Summary
हम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के माध्यम से डीएनए प्रतिकृति करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन. थर्मल संवहन बनाए रखने के द्वारा लगातार तापमान पर रिएक्टर की सतहों का विरोध denaturing, annealing, और विस्तार की स्थिति के बीच लगातार शटल अभिकर्मकों के लिए इस्तेमाल है. यह स्वाभाविक सरल डिजाइन करने के लिए तेजी से पीसीआर और अधिक सुलभ बनाने का वादा किया.
Protocol
1. संवहनी Thermocycler के मूल डिजाइन
- हम एक सरल संवहनी thermocycling प्लास्टिक प्रतिक्रिया कक्ष विनिमेय कारतूस "" है कि दो एल्युमिनियम प्लेटें जिसका तापमान स्वतंत्र 7 नियंत्रित (चित्रा 2) के बीच sandwiched हैं मिलकर युक्ति का निर्माण किया है.
- बेलनाकार रिएक्टर कुओं polycarbonate ब्लॉकों में छेद की मशीनिंग छेद व्यास और वांछित पहलू अनुपात (ऊंचाई / व्यास = ज / घ) को प्राप्त करने के लिए नियोजित प्लास्टिक शीट मोटाई के विभिन्न संयोजनों के साथ, सरणियाँ द्वारा एम्बेडेड रहे हैं. दो अलग रिएक्टर geometries यहाँ प्रस्तुत परिणामों में माना जाता है: / ज घ = 9: ज = 15.9 मिमी, d = 1.75 मिमी, 38.2 μL मात्रा, ज / घ = 3 घंटे = 6.02 मिमी, d = 1.98 मिमी, 18.5 μL मात्रा.
- रिएक्टर के नीचे की सतह एक एल्यूमीनियम ब्लॉक कारतूस एक microprocesser संचालित तापमान नियंत्रक के साथ interfaced heaters युक्त का उपयोग करने के लिए गर्म है.
- रिएक्टर की ऊपरी सतह पर तापमान एक एल्यूमीनियम ब्लॉक एक recirculating पानी के स्नान से जुड़ा का उपयोग करने के लिए विनियमित है.
- सारी सभा के साथ clamped है नायलॉन शिकंजा का उपयोग करने के लिए विरोध एल्यूमीनियम ब्लॉकों के बीच थर्मल प्रवाहकत्त्व सीमा.
2. पीसीआर रिएक्शन मिश्रण की तैयारी और लोड हो रहा है
- एक ठेठ 100 μL प्रतिक्रिया मिश्रण 10x बफर समाधान, 25 मिमी के 6 μL के 10 μL MgCl 2, dNTPs के 10 μL (2 मिमी प्रत्येक), डि पानी, β-actin जांच के 10 μL, β के 10 μL 41.2 μL actin-आगे प्राइमर, β-actin रिवर्स प्राइमर के 10 μL, मानव जीनोमिक टेम्पलेट डीएनए (10 एनजी / μL) के 2 μL और KOD डीएनए पोलीमरेज़ (2.5 इकाइयों μL /) के 0.8 μL.
- अभिकर्मकों लोड हो रहा से पहले, पीसीआर चैम्बर के नीचे सतह एल्यूमीनियम टेप की एक पतली शीट का उपयोग कर सील.
- एक 10 मिलीग्राम / गोजातीय सीरम albumin एमएल जलीय घोल वर्षा एक्स एंटी कोहरा द्वारा पीछा के साथ रिएक्टर कुओं कुल्ला.
- रिएक्टर लंबे जेल लोडिंग विंदुक युक्तियाँ का उपयोग कुओं में पिपेट अभिकर्मकों और FEP Teflon टेप के साथ ऊपरी सतह सील.
3. संवहनी Thermocycler में रिएक्शन रनिंग
- वांछित ऊपरी और निचले सतह के तापमान के लिए प्रतिक्रिया, पहले से गरम करना दोनों एल्यूमीनियम ब्लॉकों शुरू करने से पहले.
- सैंडविच प्लास्टिक रिएक्टर एल्यूमीनियम हीटिंग ब्लॉकों के बीच पीसीआर अभिकर्मकों के साथ भरी हुई है, और जल्दी विधानसभा दबाना साथ नायलॉन शिकंजा का उपयोग.
