Протокол по производству Генетические Креста Паразиты грызунов малярией

Summary

Генетические кресты паразитов малярии грызунов проводится путем подачи двух генетически различных паразитов комаров. Рекомбинантный потомства клонированных из крови мышей после учета комары кусать зараженных мышей. Это видео показывает, как производить генетические кресты

Abstract

Изменения в ответ на противомалярийных препаратов и патогенность малярийных паразитов имеет биологическую и медицинскую значимость. Связь отображение привело к успешной идентификации генов или локусов лежащий в основе различные черты в малярийных паразитов грызунов и человека ^{1-3 4-6.} Малярийного паразита Plasmodium yoelii является одним из многих видов малярии, изолированных от диких африканских грызунов и была адаптирована для роста в лабораториях. Этот вид воспроизводит многие биологические характеристики человека малярийных паразитов; генетических маркеров, таких как микроспутник и усиливаются полиморфизма длины фрагмента (AFLP) маркеры были также разработаны для паразита ^7-9. Таким образом, генетические исследования возбудителя малярии грызунов могут быть выполнены в дополнение к исследованиям на Plasmodium тропической. Здесь мы демонстрируем методы получения генетического крест в P. yoelii, что впервые были пионерами докторами. Дэвид Walliker, Ричард Картер, и его коллеги из Эдинбургского университета ^10.

Генетические крестов в P. yoelii и других паразитов малярии грызунов проводятся путем заражения мышей Mus мышцы с посевной содержащие гаметоциты двух генетически различных клонов, отличающихся фенотипов интереса и позволяя комаров кормить на зараженных мышей через 4 дня после инфицирования. Наличие мужского и женского гаметоциты в кровь мыши микроскопически подтверждено перед кормлением. В течение 48 часов после кормления, в средней кишке комаров, гаплоидный гаметоциты дифференцироваться в мужской и женской гамет, удобрять и образуют диплоидные зиготы (рис. 1). Во время развития зиготы в ookinete, мейоз появляется происходить ^11. Если зиготы происходит через перекрестное опыление между гаметы из двух генетически различных паразитов, генетический обмен (хромосомная рекомбинации и кроссоверов между не-сестринских хроматид из пары гомологичных хромосом;. Рис. 2) может иметь место, в результате рекомбинации генетического материала на гомологичных локусов. Каждая зигота претерпевает два последовательных делений ядра, что приводит к четыре гаплоидных ядер. Ookinete дальнейшем перерастает в ооцисты. После ооцисты созревает, тысячи спорозоитов (потомство крест) формируются и выпущены в hemoceal комара. Спорозоиты собирают из слюнных желез и вводят новые мышиные хозяин, где пре-эритроцитарных и эритроцитарных этапе развития имеет место. Эритроцитарных форм клонируются и классифицируются исходя из отличительных символов родительских линий до генетического картирования связи. Управление инфекций индивидуальных родительских клонов выполняются таким же образом, как производство генетической крест.

Protocol

Асептический методы должны применяться ко всем материалам, которые будут администрируемых в животных, чтобы избежать случайного введения экзогенных инфекционных агентов в организм мышей, которые можно смешивать экспериментальных результатов.

1. Заражение лабораторных мышей с кровью стадии малярийных паразитов

1. При комнатной температуре таяния флаконах, содержащих по два замороженных паразитов этапе крови малярии должны быть скрещены. В этом примере два грызуна штаммы малярийного паразита Plasmodium используются yoelii yoelii и Plasmodium yoelii nigeriensis.
2. Fit шприц с 22-30 колеи (G) иглы и составить 400 мкл стерильной, фармацевтического класса PBS (рН 7,4).
3. Используя тот же шприц, составляет 100 мкл талой инфицированной крови; инвертировать шприцем вверх и вниз, пока содержание однородно смешанные. (Дополнительно: пипетка может быть использована для передачи PBS и инфицированная кровь в пробирку, до перевода в шприц для инъекций).
4. Inject 200 мкл раствора, содержащего паразита непосредственно в брюшной полости мыши. Когда закончите, удалите шприц в мусорном ведре острых предметов. (См. также дополнительные материалы для обеспечения лабораторных мышей). В общем, стандартный размер посевной между 100-500 мкл, в зависимости от уровня паразитных инфекций в оригинальном замороженных материалов.
5. Inject два паразита штаммов для пересекли границу двух мышей в каждой. Мыши станет положительным микроскопически от 3 до 5 дней после инъекции. Когда parasitemias руки между 1-5%, переходите к следующему шагу.

