הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

Summary

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

Abstract

הצעדים הראשונים בחזון חוליות להתרחש כאשר אור מגרה את מוט חרוט קולטני האור ברשתית ^1. מידע זה הפרדה מכן לתוך במה שמכונה המסלולים לסירוגין. Photoreceptors אות מידע אור על התאים דו קוטבית (BCS), אשר depolarize בתגובה מגדיל (ביום BCS) או יורד (כבוי BCS) בעוצמת האור. הפרדה זו של מידע אור נשמר ברמה של התאים הגנגליון ברשתית (RGCs), אשר יש דנדריטים stratifying ב sublamina או כיבוי של השכבה הפנימית plexiform (IPL), שם הם מעוררים לקבל קלט ישירות כבוי BCS, או stratifying ב sublamina ביום של IPL, שם הם מקבלים קלט מעוררים ישיר ב BCS. הפרדה זו של מידע בנוגע להגדיל או להקטין את התאורה (לסירוגין מסלולים) נשמרת וסימן המוח במקביל.

RGCs הם תאים הפלט של הרשתית, ועל כן הם תא חשוב ללמוד כדי להבין כיצד מידע האור הוא אותת גרעינים ויזואלי במוח. ההתקדמות בגנטיקה העכבר מעל בעשורים האחרונים הביאו מגוון של פלורסנט העכבר קווי הכתב שבו אוכלוסיות מסוימות RGC מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי כדי לאפשר זיהוי של תת RGC ^{2 3 4} וספציפי מיקוד הקלטה אלקטרו. כאן, אנו מציגים שיטה הקלטה התגובות אור מתאי הגנגליון שכותרתו fluorescently בהכנה, פגע ברשתית מבודדים. זו הכנה רשתית מבודד מאפשר הקלטות RGCs בו סוכת הדנדריטים הוא שלם התשומות לרוחב סוכת הדנדריטים כולה RGC נשמרים. שיטה זו ישימה על פני מגוון רחב של תת תא גנגליון, והוא מקובל מגוון רחב של תא בודד טכניקות פיזיולוגיות.

Protocol

שימוש הצהרת בעלי חיים: בעלי חיים טופלו בהתאם להנחיות שתוארו מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, תוך שימוש בפרוטוקולים אושרה על ידי אוניברסיטת מינסוטה Animal Care מוסדיים ועדת שימוש.

1) הכנה של פתרונות

1. לפני ביצוע הקלטה אלקטרו, פתרונות תאיים, תאית, ואת האנזים צריכים להיות מוכנים.
2. פתרון תאיים: האחד לערבב בבקבוק (8.8g) של המדיום אבקת "איימס (סיגמא) עם l 1 של H ₂ O ו - 1.9 גרם של סודיום ביקרבונט (23 mM). בנקודות כל פתרון תאיים רווי 95% O ₂ / 5% ₂ CO בתערובת הגזים. העברת 200 מ"ל כדי מבחנה לאחסון הרשתית. מניחים את הפתרון הנותרים במיכל זלוף מערכת זלוף הכבידה פעם הוא רכוב הרשתית.
3. תאיים פתרון: פתרון תאיים צריך נעשו בעבר aliquoted מכן לתוך 500-1000 aliquots μL ומאוחסנים ב -20 ° C. פתרון תאיים משתנה בהתאם הניסוי הצורך, עבור הקלטות מהדק הנוכחי המוצג כאן אנו משתמשים (מ"מ): 125-K-gluconate, 2 CaCl _2, 2 MgCl _2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na _2-ATP, 0.5 mM NaGTP עד 7.2 pH עם KOH ^5. נותב ניאון כגון 10 מיקרומטר Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen) ניתן להוסיף לדמיין דנדריטים במהלך הניסוי, ואת neurobiotin (0.3%) יכול להיכלל גם לניתוח של האנטומיה תא הבאים ההקלטה. כאשר מוכן להקליט, הפשרה פתרון תאיים.
4. פתרון אנזימים: שילוב 10,000 יחידות collagenase (כימיקלים וורטינגטון) עם Hyaluronidase מ"ג 83 (כימיקלים וורטינגטון) לתוך 4.150 מ"ל של תמיסת תאי. חנות ב 50 aliquots μL ב -20 ° C. Aliquots יכול לשמש למשך מספר שבועות. כאשר מוכן לטפל ברשתית, לדלל aliquot לתוך μL 500 של פתרון תאיים מבעבע.
5. פוספט שנאגרו פתרון (PBS): ב 800 מ"ל של H ₂ O להוסיף 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.4 גרם של Na ₂ HPO ₄ ו - 0.24 גרם של KH ₂ PO _4. תביאו את ה-pH ל -7.4 עם NaOH. כוון את עוצמת הקול עד 1 ל
6. מאגר פוספט 0.2 M: ב 800 מ"ל של H ₂ O להוסיף 21.8 גרם של Na ₂ HPO ₄ ו - 6.4 גרם של לאא ₂ PO _4. תביאו נפח 1 ל
7. Paraformaldehyde פתרון 4%: מחממים 50 מ"ל H ₂ O עד 60 ° C. הוסף paraformaldehyde 4G, מערבבים במשך כמה דקות. הוסף כמה טיפות של NaOH 1M (כ 5 טיפות), לבחוש עד פתרון ברור. הוסף 50 מ"ל 0.2 M חיץ פוספט לתוך כוס. בדוק pH בעזרת רצועות ה-pH (~ 7.4). סינון מגניב.
8. פתרון חסימת (נסיוב עיזים 10%, 0.5% TritonX100): ב 1.8 מ"ל של PBS להוסיף 0.2 מ"ל של סרום עיזים 10 μL טריטון X-100. TritonX-100 משמש permeabilise הרקמה.
9. Streptavidin פתרון (נסיוב עיזים 5%, 0.5% TritonX100, 1:500 streptavidin 594): ב 1.9 מ"ל של PBS להוסיף 0.1 מ"ל של סרום עז, 10 μL טריטון X-100 ו - 4 μL של streptavidin 594.

2) בידוד של הרשתית מן העכבר

Dissection הכלים הדרושים: 1 # 2 מלקחיים, 2 # 5 מלקחיים, מספריים ophthalmologic

1. להרדים העכבר על פי פרוטוקולים שאושרו, במקרה זה ה-CO ₂ מחנק ועל גלגל העין enucleate בעדינות על ידי החדרת זווית # 2 מלקחיים מאחורי העין והסרת את גלגל העין.
2. מניחים את גלגל העין לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ עם פתרון תאיים. חותכים את עצב הראייה ואת כל שרירי extraocular המצורפת או רקמת החיבור באמצעות מספריים ophthalmologic. לחתוך את הקרנית עם מספריים ophthalmologic ולשלוף את העדשה באמצעות # 5 מלקחיים. לקרוע את בלובן העין בעזרת זוג מלקחיים # 5 ולהשתמש מלקחיים לנתק את עצב הראייה ברשתית שבו והלחמית נפגשים דיסק אופטי. לקלף בעדינות הרשתית הרחק עיינית. טיפ: האם כל צעד על הרשתית הן לפני המעבר לשלב הבא כדי למזער את הזמן.
3. שימוש במלקחיים כדי להסיר הזגוגית מחוברת לרשתית. זה יכול להתבצע על ידי "תופס" את הזגוגית השקופה מעל הרשתית עם מלקחיים. זגוגי, אם הוסר בהצלחה, צריך להיות גלוי כחומר, ברור דביקות על מלקחיים. טיפ: בחותכו הרשתיות ב וחצי לאחר ההסרה של הזגוגית יהיה למקסם את כמות רקמת שמיש ולעשות הרכבה בחדר קלה יותר.
4. שמור את הרשתיות בפתרון תאיים מחומצן בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה עם אור הסביבה מינימלי עד שהם מוכנים להתעכל. הרשתית ניתן לאחסן בצורה זו עבור ~ 6 שעות.

3) טיפול של הרשתית בתערובת האנזים הרכבה בתא הקלטה

1. מדולל aliquot של collagenase / hyaluronidase בתמיסה 500 תאיים μL, הפתרון מקום בצלחת פטרי 35 מ"מ ולהעביר את הרשתית.
2. שמור את הרשתית, מכיליםing צלחת פטרי, מכוסה בחושך, ב O2 95% / 5% CO ₂ בסביבה במשך 15 דקות עם תסיסה עדינה. צעד זה מסייע בעיכול כל זגוגי הנותרים ומאפשר גישה קלה יותר שכבת תא גנגליון. עצה: עבור הרשתיות של בעלי חיים צעירים עם זגוגי פחות או אם הם נצפו תופעות לוואי, זמן יכול להתקצר ~ 5 דקות.
3. הסר הרשתית ממדיום אנזים המכיל ולשטוף בהרחבה פתרון תאיים
4. מעבירים את הרשתית לתוך ההקלטה קאמרית ⁶ עם שכבת photoreceptor כלפי מטה. וויק משם נוזלים הנותרים עם טפטפת או רקמות לרדד הצדדים של הרשתית לשטח רקמות נזהר לגעת רק בשולי הרשתית, במיוחד הימנעות ממגע עם שכבת תא גנגליון. מניחים טבעת פלטינה עם רשת ניילון על הרשתית לעגן את הרקמה מיד למלא את התא עם פתרון תאיים.
5. הר קאמרית הקלטה לבמה מיקרוסקופ, לצרף צינור עבור זלוף הכבידה יניקה ואקום לצרף חוט הקרקע.