- के बाद प्रतिक्रिया वांछित समय के लिए रवाना किया है, heaters बंद स्विच और कम एक ठंडा धातु के लिए तेजी से यह शांत और संवहनी प्रवाह को रोकने के लिए ब्लॉक के शीर्ष पर डिवाइस (गर्म) की सतह जगह.
- प्लास्टिक रिएक्टर निकालें और उत्पादों विंदुक कुओं (लंबे जेल लोड हो रहा है युक्तियाँ का उपयोग) के बाद के विश्लेषण के लिए.
4. जेल वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण प्रदर्शन
- एक भावप्रवण गर्म थाली पर 1x बफर के 500 एमएल के साथ agarose के 10 ग्राम हीटिंग जब तक समाधान स्पष्ट हो जाता है एक 2 wt% agarose जेल तैयार करें.
- कास्टिंग ट्रे में agarose जेल लोड और कंघी सम्मिलित है. चलो ~ 30 मिनट के लिए जेल सेट.
- कंघी निकालें और 1x TAE बफर जोड़ने जब तक जेल जलमग्न है.
- Fluorescently दाग डीएनए नमूने 2 μL 100x SYBR ग्रीन मैं समाधान, 2 μL डीएनए नमूने, 2 μL 6x ऑरेंज लोड हो रहा है डाई, और 4 μL TAE बफर होते हैं.
- कुओं में डीएनए नमूनों को जोड़ें और एक 100 बीपी डीएनए सीढ़ी साइज़िंग मार्कर के साथ एक घंटे के लिए 60 वी पर जुदाई चलाते हैं.
- जेल निकालें और यह पराबैंगनी प्रकाश के तहत तस्वीर परिणाम प्राप्त करने के लिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
संवहनी thermocyclers के इष्टतम डिजाइन सही रिएक्टर ज्यामिति है कि एक संचार प्रमुख पीसीआर प्रक्रिया में शामिल तापमान के माध्यम से अभिकर्मकों परिवहन के लिए सक्षम प्रवाह उत्पन्न होगा चुनने शामिल है. ज्यामितीय पैरामीटर है कि बेलनाकार यहाँ माना रिएक्टरों में अलग किया जा सकता ऊंचाई (ज) और (घ) व्यास, या equivalently पहलू अनुपात (ज / घ) कर रहे हैं. हम 3 डी प्रवाह के अंदर अलग पहलू अनुपात का उपयोग कम्प्यूटेशनल तरल गतिकी (सीएफडी) की एक सीमा से अधिक पीसीआर रिएक्टरों संवहनी क्षेत्रों का पता लगाया है, और पाया है कि अप्रत्याशित रूप से जटिल पैटर्न पैदा कर सकते हैं. इससे भी महत्वपूर्ण बात, हमारे विश्लेषण उल्लेखनीय है कि 12 प्रतिक्रिया में तेजी लाने के इन जटिल प्रवाह क्षेत्रों के एक सबसेट का पर्दाफाश किया है.
ये ज्यामितीय प्रभाव स्पष्ट रूप से रिएक्टरों में उच्च और कम पहलू अनुपात में प्रवाह क्षेत्रों की तुलना करके देखा जा सकता है. उच्च पहलू अनुपात के मामले में (ज / घ = 9; एक लंबा, पतला सिलेंडर), तरल पदार्थ तत्वों बाहर रास्तों कि अनिवार्य रूप से छोरों बंद हो जाती हैं अनुरेखण trajectories साथ advected हैं, और वे करने के लिए की लंबी अवधि के लिए एक ही रास्तों का पालन करने के लिए बंद में हैं समय (चित्रा 3a). नतीजतन, च के बीच आदान प्रदान के लिए थोड़ा मौका हैकम trajectories कि पीसीआर (annealing और रिएक्टर के ऊपर और नीचे सतहों पर चरम denaturing के बीच oscillating) और शेष trajectories के बहुत बड़े कलाकारों की टुकड़ी है कि प्रवर्धन के लिए योगदान नहीं है (केन्द्र के लिए करीब स्थानीयकृत के लिए थर्मल शर्तों के इष्टतम अनुक्रम अभिकर्मकों बेनकाब रिएक्टर के).