2. Смешанные инфекции клонов мышей

1. До смешанной инфекции клон, собирают кровь из хвоста два донора мышей, зараженных различными штаммами паразита для микроскопического исследования по Гимза окрашенных тонких мазков крови (рис. 3), а также для измерения плотности красных клеток крови (см. дополнительные материалы для детальных процедур) .
2. Рассчитайте объем физиологического раствора (1,5% вес / тринатрия цитрат, 0,85% вес / хлорид натрия) и мышь крови, необходимых для производства посевной смеси с использованием паразитемии и красных кровяных телец измерения плотности, полученной ранее.
3. Отрегулируйте паразита решение конечной концентрации одного миллиона инфицированных эритроцитов в 100 мкл.
4. Комбинат инфицированной крови от двух доноров в соотношении 1:1 для получения смешанного клон посевной. Когда два родительских клонов различаются по скорости роста, регулировать пропорции быстрорастущих родительской к медленно развивающихся родительских клонов до 1:2 или 1:5.
5. Inject 100 мкл смешанного образца в брюшину каждой мыши, чтобы быть инфицированы. (См. также шагом 3,9, чтобы определить количество мышей для инъекций)
6. Используя этот метод, заразить две мыши каждый с одним родительских штаммов. Одно-клон инфекции позволит определение об успешной отправке двух родительских штаммов.

3. Кормление Комары

1. Подготовка три клетки содержащие 300-500 взрослых (мужчины и женщины) Anopheles stephensi комаров каждый, возраст 5-7 дней после выхода из куколки. Контейнеры покрыты сеткой безопасности по пластиковой или металлической крышкой. Два Клетки для кормления по уходу за ребенком клонов, третья клетка для подготовки генетического крест.
2. Начиная через четыре дня после смешанного клон инфекции, подготовить Гимза окрашенных мазках тонкий хвост крови от зараженных мышей.
3. Изучение мазков под микроскопом путем сканирования не менее 50 микроскопических полей на увеличение 1000x и определить, насколько мужчина и женщина гаметоциты присутствуют.
4. Мужские и женские гаметоциты узнаваемы благодаря наличию больших вакуолей и крупные гранулы (рис. 3). Мужские и женские гаметоциты имеют розовый и голубой цитоплазмы, соответственно. Если гаметоциты присутствуют, следуйте шагу 3.6.
5. Если гаметоциты отсутствуют, держать мониторинг в день, пока они появляются. Если гаметоциты присутствуют, продолжить следующий шаг.
6. Inject 50 мкл анестезии препарат коктейлем, содержащим 33 мг / мл кетамина и 3 мг / мл ксилазина в брюшины мыши обезболить каждого инфицированного мыши (за 20 грамм массы тела мыши). Заключительные дозу кетамина и ксилазина это 82,5 и 7,5 мг / кг, соответственно.
7. Место мышей лицом вниз на верхней части клетки содержащие взрослых комаров Anopheles stephensi, которые голодали сахара поставки в течение 24 часов и позволить комаров кормить в течение 30 минут без перерыва.
8. Поддерживать комаров в insectary в стандартных условиях (температура поддерживается между 24-26 ° C, см. также дополнительные методы для обеспечения лаборатории комаров).
9. Используйте один зараженный мыши для каждого 50-100 самок комаров. Усыпить мышей сразу шейки дислокации после кормления в то время как мыши все еще под наркозом.

4. Пройдя Mosquito MidgОТС и подсчет ооцист

1. Через девять дней после кормления, комары будут рассмотрены на ооцист в средней кишки насекомого. Наличие ооцист в комаров, которые питаются одним клоном инфицированных мышей показывает, что гаметоциты из двух родительских штаммов являются инфекционные.
2. Чтобы вскрыть комара кишки, используйте аспиратор подключен к небольшой контейнер для сбора от 5 до 10 инфицированных комаров из клетки.
3. Использование CO ₂ газ, обезболить комаров и передачи их в стеклянной посуде Петри на льду. Отдельный и отбросить мужской комаров. Антенны самцов заметно bushier по сравнению с самками.
4. Заполните два шприца с PBS и вписать их в 26 калибр полдюйма (G ^½) иглы. Депозит около 100 мкл PBS из шприца на предметное стекло.
5. Передача от 5 до 10 наркозом самок комаров на каплю PBS и место скользить по рассекает микроскопом.
6. Используя те же иглы, удалить крылья каждого комара и ноги, затем, держа насекомых в брюшной полости грудной клетки и задней, вытащить тело на части, пока кишки, белый мешок типа тела, не будет отпущена. Отсоедините кишки и отбросить остальные части тела.
7. Добавить еще PBS на средней кишки, если слайды сухие. Средняя кишка будет вырожденной, если позволяют высушить. Место крышка скользить по midguts.
8. Изучить midguts под световым микроскопом при увеличении 100х. Граф количество ооцист в каждой средней кишки (рис. 3). Ооцисты узнаваем как толстостенных кольцевые структуры, которые лежат на внешней поверхности midguts.
9. Когда закончите, распоряжаться шприцы, иглы и слайд бен острых предметов.
10. Если ооцисты отсутствуют в midguts, кормить комаров с зараженных мышей с большим числом гаметоциты и дать больше время кормления. Температура имеет решающее значение для этого шага. Убедитесь, что температура установлена ​​на уровне от 24 до 26 ° C.

