Summary
Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.
Abstract
De eerste stappen in gewervelde visie plaats te vinden wanneer het licht stimuleert de staafjes en kegeltjes fotoreceptoren van het netvlies 1. Deze informatie wordt vervolgens gescheiden in wat bekend staat als de ON en OFF paden. De fotoreceptoren signaal licht informatie naar de bipolaire cellen (BCS), die depolariseren in reactie op toe (On BCS) of afneemt (Uit BCS) in lichtintensiteit. Deze scheiding van het licht informatie wordt gehandhaafd op het niveau van de retinale ganglioncellen (RGC), die dendrieten stratificatie in ofwel de Off sublamina van de binnenste plexiform laag (IPL), waar ze direct excitatoire input van Off BC's hebben, of stratificatie in Op de sublamina van het IPL, waar ze direct excitatoire input van On BCS. Deze scheiding van informatie met betrekking tot stijgingen of dalingen in verlichting (de aan-en uitzetten pathways) is geconserveerd en gesignaleerd naar de hersenen in parallel.
De RGC is de output cellen van het netvlies, en zijn dus een belangrijke cel te bestuderen om te begrijpen hoe licht informatie wordt gesignaleerd aan visuele kernen in de hersenen. Vooruitgang in de muis genetica afgelopen decennia hebben geleid tot een verscheidenheid van fluorescerende reporter muis lijnen waar specifieke RGC populaties zijn gelabeld met een fluorescerend eiwit, zodat voor de identificatie van RGC subtypes 2 3 4 en specifieke targeting voor elektrofysiologische opname. Hier presenteren we een methode voor het opnemen van lichte reacties van fluorescent gelabelde ganglion cellen in een intact, geïsoleerde netvlies voorbereiding. Deze geïsoleerde netvlies voorbereiding zorgt voor opnamen van RGC, waar de dendritische prieel is intact en de ingangen in de gehele RGC dendritische prieel worden bewaard. Deze methode is van toepassing in een verscheidenheid van ganglion cel subtypes en vatbaar is voor een breed scala van single-cell fysiologische technieken.
Protocol
Gebruik van dieren Verklaring: De dieren werden verzorgd in overeenstemming met de richtsnoeren zoals beschreven in voor de verzorging en gebruik van proefdieren, met behulp van protocollen zijn goedgekeurd door de Universiteit van Minnesota Institutionele Animal Care en gebruik Comite.
1) Bereiding van oplossingen
- Voor het uitvoeren van elektrofysiologische opname, intracellulaire, extracellulaire, en enzym oplossingen moeten worden voorbereid.
- Extracellulaire oplossing: mix een fles (8.8g) van middelgrote poedervorm Ames '(Sigma) met 1 liter H 2 O en 1,9 g natriumbicarbonaat (23 mm). Op alle punten de extracellulaire oplossing is verzadigd met 95% O 2 / 5% CO 2-gas mengsel. Transfer 200 ml tot een beker voor netvlies opslag. Plaats de resterende oplossing in het perfusie-systeem container voor de zwaartekracht perfusie keer netvlies is gemonteerd.
- Intracellulaire oplossing: Intracellulaire oplossing moet eerder hebben gemaakt en vervolgens in hoeveelheden verdeeld in 500-1000 pi porties en opgeslagen bij -20 ° C. Intracellulaire oplossing is afhankelijk van de benodigde experiment, voor de huidige klem opnames hier getoonde gebruiken we (in mm): 125 K-gluconaat, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,5 mM NaGTP pH op 7,2 met KOH 5. Een TL-tracer, zoals 10 uM Alexafluor-594 hydrazide (Invitrogen) kunnen worden toegevoegd aan dendrieten tijdens het experiment, en neurobiotin (0,3%) te visualiseren kunnen ook opgenomen worden voor de analyse van cel-anatomie na opname. Als u klaar bent om op te nemen, ontdooien intracellulaire oplossing.
