ראפיד PCR Thermocycling באמצעות הסעה תרמית Microscale

Summary

אנו מתארים שיטה חדשה לבצע שכפול הדנ"א באמצעות תגובת שרשרת פולימרז (PCR). הסעה תרמית היא רתומה ריאגנטים מעבורת ברציפות בין denaturing, חישול, ותנאי הרחבה על ידי שמירה על משטחים מנוגדים של הכור בטמפרטורה קבועה. זהו עיצוב פשוט מטבעו מבטיח לעשות PCR מהיר יותר נגיש.

Abstract

רבים מבחני ביולוגיה מולקולרית תלויים בדרך כלשהי על תגובת שרשרת פולימרז (PCR) כדי להגביר את ה-DNA לדלל בתחילה מדגם היעד לרמה ריכוז לזיהוי. אבל העיצוב של חומרה PCR קונבנציונאלי thermocycling, המבוססת בעיקר על חימום מסיבי גושי מתכת אשר הטמפרטורה מווסתת על ידי חימום Thermoelectric, מגביל מאוד את מהירות התגובה השגה ^1. חשמל ניכרת נדרש גם שוב ושוב חום לקרר את התערובת מגיב, להגביל את היכולת לפרוס אלה מכשירים בפורמט נייד.

הסעה תרמית התפתחה גישה חלופית thermocycling מבטיח כי יש את הפוטנציאל להתגבר על המגבלות האלה ^2-9. זורם הסעה הם אירוע יומיומי במערך רחב של הגדרות, החל האטמוספרה של כדור הארץ, האוקיינוסים, פנים, מנורות לבה דקורטיבי וצבעוני. נוזל בתנועה היא יזמה באותה דרך בכל מקרה: אי יציבות הציפה מונע מתעוררת כאשר נפח מוגבל של נוזל נתונה מפל הטמפרטורה מרחבית. אלה תופעות אותו מציעים דרך אטרקטיבית לבצע thermocycling PCR. על ידי יישום הדרגתי בטמפרטורה סטטית לאורך הגיאומטריה הכור תוכנן כראוי, זרימת הדם רציפה ניתן לקבוע כי יהיה שוב ושוב תחבורה ריאגנטים PCR דרך אזורי טמפרטורה הקשורים denaturing, חישול, ובשלבים הרחבה של התגובה (איור 1). Thermocycling ולכן ניתן actuated באופן פסאודו מקורר באופן איזוטרמי פשוט על ידי החזקת שני משטחים מנוגדים בטמפרטורה קבועה, לחלוטין ומבטל את הצורך שוב ושוב חום לקרר את המכשיר.

אחד האתגרים המרכזיים הניצבים בפני העיצוב של thermocyclers הסעה הוא הצורך לשלוט במדויק את מהירות מרחבית הפצות הטמפרטורה בתוך הכור על מנת להבטיח כי ריאגנטים ברצף לכבוש את אזורי טמפרטורה נכונה לתקופה מספיק זמן ^10,11. כאן אנו מתארים את התוצאות של מאמצינו כדי לבחון את מהירות מלא 3-D ו הפצות הטמפרטורה thermocyclers הסעה microscale ^12. במפתיע, גילינו קבוצת משנה של מסלולי זרימת מורכבים הם נוחים מאוד עבור ה-PCR עקב שילוב סינרגיסטי של חילופי (1) רציפה בין שבילי זרימה מספקת הזדמנות משופרת עבור ריאגנטים לטעום מגוון רחב של פרופילים טמפרטורה אופטימלית, ו ( 2) זמן גדל ובילה את הטמפרטורה בתוך אזור הרחבה שיעור הגבלת הצעד של ה-PCR. מאוד מהיר הגברה DNA פעמים (לפי 10 דקות) הם ברי השגה בכורים נועד ליצור זרמים אלה.