5. Сбор Спорозоиты от комаров с помощью центрифугирования

1. Подготовка спорозоита труб коллекцию следующим образом: вырезать крышку чистой 0,5-мл центрифужную пробирку и пробить отверстие (0,1-0,2 мм в диаметре) в нижней части трубки использованием пылали 19 G иглу.
2. Заполните 1 / 3 от трубка со стеклянной ваты. Вставьте фильтр трубки в 1,5-мл пробирки (одна труба достаточно урожая спорозоитов от ~ 100 комаров)
3. На 17-й день после кормления, собирают комаров (Шаг 4) из клетки в небольшом контейнере с помощью аспиратора.
4. Использование CO ₂ газ обезболить комаров.
5. Отдельные женщины из мужской комаров. Передача под наркозом самок комаров из контейнера на стеклянном блюде Петри на льду.
6. Приготовьте два шприца с 26 G ^½ игл заполнены PBS. Депозит около 100 мкл PBS из шприца на предметное стекло.
7. Передача комаров на предметное стекло. Удалить комаров головы, крыльев, ног и живота при вскрытии микроскопом.
8. Использование с острым концом щипцов передачи thoraxes в 0,5 мл PBS в 1,5-мл гомогенизатора (ступку и пестик). Магазин thoraxes на льду (спорозоита остается инфекционным в течение 2-3 ч).
9. Однородный thoraxes на лед, чтобы освободить от спорозоитов слюнных желез (см. Рисунок 3), и передача лизаты (гомогенатах) в трубки, заполненной стекловатой (шаг 5.1-5.2) с использованием стеклянной пипетки.
10. Центрифуга от 10 до 20 сек при 1000 оборотов в минуту при комнатной температуре.
11. Сбор проточные (суспензия очищенного спорозоита), используя шприц с иглой 22-30 G. (Дополнительно: падение 10-50 мкл проточные на микроскопический слайд, место покровное стекло и визуализации живых спорозоитов под стандартный световой микроскоп, 400X увеличение, см. также рис 3)
12. Inject ф 0,1-0,5 мл суспензии в спорозоита мышей (до 200,000 паразиты могут быть собраны из одного комара; см. ссылку 12). В случае успеха, животные будут инфицированы 72 часов после инъекции.

6. Клонирование Потомство использованием ограниченной Разбавление

1. Семьдесят два часа после инъекции спорозоита, собирают кровь из хвоста два донора мышей, зараженных различными штаммами паразита для микроскопического исследования после Гимза окрашивания тонких мазков крови и для измерения плотности красных клеток крови (см. дополнительные материалы для детальных процедур).
2. Выберите мышью отображения 0,1 до 1% паразитемии и чьи инфицированные эритроциты содержат в основном одно паразитов в качестве донора для клонирования. Повторите шаг 6,1 ближайшие дни, если мышей микроскопически отрицательным. Если животные не заражены в течение 14 дней, повторите шаг 2 до 5 и определить наличие спорозоитов в шаге 5.11).
3. Развести собрано хвост крови в холодной 1:01 Решение Решение телячьей сыворотки и млекопитающих Рингера (2,7 мМ хлористого калия, 1,8 мМ хлорида кальция, 154 мМ хлорида натрия), чтобы достичь конконцентрации от 0,6 до 1-инфицированных эритроцитов на 100 мкл, и хранить посевной на льду. Таким образом, большинство индивидуальных мыши должны получить один или нулевой паразитов.
4. Внутривенно вводят по 100 мкл разбавленного инфицированной крови в каждой от 50 до 100 мышей.
5. Через пять-семь дней спустя, экран мышей на наличие паразитов крови стадии рассмотрения Гимза окрашенных тонких мазков крови. В успешный эксперимент, 20-50% мышей заразиться и покажет паразитемии в 0,1-5,0% в 8-й день после заражения.

7. Характеристика Потомство использованием генетических маркеров

1. Соберите 20 до 40 мкл крови мышей хвост в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку, содержащую 0,2 мл охлажденного физиологического солевого раствора цитрата, вихревые кратко, а центрифуги в течение 3 мин при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре до гранул кровяных клеток. Извлечение ДНК сразу или хранить гранулы при температуре -80 ° C.
2. Подготовка паразита ДНК, используя любые стандартные методы выделения ДНК. Для быстрого изолирования ДНК, использование особо чистых шаблон ПЦР подготовка комплекта (Рош Прикладные Bioscience).
3. Рекомбинантный потомства определены после генотипирования использованием микроспутников (МС) или одиночных нуклеотидных полиморфизма (SNP) на разных хромосомах, которые могут дифференцироваться два родительских штаммов генетическая крест. Упрощенный метод с использованием одного флуоресцентного меченных праймеров для MS генотипирования П. yoelii могут быть использованы (см. 8,9).

8. Криоконсервация крови стадии малярийных паразитов

1. Сбор 0,5-1 мл инфицированной крови пункции сердца с наркозом мышь с паразитемии 5-20% в 5-10 мл охлажденного физиологического раствора.
2. Центрифуга в течение 5 мин при 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре. Удалите супернатант.
3. По каплям добавить 2x Объем Glycerolyte 57 решения (Fenwal Laboratories) на крови гранул и хорошо перемешать.
4. Передача подвески cryotubes (0,2-0,5 мл на трубку).
5. Магазин криоконсервированных крови при температуре -80 ° С (до 1 месяца) или в жидком азоте.

9. Представитель Результаты:

В успешный эксперимент, 5-10% от клонированных линий будет независимым рекомбинантный потомства.

Рисунок 1. Схематическое изображение жизненного цикла и генетической рекомбинации событий во время генетические крест. Генетическая рекомбинация события происходят на ранней стадии развития в организме комара. После оплодотворения "гаплоидных" мужской и женской гамет различных генетических опытом работы в средней кишке комара ", диплоидные" зиготы формируются. Зигота представляет собой лишь этап диплоидных жизненного цикла паразита; мейоза следует в течение 12 часов оплодотворения, и все последующие этапы комаров и млекопитающие остаются гаплоидными. В результате зиготы развиваются в ookinetes и ооцисты. Рост и митотического деления каждого ооцисты производит тысячи спорозоитов, которые высвобождаются в hemoceal комаров. Те, спорозоиты, что переход на слюнные железы находятся в состоянии быть переданы млекопитающего, где развитие печени и красные клетки крови этапах происходит. В ходе красный циклы клеток крови, некоторые паразиты могут дифференцироваться в зрелые мужские и женские гаметоциты. Цикл паразита жизнь заканчивается, когда эти гаметоциты принимаются к другой комар, увековечивая передачи.

Рисунок 2. Наследование ядерных генов в малярийных паразитов и производстве рекомбинантных потомства. Генетическая рекомбинация может быть собрана хромосомных рекомбинации или кроссовер событий. Гомозиготные потомства производства самоопыления между гамет одного и того же родительского клона 1 или 2 (и D), соответственно. Б) Гетерозиготные потомства производства взаимообогащения гаметы двух различных родительских клонов, рекомбинантный ядер (синий овал) формируется путем хромосомного рекомбинации в одиночку. С) Гетерозиготные потомство производится из взаимообогащения гаметы двух различных клонов родителей, рекомбинантный ядер (красный овал) формируется путем пересечения между не-сестринских хроматид гомологичных хромосом.

Рисунок 3. Морфология грызунов малярийного паразита Plasmodium yoelii. ) Кольцо этапе, В) трофозоит, С) шизонта, D) мерозоиты, Е) незрелые мужчины гаметоцит, F) зрелых мужчин гаметоцит, G) незрелых женщин гаметоцит, H) взрослая самка гаметоцит, I) кишки с ооцист на 10 день после кормления (зрелых ооцист указаны стрелками; 200x увеличение), J) слюнные железы комара (100x увеличение), К) спорозоитов (400x увеличение).

Discussion

Мы демонстрируем методы для производства генетических крест грызунов малярии Plasmodium yoelii, которое также применимо к производству генетического кресты и в других малярии грызунов. Инфекции мышей с одной родительской клоны, как правило, проводится для определения успешной передачи родительских паразитов, чтобы родители компетентных в производстве функциональных гамет перед выполнением крест.