- Enzymoplossing: Combineer 10.000 eenheden Collagenase (Worthington Chemicals) met 83 mg Hyaluronidase (Worthington Chemicals) in 4,150 ml van extracellulaire oplossing. Bewaar in 50 ul porties bij -20 ° C. Monsters kan worden gebruikt voor enkele weken. Als u klaar bent aan het netvlies te behandelen, verdun hoeveelheid in 500 pl van borrelen extracellulaire oplossing.
- Fosfaat gebufferde oplossing (PBS): In 800 ml H 2 O toevoegen 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2 PO 4. Breng de pH op 7,4 met NaOH. Zet het volume op een L.
- 0,2 M fosfaatbuffer: In 800 ml H 2 O toevoegen 21,8 g Na 2 HPO 4 en 6,4 g van NaH 2 PO 4. Breng het volume op een L.
- 4% Paraformaldehyde Oplossing: Verhit 50 ml H 2 O tot 60 ° C. Voeg 4g paraformaldehyde, roer enkele minuten. Voeg enkele druppels 1M NaOH (ongeveer 5 druppels), blijf roeren tot de oplossing helder is. Voeg 50 ml 0,2 M fosfaatbuffer in de beker. Controleer de pH met behulp van pH-strips (~ 7.4). Filter en laat afkoelen.
- Het blokkeren van oplossing (10% geit serum, 0,5% TritonX100): toe te voegen in 1,8 ml PBS 0,2 ml van de geit serum en 10 pi Triton X-100. TritonX-100 dient om permeabilise het weefsel.
- Streptavidine-oplossing (5% geit serum, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidine 594): toe te voegen in 1,9 ml PBS 0,1 ml van de geit serum, 10 pi Triton X-100 en 4 pi Streptavidine 594.
2) Isolatie van het netvlies van muis
Nodig dissectie-instrumenten: 1 # 2 Tang, 2 # 5 Tang, oogheelkundig schaar
- Euthanaseren muis volgens erkende protocollen, in dit geval CO 2 stikken en ophelderen oogbol door voorzichtig het plaatsen van een schuine # 2 pincet achter het oog en het opheffen van de oogbol.
- Plaats de oogbol in een 35 mm petrischaal met extracellulaire oplossing. Snijd de oogzenuw en alle aangesloten extraoculaire spieren of het bindweefsel met behulp van oogheelkundige schaar. Knip het hoornvlies met een oogheelkundige schaar en trek de lens met behulp van # 5 tang. Scheur de sclera met behulp van een paar van # 5 pincet en gebruik de tang aan de oogzenuw, waar het netvlies en sclera ontmoeten op de optische schijf te verbreken. Haal voorzichtig het netvlies weg van de oogschelp. Tip: Doe elke stap op beide netvliezen alvorens naar de volgende stap om tijd te minimaliseren.
- Gebruik een tang om glasvocht aan het netvlies te verwijderen. Dit kan worden uitgevoerd door "grijpen" de transparante glasvocht boven het netvlies met een tang. Het glasvocht, indien deze met succes verwijderd, moet zichtbaar als een heldere, gelatineachtige stof op de tang. Tip: Fineersnijmachine netvlies in de helft na verwijdering van glasvocht zal het bedrag van bruikbare weefsel te maximaliseren en te monteren in de kamer te vergemakkelijken.
- Houd de retina in zuurstofrijke extracellulaire oplossing bij kamertemperatuur in een donkere omgeving met een minimum aan omgevingslicht tot ze klaar om te worden verteerd. Netvliezen kunnen worden opgeslagen op deze manier voor ~ 6 uur.
3) Behandeling van het netvlies met enzym mengsel en montage in de opname kamer
- Verdun een aliquot van collagenase / hyaluronidase in 500 uL extracellulaire oplossing, plaats oplossing in een 35 mm petrischaal en overdracht van het netvlies.
- Houd het netvlies, bevattenING Petri schotel, bedekt en in de duisternis, in een 95% O2 / 5% CO 2-omgeving gedurende 15 minuten onder zacht schudden. Deze stap helpt bij het verteren van de resterende glasvocht en zorgt voor gemakkelijker toegang tot de ganglion cel laag. Tip: voor de netvliezen van jongere dieren met minder glasachtig of als negatieve effecten worden waargenomen, tijd kan worden ingekort tot ~ 5 minuten.
