कृंतक मलेरिया परजीवियों की आनुवंशिक क्रॉस के उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल

Summary

कृंतक मलेरिया परजीवी के जेनेटिक पार मच्छरों दो आनुवंशिक रूप से अलग परजीवी खिला द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं. पुनः संयोजक संतान माउस खून से मच्छरों को संक्रमित चूहों काटने की अनुमति के बाद क्लोन कर रहे हैं. इस वीडियो से पता चलता है कि किस तरह की आनुवंशिक पार उत्पादन के लिए

Protocol

सड़न रोकनेवाला तकनीक सभी सामग्री है कि पशुओं में administrated हो जाएगा exogenous संक्रामक एजेंटों के चूहों कि प्रयोगात्मक परिणामों उलझाना कर सकते हैं में अनजाने परिचय से बचने के लिए लागू किया जाना चाहिए.

1. रक्त चरण मलेरिया परजीवी के साथ प्रयोगशाला चूहे के संक्रमण

1. कमरे के तापमान पर, दो जमे हुए रक्त चरण मलेरिया परजीवी युक्त शीशियों को पार करने के लिए पिघलना. इस उदाहरण में, दो कृंतक मलेरिया परजीवी का इस्तेमाल उपभेदों प्लाज्मोडियम yoelii yoelii और प्लाज्मोडियम yoelii nigeriensis हैं .
2. 22-30 गेज सुई (जी) के साथ एक सिरिंज फ़िट और बाँझ, दवा ग्रेड पीबीएस (7.4 पीएच) के 400 μL आकर्षित.
3. एक ही सिरिंज का प्रयोग, thawed संक्रमित रक्त के 100 μL आकर्षित; सिरिंज पलटना ऊपर और नीचे जब तक सामग्री homogenously मिश्रित है. (वैकल्पिक: एक विंदुक पीबीएस और संक्रमित रक्त संग्रह ट्यूब में इंजेक्शन के लिए एक सिरिंज में स्थानांतरित करने से पहले हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है).
4. परजीवी एक माउस के peritoneum में सीधे समाधान युक्त के 200 μL इंजेक्षन. जब समाप्त हो, एक sharps बिन में सिरिंज त्यागें. (प्रयोगशाला चूहों के रखरखाव के लिए पूरक सामग्री देखें). सामान्य में, inoculum के मानक आकार 100-500 μL के बीच है, मूल जमी सामग्री में परजीवी संक्रमण के स्तर पर निर्भर करता है.
5. दो परजीवी दो चूहों में पार जा उपभेदों इंजेक्षन. चूहे सकारात्मक microscopically इंजेक्शन के बाद 3 से 5 दिन बन जाएगा. जब parasitemias 1-5% के बीच तक पहुँचते हैं, तो अगले कदम के लिए जारी है.

2. चूहे के मिश्रित क्लोन संक्रमण

1. मिश्रित क्लोन संक्रमण के पहले दो दाता Giemsa दाग पतली रक्त स्मीयरों द्वारा सूक्ष्म परीक्षण (चित्र 3) के लिए अलग परजीवी उपभेदों से संक्रमित चूहों से पूंछ रक्त एकत्र, और लाल रक्त कोशिका घनत्व की माप के लिए (विस्तृत प्रक्रियाओं के लिए पूरक सामग्री देखें) .
2. एक शारीरिक (1.5% w / ध् Trisodium साइट्रेट dihydrate, 0.85% w / v सोडियम क्लोराइड) खारा और माउस के लिए एक inoculum मिश्रण का निर्माण करने के लिए आवश्यक रक्त की मात्रा की गणना, पहले प्राप्त पेरासाइटिमिया और लाल रक्त कोशिका घनत्व माप का उपयोग.
3. एक मिलियन संक्रमित 100μl प्रति लाल रक्त कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए परजीवी समाधान समायोजित करें.
4. एक 1:1 के अनुपात में दो दाताओं से संक्रमित रक्त का मिश्रण करने के लिए एक मिश्रित क्लोन inoculum प्राप्त. जब दोनों माता पिता क्लोन विकास दर में अलग है, के अनुपात को समायोजित 01:02 या 01:05 के लिए एक धीमी गति से बढ़ती पैतृक क्लोन करने के लिए माता - पिता की तेजी से बढ़ती है.
5. प्रत्येक संक्रमित हो माउस के peritoneum में मिश्रित नमूने के 100 μL इंजेक्षन. (देखें भी चूहों की संख्या निर्धारित करने के लिए इंजेक्शन जा 3.9 कदम)
6. इस पद्धति का उपयोग करके, दो चूहों एकल माता पिता उपभेदों के साथ प्रत्येक संक्रमित. एकल क्लोन संक्रमण दो पैतृक उपभेदों के सफल प्रसारण के निर्धारण की अनुमति देगा.