Protocol

1. העיצוב הבסיסי של Thermocycler הסעה

1. אנחנו צריכים לבנות מכשיר פשוט thermocycling הסעה המורכב להחלפה פלסטיק קאמרית תגובה "דיו", כי הם דחוקה בין שתי צלחות אלומיניום בטמפרטורות אשר נשלטים באופן עצמאי ⁷ (איור 2).
2. בארות הכור גלילי המוטבעים על ידי מערכי עיבוד של חורים בבלוקים פוליקרבונט, עם שילובים שונים של קוטר חור ואת עובי יריעת פלסטיק המועסקים על מנת להשיג את היבט ratios הרצוי (גובה / קוטר = h / d). שתי הגיאומטריות הכור שונים נחשבים בתוצאות שהוצגו כאן: h / d = 9: h = 15.9 מ"מ, d = 1.75 מ"מ, נפח 38.2 μL; h / d = 3: h = 6.02 מ"מ, d = 1.98 מ"מ, 18.5 μL נפח.
3. המשטח התחתון של הכור הוא מחומם באמצעות בלוק אלומיניום המכיל תנורי מחסנית interfaced עם בקר טמפרטורה microprocesser מונע.
4. הטמפרטורה על פני השטח העליון של הכור מוסדר באמצעות בלוק אלומיניום המחוברים אמבט מים הסירקולציה המחודשת.
5. הרכבה כולו צמודות זו לזו באמצעות ברגים ניילון להגביל הולכה תרמית בין גושי אלומיניום מנוגדים.

2. הכנה טוען של התגובה התערובת PCR

1. תערובת אופיינית 100 תגובה μL מכיל 10 μL של פתרון חיץ 10x, 6 μL של 25 מ"מ MgCl _2, 10 μL של dNTPs (2 mM כל אחת), 41.2 μL של די מים, 10 μL של β-אקטין בדיקה, 10 μL של β פריימר-אקטין קדימה, 10 μL של פריימר β-אקטין הפוך, 2 μL של תבנית ה-DNA האנושי גנומית (10 ng / μL) ו 0.8 μL של פולימראז הדנ"א KOD (2.5 יחידות / μL).
2. לפני טעינת ריאגנטים, לאטום את המשטח התחתון של החדר PCR באמצעות שכבה דקה של סרט אלומיניום.
3. יש לשטוף את הבארות הכור עם פתרון / 10 מ"ג למ"ל מימית של אלבומין בסרום שור ואחריו גשם וערפל-X-Anti.
4. ריאגנטים פיפטה לתוך בארות הכור באמצעות ג'ל טעינה ארוך טיפים פיפטה ו לאטום את השטח העליון עם סרט טפלון FEP.

3. ריצה את התגובה Thermocycler הסעה

1. לפני תחילת התגובה, מחממים שתי קוביות אלומיניום עם טמפרטורות פני השטח הרצוי העליון והתחתון.
2. סנדוויץ הכור פלסטיק עמוסות PCR ריאגנטים בין גושי חימום אלומיניום, במהירות מהדק את מכלול יחד באמצעות ברגים ניילון.
3. לאחר התגובה יש המשיך בפעם הרצוי, כבה את תנורי ומקום התחתון (חם) משטח של המכשיר על גבי בלוק מתכת צונן במהירות לקרר אותו ולהפסיק את זרימת הסעה.
4. הסר את הכור פלסטיק פיפטה את המוצרים מתוך הבארות (באמצעות טעינת טיפים ארוך ג'ל) לניתוח שלאחר מכן.

4. ביצוע ניתוח ג'ל אלקטרופורזה

1. הכן 2 wt% agarose ג'ל על ידי חימום של 10 גרם agarose עם 500 מ"ל של חיץ 1x על פלטה חשמלית ערבוב עד לפתרון מתבהרת.
2. טען את הג'ל agarose למגש הליהוק והכנס את המסרק. תן סט ג'ל למשך 30 דקות ~.
3. הסר את המסרק ולהוסיף חיץ 1x טה עד ג'ל הוא שקוע.
4. Fluorescently דגימות DNA מוכתם להכיל 2 μL 100x SYBR גרין פתרון אני, 2 דגימת DNA μL, 2 דיי μL 6x אורנג' טוען, ו 4 μL חיץ טה.
5. מוסיפים את דגימות ה-DNA לתוך בארות ולהפעיל את ההפרדה V עבור 60 שעות 1 עם סמן 100 נ"ב סולם הדנ"א לשינוי גודל.
6. הסר את הג'ל ולצלם אותו תחת אור UV כדי להשיג את התוצאה.