प्रवाह क्षेत्र एक छोटे पहलू अनुपात (ज / घ = 3; एक छोटी, व्यापक सिलेंडर) पर बहुत अलग है, और अधिक अर्थ है कि तरल पदार्थ तत्व trajectories बंद पथ (3b चित्रा) का पालन नहीं रह में अराजक बनने. इस प्रकार, भले ही अभिकर्मकों एक अधिक जटिल तापमान प्रोफ़ाइल के अधीन कर रहे हैं, तरल पदार्थ तत्वों के लिए trajectories के एक बहुत व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए इतना है कि अभिकर्मक मात्रा के अधिक इष्टतम थर्मल प्रोफाइल अनुभव करने का अवसर है करने में सक्षम हैं. इन परिणामों counterintuitively सुझाव है कि जब ज / घ में अलग - अलग प्रवाह trajectories = 9 पीसीआर के लिए अधिक अनुकूल तापमान प्रोफाइल उत्पादन के द्वारा प्रकट हो सकता है कि "देखो" एक पारंपरिक thermocycler घंटे में प्रवाह क्षेत्र के अराजक प्रकृति / में कार्यरत लोगों के लिए समान d = 3 अंततः बढ़ाया मुद्रा को बढ़ावा देने के इतना है कि बहुत लंबे समय के लिए अभिकर्मकों प्रतिकूल trajectories में फंस नहीं बन कर एक वैश्विक पैमाने पर हावी है .
इस परिकल्पना का परीक्षण और निर्धारित जो रिएक्टर ज्यामिति पीसीआर के लिए अधिक अनुकूल था, हम उन दोनों के इस्तेमाल के लिए एक 295 बीपी एक मानव जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट से जीन β-actin के साथ जुड़े लक्ष्य के पीसीआर प्रतिकृति प्रदर्शन. उल्लेखनीय है, हम नियमित रूप से घंटे में केवल 10 मिनट में सही लक्ष्य उत्पाद के प्रवर्धन प्राप्त / घ = (चित्रा 4a) 3, जबकि एक ही detectable उत्पादों से पहले कम से कम 20 मिनट की आवश्यकता प्रतिक्रिया ज / घ में मनाया गया = 9 (4b चित्रा) . प्रतिक्रिया विशिष्टता भी है घंटे पर बहुत अधिक / घ = 3 जहां एक एकल पीसीआर उत्पाद प्राप्त है, जबकि कई nonspecific उत्पादों घंटे में उत्पन्न कर रहे हैं / घ = 9 जहां प्रवाह क्षेत्र जाल समय की विस्तारित अवधि के लिए प्रतिकूल थर्मल trajectories में तरल पदार्थ तत्वों .
चित्रा 1 के एक बेलनाकार कक्ष जिनके ऊपर और नीचे सतहों में थर्मल संवहन अलग निर्धारित तापमान पर रखा जाता है . यदि नीचे की सतह पर तापमान के शीर्ष पर अधिक से अधिक है, एक ऊर्ध्वाधर घनत्व ढाल संलग्न तरल पदार्थ है कि एक संचार प्रवाह पैटर्न पैदा करने में सक्षम है के भीतर स्थापित है. ज्यामितीय मापदंडों (h और ऊँचाई व्यास घ) के सही विकल्प के साथ, संवहनी प्रवाह क्षेत्र पीसीआर thermocycling अत्यधिक इस्तेमाल किया जा सकता है है जब ऊपर और नीचे सतहों annealing और तापमान क्रमश: (गुरुत्वाकर्षण खड़ी नीचे में कार्य करता है) के पास denaturing manintained हैं.
चित्रा 2 (क) एक संवहनी प्रवाह के मुख्य घटकों पीसीआर thermocyler. एक रिएक्टर कारतूस बेलनाकार कक्षों की एक सरणी युक्त एक polycarbonate ब्लॉक के होते हैं. ब्लॉक के लिए एक परिसंचारी पानी स्नान और एक नीचे एम्बेडेड heaters शामिल की थाली से जुड़ा डिज़ाइन किया गया एक शीर्ष प्लेट के बीच sandwiched है. (ख) पीसीआर अभिकर्मकों भरी हुई है और रिएक्टर कारतूस के अंदर बंद कर रहे हैं, जिसके बाद डिवाइस की प्रतिक्रिया करने के लिए इकट्ठा किया है. पूरा होने पर, procucts बाद के विश्लेषण के लिए आसानी से किया जा सकता है बाहर pipetted.
चित्रा 3 3 - डी संवहनी प्रवाह 53 और 96 के तापमान के साथ बेलनाकार रिएक्टरों के अंदर उत्पन्न क्षेत्रों के कम्प्यूटेशनल सिमुलेशन. डिग्री सेल्सियस के ऊपर और नीचे सतहों पर लगाया, क्रमशः. परिणाम के पहलू अनुपात पर दिखाए जाते हैं (क) ज / घ = 9 (38.2 μL रिएक्टर मात्रा) और (ख) ज / घ = 3 (18.5 μL रिएक्टर मात्रा). एक प्रतिनिधि एक तरल पदार्थ तत्व 3 डी प्रवाह क्षेत्र के माध्यम से यात्रा के द्वारा पीछा किया प्रक्षेपवक्र पर दिखाया गया है पथ के शीर्ष और पक्ष देखने के अनुमानों के साथ साथ छोड़ दिया, तापमान बनाम एक तरल पदार्थ तत्व के बाद समय की इसी साजिश सही में दिखाया गया है. यह / ज घ = 9 थर्मल प्रोफ़ाइल है कि एक पारंपरिक thermocycler के करीब होता है, लेकिन / ज घ = 3 पर अराजक प्रवाह क्षेत्र counterintuitively पीसीआर के लिए अधिक अनुकूल है.
चित्रा 4 डीएनए प्रतिकृति रिएक्टर चित्रा 3 (ऊपरी और निचले सतहों 53 और 96 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया, क्रमशः) में दिखाया geometries में प्राप्त परिणाम है. (क) पीसीआर बहुत / ज घ = 3 त्वरित है, के रूप में मजबूत प्रतिक्रिया समय के केवल 10 मिनट (एम: 100 बीपी सीढ़ी, 1-4 गलियों: 4 अलग बेलनाकार कक्ष में समानांतर प्रतिक्रियाओं से उत्पादों) के बाद दिखाई उत्पादों के द्वारा स्पष्ट है. (ख ही / ज घ = 9 में प्रदर्शन प्रतिक्रिया कम से कम 20 मिनट की आवश्यकता से पहले दिखाई उत्पादों को मनाया जाता है, और कई बैंड वांछित उत्पाद के अलावा गैर विशिष्ट लक्ष्य डीएनए का स्पष्ट संकेत प्रतिकृति (एम: 100 बीपी सीढ़ी, 1-2 गलियों: 2 अलग बेलनाकार कक्ष में समानांतर प्रतिक्रियाओं से उत्पादों).
Discussion
प्रवाह और रासायनिक प्रतिक्रिया के बीच परस्पर क्रिया को नाटकीय रूप से अराजक advection के प्रभाव के तहत बदल सकते हैं. लेकिन इन जटिल प्रवाह राज्यों अध्ययन करने के लिए चुनौती दे रहे हैं, जहां 3 डी प्रभाव महत्वपूर्ण हो यथार्थवादी geometries में, विशेष रूप से. घंटे पर रेले - Bénard संवहन / d> 1 न केवल इन घटनाओं का पता लगाने के लिए एक सुविधाजनक मंच प्रदान करता है, उनके लिए पीसीआर प्रदर्शन आवेदन भी प्रवाह और रासायनिक जांच होनी प्रतिक्रियाओं के बीच युग्मन के लिए सक्षम बनाता है. यह अद्वितीय क्षमता का चयन करने के लिए इष्टतम प्रवाह राज्यों जहां अराजक प्रभाव अधिनियम (counterintuitively) डीएनए प्रतिकृति की दर में तेजी लाने के लिए यह संभव बनाता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम कृतज्ञता Lynntech इंक टी. Ragucci, बी वाटकिंस, एस वाँग, और बी Wallek में तकनीकी सहायता और कई उपयोगी विचार - विमर्श के लिए धन्यवाद. यह काम CBET 0933688 अनुदान के तहत अमेरिका के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase kit | Novagen, EMD Millipore | 71085-3 | |
| TaqMan β-actin Control Reagents kit | Applied Biosystems | 401846 | |
| Aluminum tape | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rain-X Anti-Fog | SOPUS Products | ||
| Long Gel-loading Pipette Tips | Fisher Scientific | 05-408-151 | |
| FEP Teflon tape | McMaster-Carr | 7562A17 | |
| Agarose gel | Bio-Rad | 161-3107 | |
| TAE running buffer | Bio-Rad | 141-0743 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | |
| 6x Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 100 bp DNA ladder sizing marker | Bio-Rad | 170-8202 |
References
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