3. दूध पिलाने मच्छरों

1. तीन 3-500 (पुरुष और महिलाओं) वयस्क एनोफ़ेलीज़ stephensi मच्छरों प्रत्येक, उम्र pupae से 5-7 दिनों के बाद उद्भव युक्त पिंजरों तैयार. कंटेनरों एक प्लास्टिक या धातु ढक्कन द्वारा सुरक्षित जाल के साथ कवर कर रहे हैं. दो पिंजरों पैतृक क्लोन पर खिलाने के लिए कर रहे हैं, तीसरे पिंजरे एक आनुवंशिक क्रॉस की तैयारी के लिए है.
2. मिश्रित क्लोन संक्रमण के बाद चार दिनों के लिए शुरू, संक्रमित चूहों से तैयार Giemsa पतली खून से सना हुआ पूंछ स्मीयरों.
3. 1000x बढ़ाई पर कम से कम 50 सूक्ष्म क्षेत्रों स्कैनिंग के द्वारा एक खुर्दबीन के नीचे स्मीयरों की जांच करने और निर्धारित करें कि क्या पुरुष और महिला gametocytes मौजूद हैं.
4. पुरुष और महिला gametocytes पहचानने बड़े रिक्तिका और बड़ी granules की उपस्थिति (चित्र 3) कारण हैं. नर और मादा gametocytes गुलाबी और नीले रंग के cytoplasm है, क्रमशः. यदि gametocytes मौजूद हैं, 3.6 चरण का पालन करें.
5. यदि gametocytes अनुपस्थित रहे हैं, दैनिक निगरानी जब तक वे दिखाई देते रहते हैं. यदि gametocytes मौजूद हैं, निम्नलिखित कदम जारी है.
6. संवेदनाहारी 33 ketamine और 3 प्रत्येक संक्रमित माउस (20 ग्राम माउस शरीर के वजन के प्रति) anesthetize माउस के peritoneum में मिलीग्राम / xylazine के एमएल की मिलीग्राम / एमएल दवा युक्त कॉकटेल के 50 μL इंजेक्षन. Ketamine और xylazine की अंतिम खुराक 82.5 और 7.5 मिलीग्राम / किलोग्राम, क्रमशः है.
7. प्लेस चूहों वयस्क एनोफ़ेलीज़ stephensi मच्छरों कि 24 घंटे के लिए किया गया है चीनी की आपूर्ति के भूखे और मच्छरों को बिना किसी रुकावट के 30 मिनट के लिए फ़ीड के लिए अनुमति देते हैं युक्त पिंजरे के शीर्ष पर नीचे चेहरा.
8. मानक शर्तों (भी प्रयोगशाला मच्छरों के रखरखाव के लिए पूरक के तरीके को देखने के तापमान 24-26 के बीच बनाए रखा है ° सी) के तहत एक insectary में मच्छरों बनाए रखें.
9. हर 50-100 मादा मच्छर के लिए एक संक्रमित माउस का प्रयोग करें. चूहों तुरंत खिलाने के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से जबकि चूहों संज्ञाहरण के तहत अब भी कर रहे हैं euthanize.