Успешная передача через комара зависит от нескольких факторов, включая температуру insectary, виды грызунов малярийных паразитов используются, и дозы крови стадии паразита (посевной размера). Хотя передача П. berghei, как правило, достигается при 19-21 ° C ^13, передача П. yoelii и П. chabaudi регулярно проводились при 23-25 ​​° C ^14. Ookinetes П. berghei не развиваться в ооцист при температуре ниже 16 ° С или выше 24 ° C ^15. В дополнение к температуре, размер посевной может влиять на скорость размножения малярийных паразитов в крови. Хотя инъекции больших размеров посевной (5 х 10 ⁶ iRBC или больше) дают более высокие паразитемии на очень ранних стадиях инфекции, это не обязательно приведет к увеличению количества гаметоциты или выше инфекционности для комаров. Гадсби и др. (2009) ¹⁶ показал, что гаметоциты П. chabaudi Адами присутствуют в крови с первого дня от 3 ​​до 20-й день (в часы пик на 13-й день) после заражения 1 х 10 ⁶ iRBC, однако, день 6 после заражения является единственным день, в который комары заражаются. Кроме того, администрация большой размер посевной быстрорастущих и вирулентных штаммов паразитов, таких как клоны N67 (nigeriensis), 17XL, и Ю. М. П. yoelii, клон ANKA П. berghei, а клон DS П. chabaudi Адами часто приводит к тяжелой анемии и патологии у мышей, которая может вызвать значительное падение температуры тела мыши. В результате, мыши стали менее инфекционного для комаров (неопубликованные данные). Тем не менее, передача малярии паразиты грызунов была проведена с стандартного размера посевной (10 ⁶ iRBC). Было установлено, что П. и П. berghei yoelii могут передаваться комарами от нескольких дней от 3 ​​до 5, после крови стадии вызванной инфекции у мышей ^17, в то время как П. chabaudi chabaudi и П. chabaudi Адами только передаваться комарами на 6 день после крови этапе вызванных инфекциями в ^{16 мышей, 18.}

Факторы, влияющие на производство рекомбинантных потомков включают пропорции гаметоцитов двух родительских штаммов на мышах. В теории, максимум продукции рекомбинантных потомков происходит, когда гаметоциты обоего пола родительских клонов находятся в равном количестве и самоопыление и перекрестное опыление происходит на той же частоте. При этом условии, половина из зиготы в результате будут гибриды, а остальная часть будет состоять из равных пропорциях из двух родительских линий клона. Получение рекомбинантных клонов потомства будет значительно снижается, когда доля гаметоциты смещен в сторону одного родительского клона, что приводит к непропорционально самоопыление. Кроме того, паразиты часто имеют различные темпы роста и может иметь различные возможности в производстве гаметоциты ^{16, 19.} В связи с этим необходимо оптимизировать пропорции родительского паразитов в смесь вводят в мышей для комаров кормления.

Времени, чтобы клонировать паразитов из крови комара после кормления, также является важным фактором для рассмотрения. Желательно, чтобы клонировать потомства генетическую креста, когда паразитемии составляет от 0,1-1,0% (до слишком много циклов репликации в крови), чтобы избежать клонирования дублируется клонов. Быстро или медленно растущие паразиты могут выходить в большом количестве в определенные периоды времени, и клонирование в максимумах быстро или медленно растущие паразиты в конечном итоге с клонами одного и того же фенотипы.

В заключение, выполнение генетических кресты использовании паразитов малярии грызунов относительно легко и намного дешевле, чем выполнение генетических крест человека малярийного паразита P. тропической, которая требует заражения приматов. Рекомбинантный потомства генетическую кресты являются полезными инструментами для построения генетических карт связи и для отображения важной малярийного паразита в том числе черты развития лекарственной устойчивости и вирулентности.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glyerolyte 57 solution	Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus	Charles River Laboratories		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum	Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution	Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium y–lii y–lii 17XNL(1.1)	MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium y–lii nigeriensis N67	MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi	MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter	Nexcelom Bioscience	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit	Roche Group	11 796 828 001
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified	Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine	Akorn Inc	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool	VWR international	32848-003
Glass capillary (1 μL)	VWR international	53440-001
Hemocytometer	VWR international	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer	VWR international	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL
SUPPLEMENTARY MATERIALS: Maintenance of laboratory mice Maintenance of laboratory mosquit–s Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Measurement of red blood cell density Maintenance of laboratory mice Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Maintenance of laboratory mosquit–s Mosquit–s are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium y–lii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquit–s are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm3 open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging. Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 107 infected RBC intraperitoneally or 106 infected RBC intravenously. Measurement of red blood cell density Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as "in" if it overlaps the top or right lines and "out" if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the "red blood cell" option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.