Snabb PCR termocykling med Microscale termisk konvektion

Summary

Vi beskriver en ny metod för DNA-replikering via polymeraskedjereaktion (PCR). Termisk konvektion utnyttjas för att kontinuerligt skytteltrafik reagens mellan denaturering, hybridisering och villkor förlängning genom att upprätthålla motstående ytor reaktor vid konstant temperatur. Detta i sig enkel design lovar att göra snabba PCR mer tillgänglig.

Abstract

Många molekylärbiologi analyser bero på något sätt på polymeraskedjereaktion (PCR) för att förstärka en början späda prov mål-DNA till en detekterbar koncentration nivå. Men utformningen av konventionell PCR termocykling hårdvara, främst baserad på massiva block av metall uppvärmning vars temperatur regleras av termoelektriska element, allvarligt begränsar uppnåeliga reaktionshastigheten ^1. Betydande el krävs också för att flera gånger värma och kyla blandningen, vilket begränsar möjligheten att använda dessa instrument i ett portabelt format.

Termisk konvektion har vuxit fram som ett lovande alternativ termocykling metod som har potential att övervinna dessa begränsningar ^2-9. Konvektiva flöden är vardag i en mångfald av inställningar från jordens atmosfär, hav och inredning, till dekorativa och färgstarka lava lampor. Fluid rörelse initieras på samma sätt i varje enskilt fall: en flytkraft driven instabilitet uppstår när en begränsad volym av vätska utsätts för en rumslig temperaturgradient. Samma fenomen erbjuda ett attraktivt sätt att utföra PCR termocykling. Genom att tillämpa en statisk temperaturgradient över en lämpligt utformad reaktor geometri, kan en kontinuerlig cirkulationsrubbningar flöde fastställas att upprepade gånger kommer att transportera PCR reagenser genom temperaturzoner i samband med denaturering, hybridisering, och stadier förlängning av reaktion (Figur 1). Termocykling kan därför aktiveras i ett pseudo-isotermisk sätt genom att hålla två motsatta ytorna vid fasta temperaturer, helt eliminerar behovet av att upprepade gånger värma och kyla instrumentet.

En av de största utmaningarna för utformning av konvektiva thermocyclers är behovet av att exakt kontrollera den rumsliga hastighet och distributioner temperaturen i reaktorn för att säkerställa att reagensen sekventiellt ockupera rätt temperatur zoner under en tillräckligt lång tid ^10,11. Här beskriver vi resultatet av våra ansträngningar att söka full 3-D-hastighet och fördelningar temperaturen i mikroskala konvektiv thermocyclers ^12. Oväntat har vi upptäckt en delmängd av komplexa flöden banor som är mycket gynnsamma för PCR på grund av en synergistisk kombination av (1) kontinuerligt utbyte mellan flödesvägar som ger en ökad möjlighet för reagenser för prov hela skalan av optimal temperatur profiler, och ( 2) ökad tid i förlängningen temperaturen zonen det hastighetsbegränsande steget i PCR. Extremt snabb DNA-amplifiering gånger (under 10 min) är möjliga att uppnå i reaktorer för att generera dessa flöden.

Protocol

1. Grundkonstruktion den konvektiva termocykler

1. Vi har konstruerat en enkel konvektiv termocykling apparat som består av utbytbara plast reaktionskammaren "patroner" som är inneslutet mellan två aluminiumplåtar, vars temperatur är oberoende kontrollerad ⁷ (figur 2).
2. Cylindrisk reaktor brunnar är inbäddade genom bearbetning kedjor av hål i polykarbonat block, med olika kombinationer av håldiameter och plast plåttjocklek som används för att uppnå önskat bildformat (höjd / diameter = h / d). Två olika reaktor geometrier beaktas i de resultat som presenteras här: H / D = 9: H = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 mikroliter volym, H / D = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 mikroliter volym.
3. Bottenyta reaktorn värms upp med hjälp av ett aluminiumblock som innehåller kassetten värmare ansluten till en microprocesser driven temperaturregulator.
4. Temperaturen vid reaktorns övre ytan regleras med hjälp av ett aluminiumblock ansluten till ett recirkulerande vattenbad.
5. Hela församlingen spänns ihop med skruvar i nylon för att begränsa värmeledning mellan de motsatta aluminium block.