4. विदारक मच्छर Midgयूटीएस और गिनती Oocysts

1. नौ दिन खिलाने के बाद, मच्छरों कीट midgut में oocysts के लिए जांच की जाएगी. मच्छरों में oocysts की उपस्थिति है कि एकल क्लोन संक्रमित चूहों पर फ़ीड कि दो माता पिता उपभेदों के gametocytes इंगित करता है संक्रामक रहे हैं.
2. मच्छर midgut काटना, एक छोटे कंटेनर से जुड़े पिंजरे से 5 से 10 संक्रमित मच्छरों इकट्ठा Aspirator का उपयोग करें.
3. सीओ ₂ गैस का प्रयोग, मच्छरों anesthetize और एक गिलास पेट्री डिश में उन्हें बर्फ पर स्थानांतरण . अलग और पुरुष मच्छरों त्यागें. पुरुषों के एंटीना ज़ाहिर कर रहे हैं महिलाओं के लिए तुलना में bushier है.
4. पीबीएस के साथ दो सीरिंज भरें और उन्हें 26 गेज आधा इंच (G ^{साढ़े)} सुइयों के साथ फिट . एक गिलास स्लाइड पर एक सिरिंज से 100 μL पीबीएस के बारे में जमा है.
5. पीबीएस के ड्रॉप पर 5 से 10 anesthetized मादा मच्छर स्थानांतरण और विदारक माइक्रोस्कोप पर स्लाइड जगह है.
6. एक ही सुई का प्रयोग, एक मच्छर के पंख और पैरों को हटाने, तो, छाती और पीछे पेट पर कीट धारण, शरीर के अलावा खींच midgut, एक थैली की तरह सफेद शरीर जारी है जब तक. Midgut अलग और शरीर के बाकी त्यागने.
7. Midgut पर अधिक पीबीएस अगर स्लाइड्स सूख रहे हैं. midgut अगर सूख जाने पतित होगा. Midguts पर एक कवर पर्ची रखें.
8. एक 100x बढ़ाई प्रकाश खुर्दबीन के नीचे midguts जांच करते हैं. प्रत्येक midgut में oocysts की संख्या की गणना (चित्र 3). Oocysts मोटी दीवार परिपत्र संरचनाओं कि midguts की बाहरी सतह पर झूठ के रूप में पहचानने योग्य होते हैं.
9. जब समाप्त हो, सिरिंजों, सुई, और एक sharps बिन में स्लाइड के निपटान.
10. यदि oocysts midguts में अनुपस्थित रहे हैं, gametocytes की उच्च संख्या के साथ संक्रमित चूहों के साथ मच्छरों फ़ीड और अब समय खिला दे. तापमान के इस कदम के लिए महत्वपूर्ण है. सुनिश्चित करें कि तापमान 24 से 26 डिग्री सेल्सियस पर सेट है

5. Centrifugation द्वारा मच्छरों से स्पोरोजोएट्स संग्रह

1. निम्नानुसार बीजाणुज संग्रह ट्यूबों तैयार: एक साफ अपकेंद्रित्र 0.5 एमएल ट्यूब के ढक्कन में कटौती और एक flamed 19 जी सुई का उपयोग ट्यूब के नीचे एक छेद पंच (.1-.2 मिमी व्यास).
2. कांच ऊन के साथ 1 / ट्यूब के 3 भरें. एक 1.5 एमएल संग्रह ट्यूब में फिल्टर ट्यूब डालें (~ 100 मच्छरों से फसल स्पोरोजोएट्स के लिए एक ट्यूब पर्याप्त है)
3. दिन 17 पोस्ट खिला, पिंजरों से मच्छरों (4 चरण) के एक छोटे कंटेनर में एक Aspirator का उपयोग इकट्ठा.
4. सीओ ₂ गैस का उपयोग करने के लिए मच्छरों anesthetize.
5. नर मच्छरों से महिलाओं को अलग करें. कंटेनर से बर्फ पर एक गिलास पेट्री डिश anesthetized मादा मच्छर स्थानांतरण.
6. 26 जी ^{साढ़े} पीबीएस के साथ भरा सुइयों के साथ दो सीरिंज तैयार करें . एक गिलास स्लाइड पर एक सिरिंज से 100 μL पीबीएस के बारे में जमा है.
7. एक खुर्दबीन स्लाइड पर मच्छरों का स्थानांतरण. एक विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत 'मच्छरों सिर, पंख, पैर, और पेट निकालें.
8. ठीक इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग 0.5 एमएल पीबीएस में 1.5 एमएल homogenizer (मोर्टार और मूसल) में thoraxes हस्तांतरण. बर्फ पर thoraxes स्टोर (बीजाणुज 2-3 घंटे के लिए संक्रामक रहता है).
9. बर्फ पर thoraxes homogenize लार ग्रंथियों से स्पोरोजोएट्स रिहाई (चित्रा 3 देखें), और कांच ऊन (5.1-5.2 चरण) एक गिलास पिपेट का उपयोग कर से भरा ट्यूब में lysates (homogenates) हस्तांतरण.
10. कमरे के तापमान पर 1000 rpm पर 10 से 20 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र.
11. लीजिए प्रवाह के माध्यम से (शुद्ध बीजाणुज निलंबन) एक 22-30 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर. (वैकल्पिक: ड्रॉप - प्रवाह के माध्यम से एक सूक्ष्म स्लाइड पर जगह है, एक कवर पर्ची और एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप, बढ़ाई 400X के अंतर्गत रहते स्पोरोजोएट्स कल्पना, यह भी देखें 3 अंजीर के 10-50 μL)
12. चूहों (12 रेफरी देखने के लिए 200.000 परजीवी मच्छर एक एकल से काटा जा सकता है है) में बीजाणुज निलंबन के आईपी 0.1-0.5 एमएल इंजेक्षन. एक सफल मामले में, जानवर एक इंजेक्शन के बाद 72 बजे संक्रमित हो जाएगा.

