Summary
Nous décrivons une nouvelle méthode pour effectuer la réplication d'ADN par la réaction de polymérase en chaîne (PCR). Convection thermique est mise à profit pour les réactifs de navette continue entre dénaturation, d'hybridation et les conditions d'extension par le maintien des surfaces opposées du réacteur à température constante. Cette conception intrinsèquement simple, promet de faire rapidement PCR plus accessible.
Abstract
Beaucoup de tests de biologie moléculaire dépendent d'une certaine manière sur la réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour amplifier un échantillon cible d'abord diluer l'ADN à un niveau de concentration détectable. Mais la conception de matériel thermocyclage PCR conventionnelle, essentiellement basée sur massifs blocs de chauffage métallique dont la température est régulée par des radiateurs thermoélectriques, limite sévèrement la vitesse de réaction possible 1. Considérable d'énergie électrique est également nécessaire pour chauffer et refroidir plusieurs reprises le mélange réactif, limitant la capacité de déployer ces instruments dans un format portable.
La convection thermique est apparue comme une approche alternative prometteuse thermocyclage qui a le potentiel pour surmonter ces limitations 2-9. Flux de convection sont monnaie courante dans un large éventail de paramètres allant de l'atmosphère terrestre, les océans, et l'intérieur, de lampes à lave décoratif et coloré. Mouvement fluide est lancé de la même manière dans chaque cas: une instabilité de flottabilité conduit survient quand un volume confiné de liquide est soumis à un gradient de température spatiale. Ces mêmes phénomènes offrent un moyen attractif pour effectuer thermocyclage PCR. En appliquant un gradient de température statique à travers une géométrie du réacteur bien conçu, un flux circulatoire continu peut être établi que le transport sera répétée réactifs de PCR à travers des zones de température associée à la dénaturation, d'hybridation et les étapes d'extension de la réaction (figure 1). Thermocyclage peut donc être actionné de manière pseudo-isotherme en tenant simplement deux faces opposées à des températures fixes, en éliminant complètement la nécessité de chauffer et de climatiser plusieurs reprises l'instrument.
Un des principaux défis de conception de thermocycleurs convection est la nécessité de contrôler avec précision la vitesse spatiale et les distributions de température dans le réacteur afin de s'assurer que les réactifs de façon séquentielle occuper les zones de température correcte pour une période de temps suffisante 10,11. Nous décrivons ici les résultats de nos efforts pour sonder la pleine vitesse de 3-D et les distributions de température dans microéchelle convectifs thermocycleurs 12. De façon inattendue, nous avons découvert un sous-ensemble des trajectoires d'écoulement complexes qui sont très favorables pour la PCR en raison d'une combinaison synergique de (1) échange continu entre les chemins d'écoulement qui offre une possibilité accrue pour les réactifs à l'échantillon de la gamme complète des profils de température optimale, et ( 2) l'augmentation du temps passé dans la zone de température d'extension de l'étape limitante de la PCR. Extrêmement rapide temps de l'amplification d'ADN (de moins de 10 min) sont réalisables dans des réacteurs conçus pour générer ces flux.
Protocol
1. Conception de base du Thermocycleur convective
- Nous avons construit un dispositif simple, thermocyclage convectifs composé de plastique interchangeables chambre de réaction "cartouches" qui sont pris en sandwich entre deux plaques d'aluminium dont les températures sont contrôlées indépendamment 7 (figure 2).
- Puits réacteur cylindrique sont intégrés par des réseaux de l'usinage des trous dans des blocs en polycarbonate, avec différentes combinaisons de diamètre du trou et l'épaisseur de feuille de plastique utilisées pour atteindre les ratios d'aspect souhaité (hauteur / diamètre = h / j). Deux géométries différentes sont considérées comme des réacteurs dans les résultats présentés ici: H / D = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 volumes uL; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 uL volume.
- La surface inférieure du réacteur est chauffé à l'aide d'un bloc d'aluminium contenant cartouches chauffantes interfacé avec un contrôleur de température microprocesser entraînée.
- La température à la surface supérieure du réacteur est régulée à l'aide d'un bloc en aluminium relié à un bain d'eau de recirculation.
- L'ensemble est serré ensemble à l'aide des vis en nylon pour limiter la conduction thermique entre les blocs en aluminium adverse.
2. Préparation et chargement du mélange de réaction PCR
- Un typique de 100 uL mélange réactionnel contient 10 uL d'une solution tampon 10x, 6 pl de 25 mM MgCl 2, 10 pi de dNTP (2 mM chacun), 41,2 uL d'eau DI, 10 pi de β-actine de sonde, 10 pi de β -actine amorce directe, 10 uL d'amorce reverse β-actine, 2 pl de l'ADN matrice génomique humaine (10 ng / uL) et 0,8 uL d'ADN polymérase KOD (2,5 unités / uL).
- Avant de charger les réactifs, de sceller la surface inférieure de la chambre de PCR en utilisant une feuille mince de ruban adhésif aluminium.