2. Förberedelse och lastning av PCR-reaktionsblandningen

1. En typisk 100 mikroliter reaktionsblandningen innehåller 10 mikroliter av 10x buffertlösning, 6 mikroliter av 25 mM MgCl _2, 10 mikroliter av dNTPs (2 mm vardera), 41,2 mikroliter av DI-vatten, 10 mikroliter av β-aktin sond, 10 mikroliter av β -aktin framåt primer, 10 mikroliter av β-aktin reverse primer, 2 mikroliter av mänskliga genomet templat-DNA (10 ng / l) och 0,8 ìl KOD DNA-polymeras (2,5 enheter / l).
2. Innan du laddar reagenser, försegla bottenytan av PCR kammaren med hjälp av en tunn plåt av aluminium tejp.
3. Skölj reaktorn brunnarna med en 10 mg / ml vattenlösning av bovint serumalbumin följt av Rain-X Anti-Fog.
4. Pipettera reagenser in i reaktorn brunnarna med långa gel-lastning pipettspetsar och försegla den övre ytan med FEP Teflon tejp.

3. Köra reaktion i Konvektiv termocykler

1. Innan du börjar reaktionen förvärma både aluminium block till önskad övre och nedre yttemperaturer.
2. Sandwich plasten reaktorn laddas med PCR-reagens mellan blocken aluminium värme, och snabbt klämma montering ihop med skruvar i nylon.
3. När reaktionen har gått till önskad tid, stänga av värmeelement och placera den nedre (varm) enhetens yta på toppen av en kyld metall-block för att snabbt kyla den och stoppa den konvektiva flödet.
4. Ta bort plasten reaktorn och pipett produkter ur brunnarna (med hjälp av långa tips gel lastning) för senare analys.

4. Utföra analys gelelektrofores

1. Förbered en 2 wt% agarosgel genom att värma 10 g agaros med 500 ml 1X buffert på en omrörning värmeplatta tills lösningen blir klar.
2. Ladda agarosgel i gjutning facket och sätt in kammen. Låt gelen som för ~ 30 min.
3. Ta bort kammen och lägga 1x TAE buffert tills gelen är under vatten.
4. Fluorescerande färgade DNA-prover innehåller 2 mikroliter 100x SYBR Green I lösning, 2 mikroliter DNA-prov, 2 mikroliter 6x Orange laddningsfärg och 4 mikroliter TAE buffert.
5. Lägg till DNA-prover i brunnar och kör separationen vid 60 V under 1 h med en 100 bp DNA stege dimensionering markör.
6. Ta bort gel och fotografera den under UV-ljus för att få resultatet.

5. Representativa resultat:

Optimal utformning av konvektiva thermocyclers innebär att man väljer rätt reaktor geometri som kommer att generera en cirkulatorisk flöde kan transportera reagenser genom nyckeln temperaturer involverade i PCR-processen. Den geometriska parametrar som kan varieras i det cylindriska reaktorer som tas upp här är höjden (H) och diameter (d) eller ekvivalent bildförhållandet (h / d). Vi har utforskat 3-D-flöde fält inne konvektiva PCR reaktorer över en rad olika bildformat med hjälp av Computational Fluid Dynamics (CFD), och fann att oväntat komplexa mönster kan uppstå. Framförallt har vår analys avslöjat en delmängd av dessa komplexa strömningsfält att avsevärt påskynda reaktionen ^12.

Dessa geometriska effekter kan tydligt ses genom att jämföra flödet fälten i reaktorer vid höga och låga bildformat. I hög bildformat fall (h / d = 9; en lång, smal cylinder), är flytande element advected längs banor spåra ut vägar som i huvudsak är stängda loopar, och de är inlåsta för att följa samma vägar under långa perioder tid (Figur 3a). Följaktligen finns det små möjligheter för utbyte mellan flåga banor som utsätter reagenser till optimal sekvens av termiska förhållanden för PCR (oscillerande mellan glödgning och denaturering ytterligheter i reaktorns övre och undre ytor) och den mycket större ensemblen av resterande banor som inte bidrar till förstärkning (lokaliserade närmare centrum av reaktorn).

Flödet fältet är mycket annorlunda på ett mindre bildformat (h / d = 3, en kortare, bredare cylinder), blir mer kaotiskt i den meningen att vätskan elementet banor följer inte längre slutna banor (Figur 3b). Även om reagenser utsätts för en mer komplex temperatur profil, flytande element kan utforska ett betydligt bredare utbud av banor så att fler av reagens volymen har en möjlighet att uppleva optimal termisk profiler. Dessa resultat tyder counterintuitively att medan enskilda flödet banor på H / D = 9 kan tyckas vara mer gynnsam för PCR genom att producera temperatur profiler som "ser" liknande dem som används i en konventionell termocykler, den kaotiska natur strömningsfältet på h / d = 3 dominerar i slutändan på en global nivå genom att främja ökat utbyte så att reagens inte fastna i negativa banor särskilt länge.

För att testa denna hypotes och bestämma vilka reaktorns geometri var mer gynnsam för PCR använde vi dem båda för PCR replikering av en 295 bp mål i samband med β-aktin gen från en människa genomisk DNA-mall. Anmärkningsvärt uppnådde vi rutinmässigt förstärkning av rätt mål produkt på bara 10 minuter på H / D = 3 (Figur 4a), medan samma reaktion krävs minst 20 min före detekterbara produkter observerades vid H / D = 9 (figur 4b) . Reaktionen specificitet är också mycket större i H / D = 3 där en enda PCR-produkt erhålls, samtidigt som flera ospecifik produkter genereras vid H / D = 9 där flödet fältet fällorna vätska element i ogynnsamma termisk banor under längre perioder.

Figur 1. Termisk konvektion i en cylindrisk kammare vars övre och nedre ytorna hålls vid olika fasta temperaturer. Om temperaturen i botten ytan är högre än i toppen, är en vertikal densitetsgradient etablerad inom den medföljande vätska som kan generera ett mönster cirkulatorisk flöde. Med rätt val av geometriska parametrar (höjd h och diameter d), kan den konvektiva flödet fältet utnyttjas för att aktivera PCR termocykling när de övre och nedre ytorna är manintained nära glödgning och denaturering temperaturer, respektive (gravitationen verkar vertikalt nedåt).

Figur 2. (A) Viktiga komponenter i en konvektiv flöde PCR thermocyler. En reaktor patron består av en polykarbonat block som innehåller en rad cylindriska kammare. Blocket är inklämt mellan en topplatta avsedd att anslutas till ett cirkulerande vatten bad och en bottenplatta som omfattar inbyggda värmare. (B) PCR-reagens lastas och förseglade inne i reaktorn kassetten, efter vilken enheten är monterad för att utföra reaktionen. Efter avslutad, kan procucts lätt pipetteras ut för senare analys.

Figur 3. Computational simuleringar av 3-D konvektiva flödet fält som genereras inuti cylindriska reaktorer med temperaturer på 53 och 96 ° C införas på toppen och botten ytor, respektive. Resultaten redovisas i proportioner av (a) h / d = 9 (38,2 mikroliter reaktor volym) och (b) h / d = 3 (18,5 mikroliter reaktor volym). En representant bana följt av en vätska inslag färdas genom 3D-flödet fält visas längst till vänster tillsammans med topp-och sida projektioner av vägen, motsvarande tomt på temperatur kontra tid efter en vätska inslag visas till höger. Den termiska profil på H / D = 9 verkar nära den för en konventionell termocykler, men det kaotiska flödet fältet vid h / d = 3 är counterintuitively gynnsammare för PCR.

Figur 4. DNA-replikation resultat som erhållits i reaktorn geometrier visas i figur 3 (övre och undre ytor låg kvar på 53 och 96 ° C, respektive). (A) PCR är mycket snabbare på h / d = 3, vilket framgår av starka produkter synliga efter bara 10 min av reaktionstid (M: 100 bp stege, körfält 1-4: produkter från parallella reaktioner i 4 olika cylindriska kammare). (B H / D = 9 kräver minst 20 min före synliga produkterna iakttas, och flera band är uppenbara visar replikering av icke-specifika mål-DNA i tillägg till den önskade produkten (M: 100 bp stege, körfält 1-2: produkter från parallella reaktioner i 2 olika cylindriska kammare).

Discussion

Samspelet mellan flöde och kemisk reaktion kan förändras dramatiskt under påverkan av kaotiska advektion. Men dessa komplexa flöde stater är utmanande att studera, särskilt i realistiska geometrier där 3D-effekter blir viktiga. Rayleigh-Benard konvektion vid H / D> 1 ger inte bara en bekväm plattform för att utforska dessa fenomen, gör sin ansökan för PCR också kopplingen mellan flöde och kemiska reaktioner bli utforskad. Denna unika funktion gör det möjligt att välja ett optimalt flöde stater där kaotiska effekter lagen (counterintuitively) att påskynda takten i DNA-replikation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase kit	Novagen, EMD Millipore	71085-3
TaqMan β-actin Control Reagents kit	Applied Biosystems	401846
Aluminum tape	Axygen Scientific	PCR-AS-200
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Rain-X Anti-Fog	SOPUS Products
Long Gel-loading Pipette Tips	Fisher Scientific	05-408-151
FEP Teflon tape	McMaster-Carr	7562A17
Agarose gel	Bio-Rad	161-3107
TAE running buffer	Bio-Rad	141-0743
SYBR Green I	Invitrogen	S7563
6x Orange Loading Dye	Fermentas	R0631
100 bp DNA ladder sizing marker	Bio-Rad	170-8202