6. क्लोनिंग लिमिटेड कमजोर पड़ने का उपयोग संतान

1. बीजाणुज इंजेक्शन के बाद सत्तर दो बजे दो दाता पतली रक्त स्मीयरों की Giemsa धुंधला के बाद और लाल रक्त कोशिका घनत्व की माप के लिए सूक्ष्म परीक्षा के लिए अलग परजीवी उपभेदों (विस्तृत प्रक्रियाओं के लिए पूरक सामग्री देखें) से संक्रमित चूहों से पूंछ रक्त इकट्ठा.
2. एक 0.1 से 1% पेरासाइटिमिया प्रदर्शित माउस उठाओ और जिसका संक्रमित लाल रक्त कोशिकाओं क्लोनिंग प्रक्रिया के लिए एक दाता के रूप में ज्यादातर एकल परजीवी होते हैं. दोहराएँ 6.1 अगले दिन कदम अगर चूहों microscopically नकारात्मक हैं. अगर पशुओं के 14 दिनों के भीतर संक्रमित नहीं कर रहे हैं, 5 करने के लिए चरण 2 दोहराएँ और 5.11 कदम में स्पोरोजोएट्स की उपस्थिति का निर्धारण).
3. बछड़ा सीरम और स्तनधारी घंटी समाधान (2.7 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 1.8 मिमी कैल्शियम क्लोराइड, 154 मिमी सोडियम क्लोराइड) की ठंड 01:01 समाधान में काटा पूंछ रक्त पतला इतनी के रूप में एक चोर को पाने के लिए0.6 के 100 μL प्रति एक संक्रमित लाल रक्त कोशिका, और बर्फ पर inoculum दुकान centration. इस तरीके में, व्यक्तिगत माउस के अधिकांश या तो एक या शून्य परजीवी प्राप्त करना चाहिए.
4. नसों के द्वारा प्रत्येक 50 से 100 चूहों के में पतला संक्रमित रक्त के 100 μL इंजेक्षन.
5. पांच से सात दिनों के बाद, Giemsa पतली खून से सना हुआ स्मीयरों की जांच कर रक्त चरण परजीवी की उपस्थिति के लिए चूहों स्क्रीन. एक सफल प्रयोग में चूहों की 20-50% संक्रमित हो जाते हैं और दिन 8 पोस्ट संक्रमण में 0.1-5.0% की पेरासाइटिमिया दिखाएगा.

