menselijke primaat vereist. Recombinant nakomelingen van de genetische kruizen zijn nuttige instrumenten voor de bouw van genetische linkage kaarten en voor het in kaart brengen van belangrijke eigenschappen, waaronder malaria-parasiet ontwikkeling, resistentie en virulentie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Omdat de auteurs zijn werknemers bij de overheid en dit is een werk voor de overheid, het werk is in het publieke domein in de Verenigde Staten. Niettegenstaande alle andere overeenkomsten, het NIH zich het recht om het werk te verstrekken aan PubMedCentral voor weergave en gebruik door het publiek, en kan PubMedCentral tag of wijzigen van het werk in overeenstemming met haar gebruikelijke praktijken. U kunt vaststellen rechten buiten de VS onderworpen aan een door de overheid te gebruiken licentie.

Acknowledgments

Wij danken Drs Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare en Tovi Lehman voor de kritische lezing van manuscripten. Dit werk werd ondersteund door de Intramurale Research Program van de afdeling van de intramurale Onderzoek, Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten, National Institutes of Health, en door de 973 National Basic Research Program van China, # 2007CB513103. Wij danken NIAID intramurale editor Brenda Rae Marshall voor hulp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glyerolyte 57 solution Cenmed 4A7833
Mouse Mus musculus Charles River Laboratories Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum Invitrogen 26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution Invitrogen 10010-072 pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1) MR4 MRA-593 deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67 MR4 MRA-427 deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi MR4 MRA-128 deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer Nexcelom Bioscience Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit Roche Group 11 796 828 001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified Sigma-Aldrich GS500
Ketamine hydrochloride Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S4641
Xylazine Akorn Inc 4811-20ml Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool VWR international 32848-003
Glass capillary (1 μL) VWR international 53440-001
Hemocytometer VWR international 15170-168 Complete chamber set
Homogenizer VWR international KT749520-0090 Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

  • Maintenance of laboratory mice
  • Maintenance of laboratory mosquit–s
  • Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
  • Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquit–s

Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayton, K., Ranford-Cartwright, L. C., Walliker, D. Sulfadoxine-pyrimethamine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2482-2489 (2002).
  2. Cravo, P. V. Genetics of mefloquine resistance in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi. Antimicrob Agents Chemother. 47, 709-718 (2003).
  3. Hunt, P., Cravo, P. V., Donleavy, P., Carlton, J. M., Walliker, D. Chloroquine resistance in Plasmodium chabaudi: are chloroquine-resistance transporter (crt) and multi-drug resistance (mdr1) orthologues involved? Mol Biochem Parasitol. 133, 27-35 (2004).
  4. Yuan, J. Genetic mapping of targets mediating differential chemical phenotypes in Plasmodium falciparum. Nat Chem Biol. 5, 765-771 (2009).
  5. Su, X., Kirkman, L. A., Fujioka, H., Wellems, T. E. Complex polymorphisms in an approximately 330 kDa protein are linked to chloroquine-resistant P. falciparum in Southeast Asia and Africa. Cell. 91, 593-603 (1997).
  6. Hayton, K. Erythrocyte binding protein PfRH5 polymorphisms determine species-specific pathways of Plasmodium falciparum invasion. Cell Host Microbe. 4, 40-51 (2008).
  7. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Congenicity and genetic polymorphism in cloned lines derived from a single isolate of a rodent malaria parasite. Mol Biochem Parasitol. 157, 244-247 (2008).
  8. Li, J. Hundreds of microsatellites for genotyping Plasmodium yoelii parasites. Mol Biochem Parasitol. 166, 153-158 (2009).
  9. Li, J. Typing Plasmodium yoelii microsatellites using a simple and affordable fluorescent labeling method. Mol Biochem Parasitol. 155, 94-102 (2007).
  10. Walliker, D., Carter, R., Morgan, S. Genetic recombination in malaria parasites. Nature. 232, 561-562 (1971).
  11. Sinden, R. E., Hartley, R. H. Identification of the meiotic division of malarial parasites. J Protozool. 32, 742-744 (1985).
  12. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. J Parasitol. 70, 831-833 (1984).
  13. Yoeli, M., Most, H., Bone, G. Plasmodium berghei: cyclical transmission by experimentally infected Anopheles quadrimachulatus. Science. 144, 1580-1581 (1964).
  14. Landau, I., Boulard, Y. Life cycles and Morphology. Academic Press. London/New York/San Franciso. (1978).
  15. Vanderbergh, J. P. Y., M, Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. J Parasitol. 52, 559-564 (1966).
  16. Gadsby, N., Lawrence, R., Carter, R. A study on pathogenicity and mosquito transmission success in the rodent malaria parasite Plasmodium chabaudi adami. Int J Parasitol. 39, 347-354 (2009).
  17. Pattaradilokrat, S., Culleton, R. L., Cheesman, S. J., Carter, R. G. ene encoding erythrocyte binding ligand linked to blood stage multiplication rate phenotype in Plasmodium yoelii yoelii. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 7161-7166 (2009).
  18. Pattaradilokrat, S., Cheesman, S. J., Carter, R. Linkage group selection: towards identifying genes controlling strain specific protective immunity in malaria. PLoS One. 2, e857-e857 (2007).
  19. Mackinnon, M. J., Read, A. F. Genetic Relationships between Parasite Virulence and Transmission in the Rodent Malaria Plasmodium chabaudi. Evolution. 53, 689-703 (1999).
Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).More

Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter