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Immunology and Infection

Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores

doi: 10.3791/2365 Published: January 3, 2011

Summary

Cruzamentos genéticos de parasitas da malária em roedores são realizadas, alimentando dois parasitas geneticamente distintas para os mosquitos. Progênie recombinante são clonados a partir de sangue do rato depois de permitir que mosquitos a morder camundongos infectados. Este vídeo mostra como produzir cruzamentos genéticos de

Abstract

Variação na resposta a drogas antimaláricas e na patogenicidade do parasita da malária é de importância biológica e médica. Mapas de ligação tem levado à identificação de genes de sucesso ou loci subjacentes vários traços em parasitas da malária em roedores e seres humanos 1-3 4-6. O parasita da malária Plasmodium yoelii é uma das espécies de malária muitos isolados de roedores silvestres Africano e foi adaptado para crescer em laboratórios. Esta espécie se reproduz muitas das características biológicas dos parasitas da malária humana; marcadores genéticos, tais como microssatélites e amplificado comprimento de fragmentos polimorfismo (AFLP) marcadores também têm sido desenvolvidos para o parasita 7-9. Assim, estudos genéticos em parasitas da malária em roedores podem ser realizadas para complementar a pesquisa sobre o Plasmodium falciparum. Aqui, nós demonstrar as técnicas para a produção de um cruzamento genético em P. yoelii que foram pela primeira vez foi pioneira pelos drs. David Walliker, Richard Carter, e colegas da Universidade de Edimburgo 10.

Cruzamentos genéticos em P. yoelii e outros parasitas da malária em roedores são conduzidas por infectando camundongos Mus musculus com um inóculo contendo gametócitos de dois clones geneticamente distintos que diferem em fenótipos de interesse e permitindo que mosquitos se alimentam de camundongos infectados quatro dias após a infecção. A presença de gametócitos masculinos e femininos no sangue do rato é microscopicamente confirmada antes da alimentação. Dentro de 48 horas após a alimentação, no intestino médio do mosquito, os gametócitos haplóides diferenciam em gametas masculinos e femininos, fertilize, e formar um zigoto diplóide (Fig. 1). Durante o desenvolvimento de um zigoto em um ookinete, meiose parece ocorrer 11. Se o zigoto é obtido através de fertilização cruzada entre os gametas dos dois parasitas geneticamente distintos, o intercâmbio genético (recombinação cromossômica e cross-overs entre as cromátides não irmãs de um par de cromossomos homólogos;. Fig. 2) pode ocorrer, resultando em recombinação de material genético de loci homólogos. Cada zigoto sofre sucessivas divisões dois nuclear, levando a quatro núcleos haplóides. Um ookinete desenvolve em um oocisto. Uma vez que os oocistos amadurece, milhares de esporozoítos (a descendência da cruz) são formados e libertados em hemoceal mosquito. Esporozoítos são colhidas das glândulas salivares e injetado em um novo hospedeiro murino, onde o desenvolvimento fase pré-eritrocítica e eritrocitárias ocorre. Formas eritrocitárias são clonados e classificados em relação aos personagens distinguir os genitores antes de mapas de ligação genética. Controle de infecções individuais clones parentais são realizadas da mesma forma como a produção de um cruzamento genético.

Protocol

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Técnicas de assepsia devem ser aplicados a todos os materiais que serão administrados em animais para evitar a introdução inadvertida de agentes infecciosos exógenos em camundongos que podem confundir os resultados experimentais.

1. Infecção de ratos de laboratório com sangue Parasitas estágio Malária

  1. À temperatura ambiente, descongelar dois frascos contendo o sangue congelado parasitas da malária etapa a ser atravessada. Neste exemplo, duas cepas de roedores parasita da malária Plasmodium utilizados são yoelii yoelii e Plasmodium nigeriensis yoelii.
  2. Fit uma seringa com uma agulha de calibre 22-30 (G) e elaborar 400 mL de estéril, de grau farmacêutico PBS (pH 7,4).
  3. Usando a mesma seringa, elaborar 100 L de sangue descongelados infectados; inverter a seringa para cima e para baixo até que o conteúdo é homogeneamente misturados. (Opcional: uma pipeta pode ser usado para transferir PBS e sangue infectado em um tubo de coleta antes de transferir para uma seringa para injeção).
  4. Injetar 200 mL contendo solução de parasita diretamente no peritônio de um mouse. Quando terminar, descarte a seringa em um recipiente para objectos cortantes. (Veja também materiais complementares para manutenção de ratos de laboratório). Em geral, o tamanho padrão do inóculo é entre 100-500 mL, dependendo dos níveis de infecção parasitária nos materiais originais congelados.
  5. Injetar a duas cepas do parasita a ser atravessado em dois camundongos cada. Camundongos se tornará positivo microscopicamente 3 a 5 dias após as injeções. Parasitemias, quando chegar entre 1-5%, continue para a próxima etapa.

2. Infecção Clone misto de Ratos

  1. Antes da infecção clone mista, coleta de sangue da cauda dos dois ratos doadores infectados com as cepas de parasitas diferentes para exame microscópico de esfregaços de sangue corados Giemsa fino (Fig. 3), e para a medição da densidade de células vermelhas do sangue (veja Materiais suplementares para as modalidades) .
  2. Calcular o volume de um soro fisiológico (1,5% w / v citrato trissódico, 0,85% w / v de cloreto de sódio) e do sangue do mouse necessários para produzir uma mistura de inóculo, utilizando a parasitemia e vermelho sangue medições de densidade de células obtidas anteriormente.
  3. Ajuste a solução de parasita para uma concentração final de um milhão de glóbulos vermelhos infectados por 100μl.
  4. Combine o sangue infectado de dois doadores na proporção de 1:1 para obter um inóculo misto clone. Quando os dois clones parentais diferem em taxa de crescimento, ajustar as proporções de um. Mais rápido crescimento dos pais para um clone de crescimento mais lento dos pais para 1:2 ou 1:5
  5. Injectar 100 mL da amostra misturada em peritônio de cada rato para ser infectado. (Ver também passo 3,9 para determinar o número de ratos a ser injetado)
  6. Usando este método, infectar dois ratos, cada um com as cepas única parental. As infecções de um único clone vai permitir a determinação da transmissão de sucesso das duas estirpes parentais.

3. Os mosquitos alimentação

  1. Prepare três gaiolas contendo 300-500 adultos (machos e fêmeas) Anopheles stephensi mosquitos cada, idade pós-emergência 5-7 dias a partir de pupas. Os recipientes são cobertos com panos seguro por um plástico ou tampa de metal. Duas gaiolas são para se alimentando de clones parental; a gaiola terceiro é para a preparação de um cruzamento genético.
  2. Começando quatro dias após a infecção mista-clone, prepare Giemsa-manchada manchas cauda fina de sangue dos camundongos infectados.
  3. Examine os esfregaços sob um microscópio de varredura por pelo menos 50 campos microscópicos, aumento de 1000x e determinar se gametócitos masculinos e femininos estão presentes.
  4. Gametócitos masculinos e femininos são reconhecíveis, devido à presença de grandes grânulos vacúolo e grandes (Fig. 3). Gametócitos masculinos e femininos têm citoplasma rosa e azul, respectivamente. Se gametócitos estão presentes, siga passo 3.6.
  5. Se gametócitos estão ausentes, manter acompanhamento diário até que eles apareçam. Se gametócitos estão presentes, continue o passo seguinte.
  6. Injetar 50 mL de anestésico cocktail de drogas contendo 33 mg / mL de ketamina e 3 mg / mL de xilazina no peritônio de um rato para anestesiar cada rato infectado (por 20 gramas de peso corporal do rato). Última dose de quetamina e xilazina é 82,5 e 7,5 mg / Kg, respectivamente.
  7. Coloque os ratos viradas para baixo no topo de uma gaiola contendo mosquitos adultos Anopheles stephensi que foram privadas de abastecimento de açúcar por 24 horas e permitir que os mosquitos se alimentam por 30 minutos sem interrupção.
  8. Manter os mosquitos em um insetário sob condições padrão (temperatura é mantida entre 24-26 ° C; também ver Métodos complementares para a manutenção do laboratório de mosquitos).
  9. Use um mouse infectados para cada 5-10 mosquitos fêmeas. Eutanásia os ratos imediatamente por deslocamento cervical após a alimentação, enquanto os ratos estão ainda sob anestesia.

4. Midg Mosquito dissecaruts e oocistos Contagem

  1. Nove dias após a alimentação, os mosquitos serão examinados para oocistos no intestino médio do inseto. A presença de oocistos na mosquitos que se alimentam de um único clone camundongos infectados indica que gametócitos das duas estirpes parentais são infecciosos.
  2. Para dissecar um intestino médio do mosquito, use um aspirador ligado a um pequeno recipiente para coletar 5-10 mosquitos infectados da jaula.
  3. Usando gás CO 2, anestesiar os mosquitos e transferi-los para uma placa de Petri de vidro em gelo. Separar e descartar mosquitos machos. As antenas dos machos são visivelmente bushier em comparação com as fêmeas.
  4. Preencher duas seringas com PBS e encaixá-los com 26 gauge de meia polegada (G ½) agulhas. Depósito de cerca de 100 mL de PBS a partir de uma seringa numa lâmina de vidro.
  5. Transferência 5-10 anestesiados mosquitos fêmeas para a gota de PBS e colocar o slide em um microscópio de dissecação.
  6. Usando a mesma agulha, remova cada mosquito asas e pernas e, em seguida, mantendo o inseto no abdômen, tórax posterior e, puxe o corpo sem até que o intestino médio, um corpo de saco branco, é liberado. Destacar o intestino médio e descartar o resto do corpo.
  7. Adicionar PBS mais no intestino médio se os slides estão secos. O intestino médio vão se degenerar se deixe secar. Coloque uma lamínula sobre o intestino médio.
  8. Examinar o intestino médio em microscópio de luz com uma ampliação de 100x. Contar o número de oocistos em cada intestino médio (Fig. 3). Oocistos são reconhecidas como de espessura de parede estruturas circulares que se encontram na superfície externa dos intestinos.
  9. Quando terminar, jogue de seringas, agulhas, e deslize em uma lata de farelos.
  10. Se oocistos são ausentes no intestino médio, alimentar os mosquitos com camundongos infectados com o maior número de gametócitos e dar um tempo mais longo de alimentação. Temperatura é fundamental para esta etapa. Certifique-se que a temperatura é de 24 a 26 ° C.

5. Coleta de esporozoítos de mosquitos por centrifugação

  1. Prepare tubos de coleta esporozoíto da seguinte forma: corte a tampa de um tubo de centrífuga de 0,5 mL limpo e faça um furo (0,1-0,2 mm de diâmetro) na parte inferior do tubo usando uma agulha G flamed 19.
  2. Preencha 1 / 3 do tubo com lã de vidro. Insira o tubo de filtro para um tubo de coleta de 1,5 mL (um tubo é suficiente para colheita de esporozoítos ~ 100 mosquitos)
  3. No dia da alimentação pós-17, coletar mosquitos (Etapa 4) das gaiolas em um pequeno frasco com um aspirador.
  4. Uso do gás CO 2 para anestesiar os mosquitos.
  5. Separar as fêmeas dos mosquitos do sexo masculino. Transferir os mosquitos anestesiados feminino do recipiente para uma placa de Petri de vidro em gelo.
  6. Prepare duas seringas com agulhas 26 G ½ cheio de PBS. Depósito de cerca de 100 mL de PBS a partir de uma seringa numa lâmina de vidro.
  7. Transferir os mosquitos em uma lâmina de microscópio. Retire a cabeça dos mosquitos, as asas, pernas e abdômen com um microscópio de dissecação.
  8. Usando uma pinça de ponta fina transferir o tórax em 0,5 mL de PBS em um homogeneizador de 1,5 mL (pilão). Armazenar o tórax no gelo (esporozoíto permanece infectante por 2-3 h).
  9. Homogeneizar o tórax no gelo para liberar esporozoítos das glândulas salivares (ver Figura 3), e transferir os lisados ​​(homogeneizados) para dentro do tubo preenchido com lã de vidro (Passo 5,1-5,2), utilizando uma pipeta de vidro.
  10. Centrifugar por 10 a 20 segundos a 1000 rpm em temperatura ambiente.
  11. Recolher o fluxo através de (a suspensão esporozoíto purificada) usando uma seringa com uma agulha G 22-30. (Opcional: queda de 10-50 mL do fluxo através de uma lâmina de microscópio, coloque uma tampa de deslizamento e visualizar os esporozoítos viver sob um microscópio de luz padrão, 400X ampliação, ver também Fig. 3)
  12. Injetar 0,1-0,5 mL ip da suspensão esporozoíto em camundongos (até 200.000 parasitas podem ser colhidas a partir de um único mosquito, ver ref 12). Em um caso bem sucedido, o animal infectado 72 horas após a injeção.

6. Progeny clonagem usando diluição Limitada

  1. Setenta e duas horas após as injeções esporozoíto, coleta de sangue da cauda dos dois ratos doadores infectados com as cepas de parasitas diferentes para exame microscópico após Giemsa coloração de sangue fino e para a medição da densidade de células vermelhas do sangue (veja Materiais suplementares para as modalidades).
  2. Escolha um rato mostrando uma parasitemia 0,1 a 1% e cujos glóbulos vermelhos infectados contêm parasitas maioria simples como um doador para o procedimento de clonagem. Repita o passo 6,1 dia seguinte, se os ratos são microscopicamente negativo. Se os animais não estão infectados dentro de 14 dias, repita o Passo 2 a 5 e determinar a presença de esporozoítos no passo 5.11).
  3. Diluir o sangue colhido da cauda em uma solução fria 1:01 de solução Ringer bezerro soro e mamíferos de (2,7 mM de cloreto de potássio, cloreto de cálcio 1,8 mM, 154 mM cloreto de sódio), de modo a atingir um conconcentração de 0,6 a 1 glóbulo vermelho infectado por 100 mL, e armazenar o inóculo no gelo. Desta forma, a maioria do mouse indivíduo deve receber um ou zero parasitas.
  4. Por via intravenosa, injectar 100 mL de sangue infectado diluído em cada um dos 5-10 ratos.
  5. Cinco a sete dias depois, a tela do camundongos para a presença de parasitas no sangue estágio examinando Giemsa-manchada esfregaços de sangue fina. Em um experimento bem sucedido, 20-50% dos camundongos infectados e mostrará parasitemia de 0,1-5,0% no dia após a infecção 8.

7. Caracterização da Progeny usando Marcadores Genéticos

  1. Coletar 20-40 mL de sangue da cauda do rato em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contém 0,2 mL de solução de citrato refrigerados salina fisiológica, brevemente vortex e centrifugar por 3 min a 3000 rpm em temperatura ambiente para agregar as células do sangue. Extrair DNA imediatamente ou manter o pellet a -80 ° C.
  2. Prepare DNA do parasita usando qualquer padrão de métodos de extração de DNA. Para o isolamento rápido de DNA, usar um modelo de alta Pure PCR preparação kit (Roche Applied Bioscience).
  3. Progênie recombinante são identificados após genotipagem utilizando microssatélites (MS) ou polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em cromossomos diferentes que podem diferenciar as duas estirpes parentais da cruz genética. Um método simplificado utilizando primers fluorescentes único marcado para MS genotipagem de P. yoelii pode ser utilizado (ver ref 8,9).

8. Criopreservação de parasitas da malária do sangue estágio

  1. Coletar 0,5-1 mL de sangue infectado por punção cardíaca a partir de um rato anestesiado com parasitemia de 5-20% em 50-10 mL refrigeradas solução salina fisiológica.
  2. Centrifugar por 5 min a 2000 rpm em temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante.
  3. Adicione gota a gota, o volume 2x de Glycerolyte solução 57 (Fenwal Laboratories) para pelotas de sangue e misture bem.
  4. Transferir a suspensão para criotubos (0,2-0,5 mL por tubo).
  5. Armazenar o sangue criopreservados a -80 ° C (até 1 mês) ou em nitrogênio líquido.

9. Resultados representativos:

Em uma experiência bem sucedida, 5-10% das linhas clonadas serão progênie recombinante independente.

Figura 1
Figura 1. A representação esquemática do ciclo de vida e eventos de recombinação genética durante um cruzamento genético. Eventos de recombinação genética ocorrem durante a fase inicial de desenvolvimento do mosquito. Após a fecundação de "haplóide" gametas masculinos e femininos de diferentes origens genéticas no intestino médio do mosquito, "diplóide" zigotos são formadas. O zigoto constitui a fase diplóide apenas do ciclo de vida do parasita; meiose segue dentro de 12 horas de fecundação, e todas as fases subsequentes do mosquito e mamíferos permanecem haplóides. Os zigotos resultantes desenvolver em ookinetes e oocistos. Crescimento e divisão mitótica de cada oocisto produz milhares de esporozoítos, que são liberados na hemoceal mosquitos. Os esporozoítos que migram para as glândulas salivares estão em posição de ser transmitido a um hospedeiro mamífero, onde o desenvolvimento do fígado e estágios de glóbulos vermelhos ocorre. Durante o curso dos ciclos de células vermelhas do sangue, alguns parasitas podem se diferenciar em madura gametócitos masculinos e femininos. O ciclo de vida do parasita se completa quando esses gametócitos são captados por um outro mosquito de transmissão, perpetuando.

Figura 2
Figura 2. Herança de genes nucleares em parasitas da malária e produção de progênie recombinante. Recombinação genética pode ser gerado através de rearranjo cromossômico ou por eventos crossover. Progênie homozigota produzido por autofecundação entre gametas de um mesmo clone parental 1 ou 2 (A e D), respectivamente. B) progênie heterozigóticas produzido por fertilização cruzada entre os gâmetas de dois diferentes clones dos pais, núcleos recombinante (ovais azuis) sendo formado por rearranjo cromossômico sozinho. C) progênie heterozigóticas produzido a partir de fertilização cruzada entre os gametas dos dois clones pai diferente, núcleos recombinante (ovais vermelho) sendo formada por crossovers entre as cromátides não-irmãs dos cromossomos homólogos.

Figura 3
Figura 3. Morfologia do parasita da malária Plasmodium roedores yoelii. A) fase de anel, B) trofozoíto, C) esquizonte, D) merozoítos, E) gametócitos macho imaturo, F) gametócitos maduros do sexo masculino, G) gametócitos femininos imaturos, H) gametócitos maduros do sexo feminino, I) do intestino médio com oocistos no post dia 10 alimentação (oocistos maduros indicado por setas; aumento de 200x), J) mosquito glândulas salivares (100x), K) esporozoítos (400x de ampliação).

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Discussion

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Demonstramos as técnicas para a produção de um cruzamento genético no roedor da malária Plasmodium yoelii, que também é aplicável à produção de cruzamentos genéticos em malárias outros roedores. Infecções de camundongos com único clones parentais são normalmente realizados para determinar a transmissão bem sucedida dos parasitas dos pais para garantir que os pais são competentes em produzir gametas funcionais antes de realizar uma cruz.

Transmissão bem-sucedida através de um mosquito é influenciado por múltiplos fatores, incluindo temperatura do insetário, as espécies de parasitas da malária em roedores utilizados, e as doses de sangue-estágio do parasita (tamanho do inóculo). Enquanto que a transmissão de P. berghei é normalmente realizado a 19-21 ° C 13, a transmissão de P. yoelii e P. chabaudi é realizada rotineiramente em 23-25 ​​° C 14. Ookinetes de P. berghei não se desenvolvem em oocistos a temperaturas inferiores a 16 ° C ou superior a 24 ° C 15. Além da temperatura, o tamanho do inóculo pode influenciar a taxa de multiplicação dos parasitas da malária no sangue. Embora as injeções de um tamanho grande inóculo (5 x 10 6 iRBC ou mais) maior rendimento de parasitemia em fases muito iniciais da infecção, não leva necessariamente a um maior número de gametócitos ou superior a infecciosidade aos mosquitos. Gadsby e outros (2009) 16 mostraram que gametócitos de P. chabaudi adami estão presentes no sangue do dia 3 ao dia 20 (pico no dia 13) após a infecção de 1 x 10 6 iRBC, no entanto, dias após a infecção 6 é a única dia em que os mosquitos infectados. Além disso, a administração de um tamanho grande inóculo das cepas do parasita de crescimento rápido e virulenta, como clones N67 (nigeriensis), 17XL, e YM de P. yoelii, clone ANKA de P. berghei, e DS clone de P. chabaudi adami muitas vezes resulta em anemia grave e patologia em camundongos, o que pode causar uma queda significativa da temperatura corporal do rato. Como resultado, ratos tornam-se menos infectantes aos mosquitos (observações não publicadas). No entanto, a transmissão de parasitas da malária em roedores tem sido conduzido com um tamanho de inóculo padrão (10 6 iRBC). Verificou-se que o P. berghei e P. yoelii são transmissíveis aos mosquitos dos dias 3-5 após a infecção do sangue estágio induzida em camundongos 17, enquanto que P. chabaudi chabaudi e P. chabaudi adami só são transmissíveis aos mosquitos no dia 6, após estágio de sangue induzida por infecções em camundongos 16, 18.