4) לוקליזציה של תאים EGFP הגנגליון להביע וגירוי אור

1. Perfuse הרשתית על ידי כוח הכבידה עם פתרון תאיים על 1 שיעורי mL / min או מהיר יותר. עצה: אם קצב טפטוף איטי מדי, הרקמה לא יהיה מספיק חמצן איתות הסינפטי יכול להיות מופרת.
2. מלאו פיפטה הקלטה עם פתרון תאיים והכנס אותו לתוך מחזיק פיפטה. טיפ: pipettes עם התנגדויות בטווח של 3 עד 5MΩ לתת את התוצאות הטובות ביותר.
3. דמיינו את הרשתית תחת אינפרא אדום התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) אופטיקה בהגדלה נמוכה (אובייקטיבי 10X, NA 0.3) כדי למקם את פיפטה ההקלטה. אור אינפרא אדום משמש לצמצם את החשיפה הרשתית לאור הנראה ולמזער הסתגלות קלה. מעבר הגדלה גבוהה (40X אובייקטיבי, NA 0.8) ולהביא אלקטרודה לתוך נוף מעל רקמות.
4. בהגדלה גבוהה (40X אובייקטיבי), להאיר את הרשתית עם epifluorescence (480 ננומטר במשך EGFP) ובחר תא גנגליון סימן פלורסנט על צג המחשב באמצעות קלטת (איור 1A).
5. תחת תאורה DIC אינפרא אדום, מיקום האלקטרודה הקלטה ליד התא גנגליון ממוקד (איור 1A). אזור נקי מיד מכסה תא על ידי הפעלת לחץ חיובי עדין אלקטרודה הקלטה באמצעות מזרק פלסטיק 12cc קשור לבעל פיפטה עם צינורות פוליאתילן. על המגבר, אפס כל קיזוז מתח. אלקטרודה מקום על תא גנגליון שנבחרו עד גומת חן מופיע על פני התא.
6. עם המגבר במצב מהדק מתח, להחיל על הדופק לבדוק ולנטר את העברת הזרם דרך פיפטה. החל לחץ שלילי כדי ליצור חותם בין האלקטרודה בתא. שחרור לחץ שלילי כאשר התא מתחיל חותם ולהמתין מחזיק הנוכחי מעיד על חותם חשמל GΩ בין הממברנה של התא פיפטה. החל פולסים עדין של לחץ שלילי עד הארעיים קיבולי להופיע ולאחר מכן שחרר כל הפעלת לחץ. טיפ: אם (סדרה) הגישה התנגדות גבוהה (> 30MΩ), זה יכול להיות לעיתים קרובות על ידי להשתפר נוסף, פולסים עדין מאוד של לחץ שלילי.
7. לאחר חותם יציבה הושג להחיל הדופק של לחץ שלילי. אחרי מצב התא כולו מתקבל, לאפשר לתא חשוך להסתגל במשך 5 דקות. שיא, במצב הנוכחי בתגובה, מהדק לגירוי, שדה מלא אור לבן (איור 1B).
8. בעקבות ההקלטה, Alexafluor-594 יהיה מתפזרת על דנדריטים. נותב ניתן דמיינו תחת epifluorescence ב 594 ננומטר משמש כדי לקבוע אם תא הגנגליון הוא on-, Off-או Bi-מרובדת על ידי מעבר בין אופטיקה אינפרא אדום ו epifluorescence DIC ^5.
9. אם neurobiotin נכלל פיפטה ו הרשתית הולך להיות מעובד על אימונוהיסטוכימיה, אז פיפטה חייב להיות חזר בו בעדינות כדי לספק הפרעה מזערית של הממברנה.

5) ניתוח של האנטומיה של תאים הגנגליון מוקלט

מילוי עם neurobiotin מאפשר ניתוח מפורט יותר המורפולוגי של תאים הגנגליון הבאים ההקלטה. עצה: אם מתאמים ספציפיים בין תא גנגליון רשמה ומורפולוגיה מפורט הרצוי, זה עשוי להיות הטוב ביותר כדי להקליט למלא רק אחד RGC לכל הכנה.

