Summary
Beschrijven we een nieuwe methode om DNA-replicatie uit te voeren via de polymerase chain reaction (PCR). Thermische convectie wordt benut om continu pendeldienst tussen de reagentia denatureren, gloeien, en uitbreiding voorwaarden door het handhaven van tegenovergestelde vlakken van de reactor bij constante temperatuur. Dit inherent eenvoudige ontwerp belooft om een snelle PCR meer toegankelijk.
Abstract
Veel moleculaire biologie assays hangen op een bepaalde manier op de polymerase chain reaction (PCR) om een aanvankelijk verdunnen doelwit DNA-monster te versterken een detecteerbare concentratie niveau. Maar het ontwerp van de conventionele PCR thermocycling hardware, voornamelijk op basis van massieve metalen verwarming blokken waarvan de temperatuur wordt geregeld door thermo-elektrische kachels, beperkt de haalbare reactiesnelheid 1. Grote elektrische stroom is ook nodig om herhaaldelijk warmte en het reactiemengsel afkoelen, het beperken van de mogelijkheid om deze instrumenten in te zetten in een draagbaar formaat.
Thermische convectie heeft ontpopt als een veelbelovend alternatief thermocycling benadering die het potentieel heeft om te overwinnen deze beperkingen 2-9 is. Convectieve stromen zijn een alledaags verschijnsel in een diverse reeks van instellingen, variërend van de atmosfeer van de aarde, de oceanen, en interieur, tot decoratieve en kleurrijke lava lampen. Vloeiende beweging is gestart op dezelfde manier in elk geval: een drijfvermogen gedreven instabiliteit ontstaat wanneer een beperkte hoeveelheid vloeistof wordt blootgesteld aan een ruimtelijke temperatuurgradiënt. Deze zelfde verschijnselen bieden een aantrekkelijke manier om PCR thermocycling uit te voeren. Door het toepassen van een statische temperatuur gradiënt over een goed ontworpen reactor geometrie, kan een continue circulatie-stroom worden vastgesteld dat bij herhaling zal PCR-reagentia transport door middel van temperatuur zones in verband met de denaturering, gloeien, en uitbreiding stadia van de reactie (figuur 1). Thermocycling kan dus worden bediend in een pseudo-isotherme manier door eenvoudigweg twee tegenovergestelde vlakken op vaste temperatuur, het volledig afschaffen van de noodzaak om herhaaldelijk verwarming en koeling van het instrument.
Een van de belangrijkste uitdagingen voor het ontwerp van de convectieve thermocyclers is de noodzaak om de ruimtelijke snelheid en temperatuur uitkeringen nauwkeurig controle binnen de reactor om ervoor te zorgen dat de reagentia opeenvolgend de juiste temperatuur zones voor een voldoende lange periode 10,11 bezetten. Hier beschrijven we resultaten van onze inspanningen om de volledige 3-D snelheid en temperatuur-distributies sonde in microschaal convectieve thermocyclers 12. Onverwacht hebben we ontdekt dat er een subset van complexe stromen trajecten die zeer gunstig zijn voor PCR te wijten aan een synergetische combinatie van (1) continue uitwisseling tussen de stroom paden dat voorziet in een verbeterde kans voor reagentia aan proeven van de volledige reeks van optimale temperatuur profielen, en ( 2) meer tijd doorgebracht in de uitbreiding temperatuur zone de snelheidsbepalende stap van de PCR. Extreem snelle DNA-amplificatie keer (minder dan 10 min) zijn haalbaar in reactoren ontwikkeld om deze stromen te genereren.
Protocol
1. Basisontwerp van de Convectieve Thermocycler
- We hebben geconstrueerd een eenvoudige convectieve thermocycling apparaat dat bestaat uit verwisselbare plastic reactiekamer "cartridges" die zijn ingeklemd tussen twee aluminium platen, waarvan temperaturen worden onafhankelijk gecontroleerd 7 (figuur 2).
- Cilindrische reactor putten worden ingebed door het bewerken arrays van gaten in polycarbonaat blokken, met verschillende combinaties van gat diameter en plastic plaatdikte gebruikt om de gewenste aspect ratio (hoogte / diameter = h / d) te bereiken. Twee verschillende reactor geometrieën worden beschouwd als in de hier gepresenteerde resultaten: h / d = 9: h = 15,9 mm, d = 1,75 mm, 38,2 pL volume; h / d = 3: h = 6,02 mm, d = 1,98 mm, 18,5 uL volume.
- De onderkant van de reactor wordt verwarmd met behulp van een aluminium blok met een cartridge heaters gekoppeld aan een microprocesser gedreven temperatuurregelaar.
- De temperatuur op de bovenste van de reactor oppervlak wordt geregeld met behulp van een aluminium blok aangesloten op een recirculerende water bad.
- Het geheel wordt samen geklemd met behulp van nylon schroeven van thermische geleiding tussen de conflicterende aluminium blokken te beperken.
2. Voorbereiding en laden van de PCR-reactiemengsel
- Een typische 100 pi reactiemengsel bevat 10 pi van 10x bufferoplossing, 6 ul 25 mM MgCl2, 10 pi van dNTPs (2 mM elk), 41,2 pi van DI water, 10 ul van β-actine probe, 10 pi van β -actine forward primer, 10 ul van β-actine reverse primer, 2 pi van het menselijk genoom template-DNA (10 ng / pi) en 0,8 pi van KOD DNA-polymerase (2,5 eenheden / pi).
- Voor het laden reagentia, afdichting van de onderkant van de PCR kamer met behulp van een dunne plaat van aluminium tape.
- Spoel de reactor putten met een 10 mg / ml waterige oplossing van bovine serum albumine, gevolgd door Rain-X Anti-Fog.
- Pipetteer reagentia in de reactor putten met lange gel-loading pipetpunten en sluit de bovenkant met FEP Teflon tape.
3. Het uitvoeren van de reactie in de convectieve Thermocycler
- Voor het begin van de reactie, verwarm zowel aluminium blokken om de gewenste bovenste en onderste oppervlakte temperaturen.
- Sandwich de plastic reactor geladen met PCR-reagentia tussen het aluminium verwarmings-blokken, en snel samen klem de montage met behulp van nylon schroeven.
- Nadat de reactie is verlopen voor de gewenste tijd, het uitschakelen van de verwarming en plaats de onderste (warm) oppervlak van het apparaat op de top van een gekoelde metalen blok snel afkoelen en stop de convectieve stromen.
- Verwijder de plastic reactor en pipet de producten uit de putten (met behulp van de lange laad-gel tips) voor verdere analyse.
4. Het uitvoeren van gelelektroforese Analyse
- Bereid een 2 gew% agarosegel door het verwarmen van 10 g agarose met 500 ml 1x buffer op een hete plaat roeren totdat de oplossing helder wordt.
- Laad de agarose gel in de casting lade en plaats de kam. Laat de gel voor ~ 30 minuten.
- Verwijder de kam en voeg 1x TAE buffer totdat de gel is ondergedompeld.
- Fluorescerend gekleurde DNA-monsters bevatten 2 pl 100x SYBR Green I-oplossing, 2 pl DNA-monster, 2 pl 6x Oranje laden Dye, en 4 ul TAE buffer.
- Voeg de DNA-monsters in de putten en lopen de scheiding op 60 V gedurende 1 uur met een 100 bp DNA ladder sizing marker.
- Verwijder de gel en fotograferen onder UV-licht om het resultaat te verkrijgen.
5. Representatieve resultaten:
Optimaal ontwerp van convectieve thermocyclers impliceert het kiezen van de juiste reactor geometrie die een bloedsomloop stroom in staat is het transport van reagentia door de sleutel temperaturen die betrokken zijn bij het PCR-proces zal genereren. De geometrische parameters die kunnen worden gevarieerd in de cilindrische reactoren het hier om gaat zijn de hoogte (h) en diameter (d), of equivalent van de aspect ratio (h / d). We hebben onderzocht de 3-D stroming velden in convectieve PCR reactoren over een scala aan verschillende beeldverhoudingen gebruik van computational fluid dynamics (CFD), en vond dat onverwacht complexe patronen kunnen ontstaan. Nog belangrijker is, heeft onze analyse ontdekt een subset van deze complexe stroom velden die aanzienlijk versnellen de reactie 12.
Deze geometrische effecten kunnen duidelijk worden gezien door het vergelijken van de stroom velden in reactoren bij hoge en lage aspect ratio's. In de hoge aspect ratio geval (h / d = 9; een lange, magere cilinder) zijn vloeibare elementen advectie langs trajecten tracing paden die in wezen zijn gesloten lussen, en ze zijn opgesloten in om dezelfde paden te volgen gedurende lange perioden van tijd (Figuur 3a). Bijgevolg is er weinig gelegenheid voor uitwisseling tussen flage trajecten die reagentia bloot te stellen aan de optimale volgorde van thermische omstandigheden voor PCR (schommelend tussen de gloeien en denatureren uitersten aan boven-en onderkant van de reactor oppervlakken) en het veel grotere geheel van de resterende trajecten die niet bijdragen aan versterking (dichter heeft in het midden van de reactor).
De stroom veld is veel anders op een kleinere aspect ratio (h / d = 3; een korter, breder cilinder), steeds meer chaotisch in die zin dat het vloeibare element trajecten niet langer gesloten paden (figuur 3b) te volgen. Dus, hoewel reagentia worden onderworpen aan een meer complexe temperatuur profiel, vloeistof-elementen zijn in staat om een veel breder scala van trajecten te onderzoeken, zodat meer van het reagens volume heeft een kans om optimale thermische profielen ervaring. Deze resultaten suggereren dat counterintuitively terwijl de individuele trajecten doorstroming op h / d = 9 mei om gunstiger te zijn voor PCR worden weergegeven door het produceren van de temperatuur profielen die "look" vergelijkbaar met die gebruikt in een conventionele thermocycler, de chaotische aard van de stroming op h / d = 3 domineert uiteindelijk op een mondiale schaal door het bevorderen van intensievere uitwisseling, zodat de reagentia niet bekneld raken in ongunstige trajecten voor zeer lang.
Om deze hypothese te testen en te bepalen welke reactor geometrie was gunstiger voor PCR, gebruikten we beiden aan PCR replicatie van een 295 bp doelwit worden geassocieerd met het β-actine-gen van een menselijk genomisch DNA template uit te voeren. Opmerkelijk is dat we regelmatig bereikt versterking van de juiste doelgroep product in slechts 10 minuten bij h / d = 3 (figuur 4a), terwijl dezelfde reactie vereist ten minste 20 minuten voor detecteerbare producten werden waargenomen bij h / d = 9 (figuur 4b) . De specificiteit van de reactie is ook veel groter is bij h / d = 3 waar een enkele PCR-product is verkregen, terwijl meerdere niet-specifieke producten zijn gegenereerd op h / d = 9, waar de stroming veld vallen vloeistof elementen in ongunstige thermische trajecten voor langere tijd.
Figuur 1. Thermische convectie in een cilindrische kamer, waarvan boven-en onderkant zijn gehandhaafd op verschillende vaste temperaturen. Als de temperatuur aan de onderkant is hoger dan aan de top, is een verticale dichtheidsgradiënt die binnen de ingesloten vloeistof die in staat is om het genereren van een bloedsomloop stromingspatroon. Met de juiste keuze van geometrische parameters (hoogte h en diameter d), kan de convectieve stromingsveld worden aangewend om PCR thermocycling bedienen wanneer de boven-en onderkant zijn manintained de buurt van gloeien en denaturering temperaturen, respectievelijk (zwaartekracht verticaal naar beneden).
Figuur 2. (A) Belangrijke onderdelen van een convectieve stroming PCR thermocyler. Een reactor cartridge bestaat uit een polycarbonaat blok met een reeks van cilindervormige kamers. Het blok is ingeklemd tussen een top plaat ontworpen om te worden aangesloten op een circulerend waterbad en een bodemplaat waarin embedded kachels. (B) De PCR-reagentia worden geladen en verzegeld in de reactor cartridge, waarna het apparaat is gemonteerd om de reactie uit te voeren. Na voltooiing kan de procucts gemakkelijk worden gepipetteerd uit voor verdere analyse.
Figuur 3. Computational simulaties van de 3-D convectieve stroming velden die in cilindervormige reactoren met temperaturen van 53 en 96 ° C opgelegd aan de boven-en onderkant, respectievelijk. Resultaten zijn weergegeven in beeldverhoudingen van (a) h / d = 9 (38,2 pi reactor volume) en (b) h / d = 3 (18,5 pi reactor volume). Een vertegenwoordiger traject, gevolgd door een vloeistof element reis door de 3D stromingsveld wordt getoond aan de linkerkant, samen met top-en zijaanzicht projecties van het pad, de bijbehorende perceel van temperatuur versus tijd na een vloeistof element wordt getoond aan de rechterkant. De thermische profiel op h / d = 9 lijkt dicht bij die van een conventionele thermocycler, maar de chaotische stroom veld h / d = 3 is counterintuitively gunstiger voor PCR.
Figuur 4. DNA-replicatie resultaten die zijn verkregen in de reactor geometrieën weergegeven in figuur 3 (boven-en onderzijde werden gehouden op 53 en 96 ° C, respectievelijk). (A) PCR is sterk versneld op h / d = 3, zoals duidelijk door sterke producten zichtbaar na slechts 10 minuten van de reactie tijd (M: 100 bp ladder, lanen 1-4: producten van parallelle reacties in 4 verschillende cilindervormige kamers). (B h / d = 9 vereist ten minste 20 minuten voor zichtbare producten in acht worden genomen, en meerdere bands zijn duidelijk aangeeft replicatie van niet-specifieke doel-DNA in aanvulling op de gewenste product (M: 100 bp ladder, lanen 1-2: producten van parallel reacties in 2 verschillende cilindervormige kamers).
Discussion
De wisselwerking tussen stroming en chemische reactie kan drastisch veranderen onder invloed van de chaotische advectie. Maar deze complexe stroom staten zijn uitdagend om te studeren, met name in realistische geometrieën, waar 3D-effecten worden belangrijk. Rayleigh-Benard convectie op h / d> 1 niet alleen een handig platform om deze verschijnselen te verkennen, de toepassing daarvan op PCR uit te voeren maakt het ook mogelijk de koppeling tussen de stroming en chemische reacties worden gepeild. Deze unieke mogelijkheid maakt het mogelijk om een optimale doorstroming staten waar chaotisch effecten optreden (counterintuitively) om de snelheid van de DNA-replicatie te versnellen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We dankbaar danken T. Ragucci, B. Watkins, S. Wong, en B. Wallek op Lynntech, Inc voor technische bijstand en vele nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door de Amerikaanse National Science Foundation (NSF) onder te verlenen cbet-0933688.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase kit | Novagen, EMD Millipore | 71085-3 | |
| TaqMan β-actin Control Reagents kit | Applied Biosystems | 401846 | |
| Aluminum tape | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Rain-X Anti-Fog | SOPUS Products | ||
| Long Gel-loading Pipette Tips | Fisher Scientific | 05-408-151 | |
| FEP Teflon tape | McMaster-Carr | 7562A17 | |
| Agarose gel | Bio-Rad | 161-3107 | |
| TAE running buffer | Bio-Rad | 141-0743 | |
| SYBR Green I | Invitrogen | S7563 | |
| 6x Orange Loading Dye | Fermentas | R0631 | |
| 100 bp DNA ladder sizing marker | Bio-Rad | 170-8202 |
References
- Spitzack, K. D., Ugaz, V. M. Microfluidic Techniques: Reviews and Protocols. Methods in Molecular Biology. Minteer, S. D. , Humana Press. Vol. 321 (2005).
- Krishnan, M., Ugaz, V. M., Burns, M. A. PCR in a Rayleigh-Bénard convection cell. Science. 298, 793-793 (2002).
- Braun, D., Goddard, N. L., Libchaber, A. Exponential DNA replication by laminar convection. Physical Review Letters. 91, 158103-158103 (2003).
- Chen, Z., Qian, S., Abrams, W. R., Malamud, D., Bau, H. Thermosiphon-based PCR reactor: experiment and modeling. Analytical Chemistry. 76, 3707-3715 (2004).
- Wheeler, E. K. Convectively driven polymerase chain reaction thermal cycler. Analytical Chemistry. 76, 4011-4016 (2004).
- Krishnan, M., Agrawal, N., Burns, M. A., Ugaz, V. M. Reactions and fluidics in miniaturized natural convection systems. Analytical Chemistry. 76, 6254-6265 (2004).
- Ugaz, V. M., Krishnan, M. Novel convective flow based approaches for high-throughput PCR thermocycling. Journal of the Association for Laboratory Automation (JALA). 9, 318-323 (2004).
- Yao, D. J., Chen, J. R., Ju, W. T. Micro-Rayleigh-Benard convection polymerase chain reaction system. Journal of Micro-Nanolithography MEMS and MOEMS. 6, 043007-043007 (2007).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A Pocket-sized Convective PCR Thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46, 4316-4319 (2007).
- Yariv, E., Ben-Dov, G., Dorfman, K. D. Polymerase chain reaction in natural convection systems: A convection-diffusion-reaction model. Europhysics Letters. 71, 1008-1014 (2005).
- Allen, J. W., Kenward, M., Dorfman, K. D. Coupled flow and reaction during natural convection PCR. Microfluidics and Nanofluidics. 6, 121-130 (2009).
- Muddu, R., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. Accelerated Biochemistry by Chaotic Stirring. , Forthcoming (2010).