- Rincer les puits avec un réacteur de 10 mg / ml de solution aqueuse d'albumine sérique bovine suivie par Rain-X anti-buée.
- Réactifs pipette dans les puits de réacteur utilisant de longues pointes de pipettes de gel de chargement et de sceller la surface supérieure avec Téflon FEP bande.
3. L'exécution de la réaction dans le thermocycleur convective
- Avant le début de la réaction, des blocs en aluminium à la fois pour préchauffer les températures souhaitées surface supérieure et inférieure.
- Sandwich du réacteur en plastique chargé de réactifs de PCR entre les blocs de chauffage en aluminium, et rapidement pince l'assemblage ainsi que l'aide de vis en nylon.
- Après la réaction s'est produite pendant le temps voulu, éteindre le chauffe et le lieu de la plus faible (à chaud) de surface de l'appareil au sommet d'un bloc de métal refroidi rapidement le refroidir et arrêter le flux de convection.
- Retirez le réacteur en plastique et la pipette les produits hors des puits (en utilisant les astuces à long chargement de gel) pour une analyse ultérieure.
4. Exécution d'une analyse électrophorèse sur gel
- Préparer un 2% en poids gel d'agarose par chauffage de 10 g d'agarose avec 500 ml de tampon 1x sur une plaque chaude jusqu'à agitant la solution devient limpide.
- Chargez le gel d'agarose dans le bac de coulée et d'insérer le peigne. Soit l'ensemble de gel pour ~ 30 min.
- Retirer le peigne et ajouter 1x tampon TAE jusqu'à ce que le gel est immergé.
- Fluorescence des échantillons d'ADN teinté contiennent 2 uL 100x SYBR Green I solution, deux échantillons d'ADN ul, 2 ul Dye 6x Chargement d'Orange, et 4 pi de tampon TAE.
- Ajouter les échantillons d'ADN dans les puits et exécuter la séparation à 60 V pendant 1 h avec un 100 pb d'ADN échelle de marqueur de taille.
- Retirer le gel et le photographier sous lumière UV afin d'obtenir le résultat.
5. Les résultats représentatifs:
La conception optimale des thermocycleurs convection consiste à choisir la géométrie du réacteur correcte qui va générer un flux circulatoire capable de transporter des réactifs à travers les températures clés impliqués dans le processus de PCR. Les paramètres géométriques qui peuvent être modifiées dans les réacteurs cylindriques considérés ici sont la hauteur (h) et le diamètre (d), ou de manière équivalente le ratio d'aspect (h / j). Nous avons exploré les champs d'écoulement 3-D à l'intérieur par convection réacteurs PCR sur une gamme de ratios d'aspect différent en utilisant la dynamique des fluides computationnelle (DFC), et a constaté que les modèles complexes peuvent surgir inopinément. Plus important encore, notre analyse a révélé un sous-ensemble de ces champs d'écoulement complexes que d'accélérer considérablement la réaction 12.
Ces effets géométriques peuvent être clairement visible en comparant les champs d'écoulement dans les réacteurs à rapport d'aspect élevé et bas. Dans le cas allongement élevé (H / D = 9; un grand cylindre maigres), des éléments fluides sont advecté le long de trajectoires traçant des chemins qui sont essentiellement des boucles fermées, et ils sont immobilisés à suivre les mêmes chemins pour de longues périodes de temps (figure 3a). Par conséquent, il ya peu d'opportunités pour l'échange entre ftrajectoires basses qui exposent les réactifs à la séquence optimale des conditions thermiques pour la PCR (oscillant entre le recuit et la dénaturation extrêmes à faces supérieure et inférieure du réacteur) et l'ensemble beaucoup plus vaste de trajectoires restants qui ne contribuent pas à l'amplification (localisés près du centre du réacteur).
Le champ d'écoulement est très différente à un ratio plus petite dimension (h / j = 3; une plus courte, plus large cylindre), de plus en plus chaotique dans le sens où les trajectoires élément liquide ne suivent plus les chemins fermés (figure 3B). Ainsi, même si les réactifs sont soumis à un profil de température plus complexes, des éléments de fluide sont en mesure d'explorer un éventail beaucoup plus large de trajectoires afin que davantage de volume de réactif a l'occasion d'une expérience optimale de profils thermiques. Ces résultats suggèrent que les contre-intuitivement tout en trajectoires individuelles à des flux h / d = 9 semblent être plus favorables pour la PCR en produisant des profils de température qui "regarde" similaires à celles employées dans un thermocycleur conventionnel, la nature chaotique du champ d'écoulement à h / d = 3 domine finalement à l'échelle mondiale par la promotion de l'échange amélioré de façon que les réactifs ne sont piégés dans des trajectoires défavorables pour très longtemps.
Pour tester cette hypothèse et déterminer la géométrie du réacteur a été plus favorable pour la PCR, nous avons utilisé deux d'entre eux pour effectuer la réplication de PCR de 295 pb d'une cible associée avec le gène β-actine à partir d'un modèle d'ADN génomique humain. Fait remarquable, nous avons systématiquement réalisé l'amplification du produit cible correct dans seulement 10 min à H / D = 3 (figure 4a), tandis que la même réaction nécessaire au moins 20 minutes avant que les produits détectables ont été observés à H / D = 9 (figure 4b) . La spécificité de la réaction est aussi beaucoup plus grande à H / D = 3 où un seul produit PCR est obtenu, alors que plusieurs produits non spécifiques sont générés à H / D = 9, où les pièges champ d'écoulement de fluide dans les éléments défavorables trajectoires thermiques pour des périodes de temps prolongées.
Figure 1. Convection thermique dans une chambre cylindrique dont le haut et le bas des surfaces sont maintenus à différentes températures fixes. Si la température à la surface inférieure est plus élevé que dans la partie supérieure, un gradient de densité verticale est établi dans le fluide, enfermé qu'il est capable de générer un modèle de flux circulatoires. Avec le bon choix des paramètres géométriques (hauteur h et de diamètre d), le champ d'écoulement de convection peut être exploité pour actionner thermocyclage PCR lorsque les surfaces supérieure et inférieure sont manintained près de recuit et la dénaturation des températures, respectivement (la gravité agit verticalement vers le bas).
Figure 2. (A) Les éléments clés d'un flux de convection PCR thermocycleur. Une cartouche de réacteur est constitué d'un bloc de polycarbonate contenant un tableau de chambres cylindriques. Le bloc est pris en sandwich entre une plaque supérieure conçu pour être relié à un bain d'eau circulant et une plaque inférieure incorporant chauffages intégrés. (B) Les réactifs de PCR sont chargés et scellés à l'intérieur de la cartouche de réacteur, après quoi l'appareil est assemblé pour effectuer la réaction. À la fin, le procucts peut être facilement pipette pour analyse ultérieure.
Figure 3. Simulations de calcul de la 3-D des champs d'écoulement convectif générés à l'intérieur des réacteurs cylindriques avec des températures de 53 et 96 ° C imposées sur les surfaces supérieure et inférieure, respectivement. Les résultats sont présentés au rapport d'aspect de (a) H / D = 9 (38,2 uL volume du réacteur) et (b) h / d = 3 (18,5 volume du réacteur uL). Une trajectoire suivie par un représentant élément fluide traversant le champ d'écoulement 3D est affiché à gauche ainsi que des projections vue de dessus et d'autre du chemin, le tracé correspondant de la température en fonction du temps suite à un élément de fluide est indiqué à droite. Le profil thermique à H / D = 9 apparaît proche de celle d'un thermocycleur classique, mais le champ d'écoulement chaotique à H / D = 3 est contre-intuitivement plus favorable pour la PCR.
Résultats de la figure 4. Réplication de l'ADN obtenu dans les géométries de réacteur de la figure 3 (surfaces supérieures et inférieures ont été maintenus à 53 et 96 ° C, respectivement). (A) La PCR est fortement accélérée au H / D = 3, comme en témoigne les produits solides visibles après seulement 10 minutes de temps de réaction (M: 100 échelle de pb, pistes 1-4: les produits de réactions en parallèle dans 4 différentes chambres cylindriques). (B H / D = 9 exige au moins 20 minutes avant que les produits visibles sont observées, et plusieurs bandes sont évidents indiquant la réplication de l'ADN cible non-spécifiques, en plus de produit souhaité (M: 100 pb échelle, voies 1-2: produits de réactions parallèles dans deux différentes chambres cylindriques).
Discussion
L'interaction entre le flux et la réaction chimique peut changer de façon spectaculaire sous l'influence de l'advection chaotique. Mais ces états d'écoulement complexes sont difficiles à étudier, notamment dans des géométries réalistes où les effets 3D deviennent importants. Convection de Rayleigh-Bénard à h / j> 1 ne fournit pas seulement une plate-forme pratique pour explorer ces phénomènes, leur application pour effectuer la PCR permet également le couplage entre les réactions chimiques de flux et d'être sondé. Cette capacité unique permet de sélectionner états de flux optimale où chaotiques Loi effets (contre-intuitivement) pour accélérer le taux de réplication de l'ADN.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, et B. Wallek au Lynntech, Inc pour l'assistance technique et de nombreuses discussions utiles. Ce travail a été soutenu par le US National Science Foundation (NSF) titre de la subvention CBET-0933688.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase kit | Novagen, EMD Millipore | 71085-3 | |
| TaqMan β-actin Control Reagents kit | Applied Biosystems | 401846 | |
| Aluminum tape | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rain-X Anti-Fog | SOPUS Products | ||
| Long Gel-loading Pipette Tips | Fisher Scientific | 05-408-151 | |
| FEP Teflon tape | McMaster-Carr | 7562A17 | |
| Agarose gel | Bio-Rad | 161-3107 | |
| TAE running buffer | Bio-Rad | 141-0743 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | |
| 6x Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 100 bp DNA ladder sizing marker | Bio-Rad | 170-8202 |
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