1. אם neurobiotin נכלל הפתרון תאיים אז במקום הרשתית בפתרון paraformaldehyde ולתקן לילה בשעה 4 ° C.
2. יש לשטוף ב-PBS, לפחות 2 שעות, לפחות 6 שינויים. מעבירים את הרשתית לצלחת המכילה פתרון חסימה. השאר בחסימת פתרון 2 שעות, בטמפרטורת החדר על שייקר.
3. החלף את הפתרון חוסם את הפתרון streptavidin. דגירה 2 ימים 4 ° C על שייקר. שוטפים את הרשתית של PBS, 6 שטיפות, 20 דקות כל אחד.
4. הר הרשתית עם Vectashield בשקופית זכוכית.הרשתית יש להציב עם לתאי הגנגליון למעלה. בצע מיקרוסקופיה confocal (תרשים 1C).

נציג תוצאות

אם הרשתית בריא לנתיחה בוצעה בהצלחה, בתאי הגנגליון הפרט צריך להיות גלוי תחת DIC בהגדלה גבוהה (איור 1 א). הרשתית לא בריאה יהיה גרעינים גדולים, מגורען ויש מבוטלים. אם התגובה הסינפטי של תא גנגליון נתון שלם, אז התא צריך להגיב בתחילת אור או לקזז עם פוטנציאל פעולה, במקרה של תא גנגליון מהותית, רגישים (איור 1B), שלילת קוטביות מתמשכת.

באיור 1. לוקליזציה, הקלטה, מכתים התא שכותרתו fluorescently הגנגליון ברשתית. (א) RGC GFP חיובית דמיינו תחת תאורה epifluorescent בהגדלה 40X (פאנל משמאל) תחת תאורה DIC (פאנל מימין). (ב) אור בתגובה Synaptic תא רגיש לאור מיסודם M2 הגנגליון ברשתית רשמה במצב כל תא מהדק הנוכחית מ RGC שכותרתו fluorescently. (ג) M1 רגישים מהותית תא גנגליון ברשתית כי זוהה תחת epifluorescence, ממוקד עבור כל הקלטה תאים, מלא neurobiotin, ומעובד לאחר מכן על אימונוהיסטוכימיה.

Discussion

טכניקה זו החלה על כל תא גנגליון ברשתית הקלטות של הרשתית מבודד. אמנם בשורה העכבר בשימוש מעל רגישים באופן מהותי, melanopsin-לבטא RGCs מסומנים עם EGFP ^{2, 5,} פרוטוקול זה ניתן להעברה בקלות אחר קווי RGC שכותרתו fluorescently או ניתן להכליל להקליט RGCs שנבחרו באופן אקראי גם כן. טכניקה זו חשוב במיוחד משום סוכת הדנדריטים של כל RGC ונוירונים שלו בהתאמה קלט נותרים שלמים לחלוטין. הקלטות יכול בקלות להתבצע מצבי מהדק הנוכחי או מתח, תאים המצורפת או רופף, תיקון תצורה, או יכול גם לשמש עבור תיקון גרעיני, בתוך או מחוץ הקצוב תצורות תיקון של קרום התא גנגליון ברשתית. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת בקלות להקליט fluorescently תאים שכותרתו amacrine העקורים ⁷ או אפילו אי - עקורים תאים amacrine ⁸ מגבלה אחת של ניצול של הקרינה למקם תאים הגנגליון היא כי הרשתית חייבת להיות תמיד נחשף לאור זיהוי RGC לפני ההקלטה . לכן, הכנה זה לא בהכרח מתאים הקלטה מוט בתיווך תגובות אלא אם כן chromophore אקסוגניים נכלל הפתרון אמבטיה ו / או עיינית ואת פיגמנט אפיתל של הרשתית נשארים מחוברים הרשתית ^9. אם המטרה היא להקליט מוט בתיווך התגובות אור, אז זהירות מיוחדת יש לנקוט כדי למנוע הלבנת של rhodopsin photopigment. Dissection חייב להתבצע בתנאים אור אינפרא אדום (כלומר ^10).

כדי לבצע דיסקציה מוצלח, חשוב כי לנתיחה להתבצע במהירות האפשרית. חשוב במיוחד כי זגוגי יוסר בהצלחה עם מלקחיים. אם הזגוגית היא שנותרו, ולאחר מכן בעקבות עיכול אנזים הרשתית יהיה מכוסה בסרט דביק ביצוע תיקון מוצלח קשה. כדי להשיג הקלטות טוב, חשוב במיוחד כי הרשתית היטב מחומצן, כלומר הפתרון הוא להיות תאיים מבעבע במרץ את קצב הזרימה הוא גבוה מספיק דרך החדר. חשוב גם כדי לצמצם את החשיפה לאור של רקמת הרשתית פעם מבודד עיינית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
AlexaFluor 594 Hydrazyde	Invitrogen	A10442
Neurobiotin	Vector Laboratories	SP1120
Electrodes	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Ophthalmologic Scissor	Fine Science Tools	15000-00
Streptavidin 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210