7. संतान की विशेषता आनुवंशिक मार्करों का उपयोग

1. Microcentrifuge 1.5 एमएल ट्यूब है कि ठंडा शारीरिक साइट्रेट नमकीन घोल, भंवर संक्षिप्त, और गोली रक्त कोशिकाओं के लिए कमरे के तापमान पर 3000 rpm पर 3 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के 0.2 एमएल शामिल माउस पूंछ रक्त का 20 से 40 μL लीजिए. डीएनए तुरंत निकालें या रखने -80 में गोली डिग्री सेल्सियस
2. परजीवी डीएनए किसी भी मानक डीएनए निष्कर्षण तरीकों का उपयोग कर तैयार है. डीएनए के तेजी से अलगाव के लिए, एक उच्च शुद्ध पीसीआर टेम्पलेट तैयारी किट (Roche एप्लाइड बायोसाइंस) का उपयोग करें.
3. पुनः संयोजक संतान माइक्रोसेटेलाइट (एमएस) या अलग क्रोमोसोम है कि आनुवंशिक पार के दो पैतृक उपभेदों अंतर कर सकते हैं पर एकल nucleotide बहुरूपता (SNP) का उपयोग कर जीनोटाइपिंग के बाद की पहचान कर रहे हैं. पी. के एमएस जीनोटाइपिंग के लिए एक फ्लोरोसेंट लेबल प्राइमरों का उपयोग कर एक सरलीकृत विधि yoelii (8,9 रेफरी देखें) का प्रयोग किया जा सकता है .

8. रक्त चरण मलेरिया परजीवियों की cryopreservation

1. 5-10 एमएल में 5-20% की पेरासाइटिमिया के साथ एक anesthetized माउस से हृदय पंचर द्वारा संक्रमित रक्त के 0.5-1 एमएल लीजिए शारीरिक खारा समाधान ठंडा.
2. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2000 rpm पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
3. रक्त छर्रों पर ड्रॉप - वार Glycerolyte 57 समाधान के 2x मात्रा (Fenwal प्रयोगशालाओं) जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
4. निलंबन cryotubes (ट्यूब प्रति 0.2-0.5 एमएल) के लिए स्थानांतरण.
5. -80 डिग्री सेल्सियस (1 महीने) या तरल नाइट्रोजन में cryopreserved रक्त स्टोर.

9. प्रतिनिधि परिणाम:

एक सफल प्रयोग में क्लोन लाइनों के 5-10% स्वतंत्र रीकॉम्बीनैंट संतान हो जाएगा.

चित्रा 1 जीवन और एक आनुवंशिक पार के दौरान चक्र आनुवंशिक पुनर्संयोजन की घटनाओं का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. आनुवंशिक पुनर्संयोजन घटनाओं मच्छर में विकास के प्रारंभिक चरण के दौरान जगह ले लो. "अगुणित" मच्छर की midgut में अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के पुरुष और महिला gametes के निषेचन के बाद, "द्विगुणित" zygotes का गठन कर रहे हैं. युग्मनज परजीवी के जीवन चक्र के केवल द्विगुणित चरण का गठन किया, अर्धसूत्रीविभाजन निषेचन के 12 घंटे के भीतर इस प्रकार है, और मच्छर और स्तनधारियों में बाद के सभी चरणों अगुणित रहते हैं. परिणामस्वरूप zygotes ookinetes और oocysts में विकसित. ग्रोथ और प्रत्येक oocyst mitotic विभाजन स्पोरोजोएट्स के हजारों, जो मच्छरों hemoceal में जारी कर रहे हैं पैदा करता है. उन स्पोरोजोएट्स कि लार की गिल्टी को विस्थापित करने की स्थिति में हैं करने के लिए एक स्तनधारी मेजबान है, जहां जिगर के विकास और लाल रक्त कोशिका चरणों जगह लेता करने के लिए प्रेषित किया जा. लाल रक्त कोशिका चक्र के पाठ्यक्रम के दौरान, कुछ परजीवी परिपक्व पुरुष और महिला gametocytes में अंतर कर सकते हैं. जब इन gametocytes दूसरे मच्छर, संचरण को बनाए रखने के द्वारा लिया जाता है परजीवी जीवन चक्र पूरा हो गया है.