5. נציג תוצאות:

עיצוב אופטימאלי של thermocyclers הסעה כרוך בבחירת הגיאומטריה הכור נכונה כי יפיק זרימת הדם מסוגל להעביר באמצעות ריאגנטים הטמפרטורות מפתח המעורבים בתהליך PCR. פרמטרים גיאומטריים כי יכולים להיות מגוונים של כורים גלילי נחשב כאן הם גובה (ח) ואת קוטר (ד), או שקול את יחס הממדים (ח / ד). אנו בחנו את 3-D שדות זרימה הסעה בתוך כורים PCR על פני טווח של היבט ratios שונים באמצעות דינמיקה של נוזלים חישובית (CFD), ומצאו כי תבניות מורכבות בלתי צפוי יכול להתעורר. יתרה מכך, הניתוח שלנו חשף משנה של שדות אלה זרימה מורכבים להאיץ באופן משמעותי את התגובה ^12.

תופעות אלה גיאומטריות ניתן לראות בבירור על ידי השוואת שדות זרימה בכורים על היבט ratios גבוה ונמוך. בכל מקרה היבט יחס גבוה (ח / d = 9; צילינדר גבוה ורזה), הם האלמנטים נוזל advected לאורך מסלולי התחקות את השבילים כי הם בעצם לולאות סגורות, והם נעולים, כדי לעקוב אחר נתיבי אותו לתקופות ארוכות זמן (איור 3a). כתוצאה מכך, יש הזדמנות קטנה החליפין בין fמסלולים נמוכים החושפים ריאגנטים רצף אופטימלי של התנאים תרמית PCR (נדנוד בין חישול denaturing הקצוות על משטחים העליון והתחתון של כור) ואת ההרכב הרבה יותר גדול של מסלולים הנותרים שאינם תורמים הגברה (מקומי קרוב למרכז הכור).

שדה זרימה שונה בהרבה ביחס היבט קטן (ח / d = 3; קצר, גליל רחב יותר), הופך כאוטי יותר במובן זה מסלולי אלמנט נוזל כבר לא פעל נתיבים סגורים (איור 3 ב). כך, על אף ריאגנטים כפופים פרופיל הטמפרטורה מורכבים יותר, אלמנטים נוזל מסוגלים לבחון מגוון רחב יותר של מסלולים, כך יותר של נפח מגיב יש הזדמנות לחוות פרופילים תרמית אופטימלית. תוצאות אלו counterintuitively מראים כי בעוד מסלולי זרימת הפרט h / d = 9 עשוי להיראות חיובי יותר עבור ה-PCR על ידי ייצור פרופילי טמפרטורה כי "המראה" דומים לאלה המועסקים thermocycler קונבנציונלית, האופי הכאוטי של שדה הזרימה ב h / d = 3 בסופו של דבר שולטת בקנה מידה עולמי על ידי קידום חילופי משופר, כך ריאגנטים לא להיות לכודים מסלולי שלילי למשך זמן רב.

כדי לבחון סברה זו ולקבוע אילו הגיאומטריה הכור היה נוח יותר עבור ה-PCR, השתמשנו שניהם לבצע שכפול PCR מטרה 295 נ"ב הקשורים הגן β-אקטין מ תבנית ה-DNA האנושי גנומית. למרבה הפלא, אנו שגרתי להשיג הגברה של המוצר היעד הנכון רק 10 דקות בכל שעה / d = 3 (תרשים 4 א), ואילו את אותה התגובה הנדרשת לפחות 20 דקות לפני מוצרים לזיהוי נצפו ב h / d = 9 (איור 4 ב) . סגוליות התגובה היא גם הרבה יותר על h / d = 3 שם מוצר בודד PCR מתקבל, בעוד מוצרים ספציפיים מרובים נוצרות h / d = 9 שם בשדה זרימה מלכודות אלמנטים נוזל מסלולי תרמית שלילי במשך פרקי זמן ארוכים.

באיור 1. הסעה תרמית בתא גלילי אשר העליון והתחתון משטחים נשמרים בטמפרטורות קבועות שונות. אם הטמפרטורה על פני השטח התחתון גבוה יותר מאשר בחלק העליון, שיפוע צפיפות אנכי הוא הוקם בתוך הנוזל סגורה כי היא מסוגלת לייצר דפוס זרימת הדם. עם הבחירה הימני של פרמטרים גיאומטריים (גובה h ו בקוטר ד), בשדה זרימה הסעה ניתן לרתום להניע thermocycling PCR כאשר משטחים העליון והתחתון הם manintained ליד חישול denaturing בטמפרטורות, בהתאמה (כוח הכבידה פועל אנכית כלפי מטה).