Fatores que influenciam a produção de progênie recombinante incluem as proporções de gametócitos das duas estirpes parentais em camundongos. Em teoria, a produção máxima de progênie recombinante ocorre quando gametócitos de ambos os sexos dos clones parentais são em igual número e autofecundação e fecundação cruzada ocorre na mesma freqüência. Sob esta condição, metade dos zigotos resultantes serão híbridos eo restante será composto de proporções iguais das duas linhas clone parental. Produção de clones de progênie recombinante será bastante reduzido quando a proporção de gametócitos é inclinado para um clone dos pais, levando a desproporcional auto-fertilização. Além disso, parasitas geralmente têm diferentes taxas de crescimento e pode ter capacidade de diferentes na produção de gametócitos 16, 19. Portanto, é necessário otimizar as proporções de parasitas dos pais na mistura a ser injetada em camundongos para alimentar mosquito.

O tempo para clonar parasitas do sangue após a alimentação do mosquito é também um factor importante a considerar. É preferível para clonar a progênie do cruzamento genético quando parasitemia é entre 0,1-1,0% (antes de tempo com inúmeros ciclos de replicação no sangue) para evitar clonagem de clones duplicados. Fast-parasitas ou de crescimento lento, pode sair em grande número em determinados períodos de tempo, e clonagem nos picos de parasitas rápido ou lento crescimento vai acabar com clones de ter os mesmos fenótipos.

Em conclusão, realizando cruzamentos genéticos utilizando parasitas da malária em roedores é relativamente fácil e muito mais barato do que realizar um cruzamento genético do parasita da malária humana P. falciparum, o que exige a infecção de um primata não-humano. Recombinante progênie dos cruzamentos genéticos são ferramentas úteis para a construção de mapas genéticos e mapeamento de importantes traços da malária, incluindo o desenvolvimento de parasitas, resistência a drogas, e virulência.

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Disclosures

Porque os autores são funcionários do governo e este é um trabalho do governo, a obra está no domínio público nos Estados Unidos. Independentemente de quaisquer outros acordos, o NIH se reserva o direito de fornecer o trabalho para PubMedCentral para exibição e utilização pelo público, e pode PubMedCentral tag ou modificar o trabalho consistente com as suas práticas habituais. Você pode estabelecer direitos fora do assunto dos EUA para uma licença de uso do governo.

Acknowledgments

Agradecemos Drs. Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare e Tovi Lehman para a leitura crítica dos manuscritos. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Pesquisa Intramural da Divisão de Pesquisa intramuros, Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, dos Institutos Nacionais de Saúde e pelo Programa Nacional de Pesquisa 973 Básico da China, # 2007CB513103. Agradecemos a NIAID intramural editor Brenda Rae Marshall para a assistência.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glyerolyte 57 solution Cenmed 4A7833
Mouse Mus musculus Charles River Laboratories Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum Invitrogen 26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution Invitrogen 10010-072 pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1) MR4 MRA-593 deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67 MR4 MRA-427 deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi MR4 MRA-128 deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter Nexcelom Bioscience Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer Nexcelom Bioscience Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit Roche Group 11 796 828 001
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified Sigma-Aldrich GS500
Ketamine hydrochloride Fort Dodge Animal Health NDC 0856-2013-01 Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride Sigma-Aldrich P5405 Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S4641
Xylazine Akorn Inc 4811-20ml Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool VWR international 32848-003
Glass capillary (1 μL) VWR international 53440-001
Hemocytometer VWR international 15170-168 Complete chamber set
Homogenizer VWR international KT749520-0090 Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

  • Maintenance of laboratory mice
  • Maintenance of laboratory mosquit–s
  • Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
  • Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquit–s

Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.

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References

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Protocolo para produção de uma Cruz genética do parasita da malária de roedores
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Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).More

Pattaradilokrat, S., Li, J., Su, X. Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites. J. Vis. Exp. (47), e2365, doi:10.3791/2365 (2011).

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