चित्रा 2 मलेरिया परजीवी और पुनः संयोजक संतान के उत्पादन में परमाणु जीन के वंशानुक्रम. आनुवंशिक पुनर्संयोजन गुणसूत्र reassortment के माध्यम से या अंतरराष्ट्रीय घटनाओं से उत्पन्न किया जा सकता है. Homozygous संतान एक ही माता पिता का क्लोन 1 या 2 (एक और डी), क्रमशः के gametes के बीच selfing द्वारा उत्पादन किया. बी) विषमयुग्मजी gametes के बीच दो अलग अलग माता पिता क्लोन, अकेले गुणसूत्र reassortment द्वारा गठित किया जा रहा पुनः संयोजक (नीले ovals) नाभिक के पार निषेचन द्वारा उत्पादित संतान. सी) विषमयुग्मजी दो अलग माता पिता क्लोन, पुनः संयोजक नाभिक (लाल ovals) समरूपी क्रोमोसोमों की गैर - बहन क्रोमेटिडों के बीच crossovers द्वारा गठित किया जा रहा है की gametes के बीच पार निषेचन से उत्पादित संतान.

चित्रा 3 कृंतक मलेरिया परजीवी प्लाज्मोडियम yoelii की आकृति विज्ञान. दिन 10 पोस्ट पर oocysts के साथ) एक अंगूठी चरण, बी) trophozoite, सी) schizont, डी), मेरोजोएट्स ई) अपरिपक्व पुरुष gametocyte, एफ) परिपक्व पुरुष gametocyte, जी) अपरिपक्व महिला gametocyte, एच) परिपक्व महिला gametocyte, मैं) midgut खिला (परिपक्व तीर द्वारा संकेत oocysts, 200x बढ़ाई), जे) मच्छर लार ग्रंथियों (100x बढ़ाई), कश्मीर) स्पोरोजोएट्स (400x बढ़ाई).

Discussion

हम कृंतक मलेरिया प्लाज्मोडियम yoelii, जो भी अन्य कृंतक malarias में आनुवंशिक पार के उत्पादन के लिए लागू है एक आनुवंशिक पार के उत्पादन के लिए तकनीकों को प्रदर्शित करता है. एकल माता पिता क्लोन के साथ चूहों के संक्रमण आमतौर पर पैतृक परजीवी के सफल प्रसारण का निर्धारण करने के लिए सुनिश्चित करें कि माता पिता को एक क्रॉस प्रदर्शन से पहले कार्यात्मक gametes के उत्पादन में सक्षम हैं प्रदर्शन कर रहे हैं.

एक मच्छर के माध्यम से सफल संचरण insectary के तापमान, कृंतक मलेरिया परजीवियों का इस्तेमाल किया प्रजातियों, और परजीवी की रक्त मंच खुराक (inoculum आकार) सहित कई कारकों से प्रभावित होता है. जबकि पी. berghei के संचरण सामान्य रूप से ^19-21 ° 13 सी, पी. के प्रसारण पर हासिल की है yoelii और पी. chabaudi नियमित रूप से ^23-25 ​​° 14 सी में किया जाता है. पी. की Ookinetes berghei तापमान पर oocysts में विकसित करने में विफल 16 से अधिक कम डिग्री सेल्सियस या 24 ^से अधिक ° 15 सी. तापमान के लिए इसके अलावा, inoculum आकार रक्त में मलेरिया परजीवी के गुणन की दर को प्रभावित कर सकते हैं. यद्यपि एक बड़े inoculum आकार के इंजेक्शन (5 x 10 iRBC ⁶ या अधिक) संक्रमण का बहुत ही प्रारंभिक अवस्था में उच्च पेरासाइटिमिया निकलेगा, यह जरूरी gametocytes या उच्चतर मच्छरों को संक्रामकता की बड़ी संख्या के लिए नेतृत्व नहीं करता है . Gadsby और दूसरों (2009) ¹⁶ से पता चला है कि पी. chabaudi adami के gametocytes रक्त में मौजूद 20 दिन के लिए 3 दिन (13 दिन में शिखर) से ¹ 10 x 6 iRBC के पद के संक्रमण कर रहे हैं, तथापि, दिन 6 पोस्ट संक्रमण ही है दिन जिस पर मच्छरों संक्रमित हो जाते हैं. इसके अलावा, तेजी से बढ़ रही है और N67 (nigeriensis) क्लोन, 17XL, और पी. yoelii YM, पी. के क्लोन Anka जैसे परजीवी विषमय उपभेदों के एक बड़े inoculum आकार के प्रशासन berghei, और पी. chabaudi adami के क्लोन डी एस अक्सर गंभीर एनीमिया और चूहों में विकृति है, जो माउस शरीर के तापमान के एक महत्वपूर्ण गिरावट पैदा कर सकता है में परिणाम है. एक परिणाम के रूप में, चूहों कम मच्छरों के लिए संक्रामक (अप्रकाशित टिप्पणियों) बन जाते हैं. फिर भी, कृंतक मलेरिया परजीवी के संचरण में एक मानक inoculum आकार ⁽¹⁰ 6 iRBC) के साथ आयोजित किया गया है. यह पाया गया है कि पी. berghei और पी. yoelii 3 दिनों से मच्छरों के लिए संक्रामक हैं ¹⁷ चूहों में रक्त चरण प्रेरित संक्रमण के बाद 5, जबकि पी. chabaudi chabaudi और पी. chabaudi adami केवल ^{चूहों 16,} 18 में रक्त चरण प्रेरित संक्रमण के बाद 6 दिन पर मच्छरों के लिए संक्रामक हैं.