איור 2. (א) רכיבי מפתח של זרימה הסעה PCR thermocyler. מחסנית הכור מורכב בלוק פוליקרבונט המכיל מערך של תאים גליליים. הבלוק היא דחוקה בין צלחת העליון נועד להיות מחובר אמבט מים במחזור וצלחת תחתית שילוב תנורי מוטבע. (ב) ריאגנטים PCR נטענים וחתום בתוך המחסנית הכור, שלאחריו ההתקן מורכב כדי לבצע את התגובה. בסיום, procucts ניתן pipetted בקלות החוצה לניתוח שלאחר מכן.

איור 3. סימולציות חישוביות של 3-D שדות זרימה הסעה שנוצר בתוך כורים גלילי עם טמפרטורות של 53 ו - 96 ° C הוטל על משטחים עליונים ותחתונים, בהתאמה. תוצאות מוצגים היבט ratios של (א) h / d = 9 (38.2 נפח הכור μL) ו (ב) h / d = 3 (18.5 נפח הכור μL). מסלול נציג ואחריו אלמנט נוזל נסיעה דרך שדה זרימה 3D מוצג בקצה השמאלי יחד עם תחזיות להציג העליונה ואת הצד של הנתיב, את העלילה המקביל הטמפרטורה לעומת פעם הבאה אלמנט נוזל מוצגת בחלק הימני. פרופיל תרמית על h / d = 9 מופיע קרוב לזה של thermocycler קונבנציונלית, אבל בשדה זרימה כאוטית ב h / d = 3 הוא counterintuitively יותר נוחים PCR.

איור 4. שכפול הדנ"א התוצאות שהתקבלו ב הגיאומטריות הכור שמוצג באיור 3 (העליון והתחתון משטחים נשמרו על 53 ו - 96 ° C, בהתאמה). (א) PCR מואץ מאוד ב h / d = 3, ברור לפי מוצרים חזק לעין לאחר 10 דקות בלבד של זמן תגובה (מ: 100 סולם bp, 1-4 נתיבים: מוצרים מן התגובות מקביל 4 חדרים גלילי שונים). (ב h / d = 9 דורש לפחות 20 דקות לפני מוצרי לעין הם נצפו, להקות מרובות שכפול המציין ניכר של ה-DNA הלא ספציפית יעד נוסף על המוצר הרצוי (מ: 100 סולם נ"ב, 1-2 נתיבים: מוצרים תגובות מקביל 2 חדרי גלילי שונים).

Discussion

יחסי הגומלין בין זרימה תגובה כימית יכול לשנות באופן דרמטי תחת השפעת advection כאוטי. אבל אלה מדינות זרימה מורכבים מאתגרת ללמוד, במיוחד הגיאומטריות מציאותי שבו אפקטים 3D הופכים לחשובים. ריילי, ברנארד הסעה ב h / d> 1 לא רק מספק פלטפורמה נוחה כדי לחקור תופעות אלה, היישום שלהם לבצע PCR גם מאפשרת צימוד בין תגובות כימיות זרימה להיות נחקר. יכולת ייחודית זו מאפשרת לבחור מצבי זרימה אופטימלי שבו לפעול תופעות כאוטיות (counterintuitively) כדי להאיץ את קצב שכפול הדנ"א.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase kit	Novagen, EMD Millipore	71085-3
TaqMan β-actin Control Reagents kit	Applied Biosystems	401846
Aluminum tape	Axygen Scientific	PCR-AS-200
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Rain-X Anti-Fog	SOPUS Products
Long Gel-loading Pipette Tips	Fisher Scientific	05-408-151
FEP Teflon tape	McMaster-Carr	7562A17
Agarose gel	Bio-Rad	161-3107
TAE running buffer	Bio-Rad	141-0743
SYBR Green I	Invitrogen	S7563
6x Orange Loading Dye	Fermentas	R0631
100 bp DNA ladder sizing marker	Bio-Rad	170-8202