कारक है कि पुनः संयोजक संतान का उत्पादन प्रभावित चूहों में दो पैतृक उपभेदों के gametocytes के अनुपात शामिल हैं. सिद्धांत रूप में, पुनः संयोजक संतान की अधिकतम उत्पादन होता है जब माता पिता क्लोन दोनों लिंगों के gametocytes बराबर संख्या में हैं और स्व निषेचन और पार निषेचन एक ही आवृत्ति पर होते हैं. इस स्थिति के अंतर्गत, जिसके परिणामस्वरूप zygotes के आधे संकर हो सकता है और शेष दो माता पिता क्लोन लाइनों के बराबर अनुपात से मिलकर होगा. पुनर्योगज संतान क्लोनों का उत्पादन बहुत कम जब gametocytes के अनुपात में एक माता पिता के क्लोन की ओर पक्षपाती है, disproportional स्व निषेचन के लिए अग्रणी होगा. इसके अलावा, परजीवी अक्सर विभिन्न विकास दर है और gametocytes ^{16, 19} के उत्पादन में विभिन्न क्षमता हो सकता है . इसलिए, यह आवश्यक है मच्छर खिलाने के लिए चूहों में इंजेक्ट किया मिश्रण में पैतृक परजीवी के अनुपात का अनुकूलन.

समय मच्छर खिलाने के बाद खून से परजीवी क्लोन भी एक महत्वपूर्ण पहलू पर विचार है. यह आनुवंशिक पार की संतान क्लोन करने के लिए बेहतर है जब पेरासाइटिमिया 0.1-1.0% (रक्त में भी कई प्रतिकृति के चक्र से पहले) के लिए क्लोनिंग दोहराया क्लोन से बचने के बीच है. फास्ट या धीमी गति से बढ़ रही परजीवी बाहर के कुछ समय में बड़ी संख्या में, आ सकता है और तेज या धीमी गति से बढ़ रही परजीवी की चोटियों पर क्लोनिंग वही phenotypes होने क्लोन के साथ खत्म हो जाएगा.

अंत में, प्रदर्शन आनुवंशिक कृंतक मलेरिया परजीवी का उपयोग कर पार आसान रिश्तेदार और बहुत मानव मलेरिया परजीवी पी. के एक आनुवंशिक पार प्रदर्शन से सस्ता है फाल्सीपेरम, जो nonhuman रहनुमा के संक्रमण की आवश्यकता है. आनुवंशिक पार की पुनः संयोजक संतान आनुवंशिक संबंध नक्शे के निर्माण के लिए और महत्वपूर्ण मलेरिया परजीवी के विकास, दवा प्रतिरोध, और डाह सहित लक्षण के मानचित्रण के लिए उपयोगी उपकरण हैं.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glyerolyte 57 solution	Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus	Charles River Laboratories		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum	Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution	Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit	Roche Group	11 796 828 001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine	Akorn Inc	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool	VWR international	32848-003
Glass capillary (1 μL)	VWR international	53440-001
Hemocytometer	VWR international	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer	VWR international	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL
SUPPLEMENTARY MATERIALS: Maintenance of laboratory mice Maintenance of laboratory mosquit–s Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Measurement of red blood cell density Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquit–s Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.