- Verwijderen netvlies van enzym-bevattend medium en was uitgebreid in het extracellulaire oplossing
- Breng de retina in het opnemen van kamer 6 met de fotoreceptor laag naar beneden. Wick weg resterende vloeistof met ofwel een pipet of weefsel en roll-out zijkanten van het netvlies om weefsel voorzichtig om alleen de randen van het netvlies, met name het vermijden van contact met het ganglion cellaag raken plat. Plaats een platina ring met nylon mesh op het netvlies aan het weefsel verankeren en meteen de kamer te vullen met extracellulaire oplossing.
- Monteer de opname kamer op de microscoop podium, hechten buis voor de zwaartekracht perfusie en vacuüm zuig-en bevestigen aarddraad.
4) Lokalisatie van EGFP uitdrukken ganglioncellen en licht stimulatie
- Perfuseren het netvlies door de zwaartekracht met de extracellulaire oplossing 1 ml / min of sneller tarieven. Tip: Als perfusie te laag is, het weefsel zal niet voldoende zuurstof en synaptische signalen kunnen worden verstoord.
- Vul een opname pipet met intracellulaire oplossing en plaats deze in de pipet houder. Tip: Pipetten met weerstanden in het bereik van 3 tot 5MΩ geven de beste resultaten.
- Visualiseer het netvlies onder infrarood differentieel interferentie contrast (DIC) optiek bij een lage vergroting (10x objectief, NA 0,3) te lokaliseren de opname pipet. Infrarood licht wordt gebruikt om het netvlies blootstelling aan zichtbaar licht te minimaliseren en lichte aanpassing te minimaliseren. Ga naar hogere vergroting (40X objectief, NA 0,8) en breng elektrode in het zicht net boven weefsel.
- Bij hoge vergroting (40x objectief), verlichten het netvlies met epifluorescentie (480 nm voor EGFP) en selecteer een fluorescerende ganglion cel en teken op de computer monitor met behulp van tape (Figuur 1A).
- Onder DIC en infrarood verlichting, de positie van de registratie-elektrode in de buurt van de beoogde ganglion cel (Figuur 1A). Schone gebied onmiddellijk voor cel door het toepassen van lichte positieve druk om de opname te elektrode via een 12 cc plastic spuit is aangesloten op de pipet houder met polyethyleen buizen. Op de versterker, nul eventuele spanning offsets. Plaats elektroden op geselecteerde ganglion cel totdat er een kuiltje verschijnt op het celoppervlak.
- Met de versterker in spanning klem-modus, een proefvlak puls en toezicht op de stroom die door de pipet. Van toepassing zijn negatieve druk op afdichting tussen elektrode en cellen te creëren. Laat negatieve druk als de cel begint te verzegelen en te wachten tot de holding stroom is indicatief voor een GΩ elektrische afdichting tussen membraan van de cel en de pipet. Zachtjes pulsen van negatieve druk tot capacitieve transiënten verschijnen en laat vervolgens de eventuele toepassing van druk. Tip: als de toegang (serie) weerstand is hoog (> 30MΩ), dit kan vaak worden verbeterd door extra, zeer zachte, pulsen van negatieve druk.
- Zodra een stabiele afdichting is bereikt van toepassing een puls van negatieve druk. Na de hele cel modus is verkregen, laat cel tot donker aan te passen voor 5 minuten. Record, in de huidige klem mode, naar aanleiding van full-field, wit licht stimulatie (Figuur 1B).
- Na de opname, zal Alexafluor-594 heeft verspreid naar de dendrieten. De tracer kan worden gevisualiseerd in epifluorescentie bij 594 nm en wordt gebruikt om te bepalen of een ganglion cel is On-, Uit-of Bi-gestratificeerd door te schakelen tussen epifluorescentie en DIC infrarood optiek 5.
- Als neurobiotin is opgenomen in pipet en het netvlies zal worden verwerkt voor immunohistochemie, dan pipet moet voorzichtig worden teruggetrokken tot minimale verstoring van het membraan te bieden.
5) Analyse van de anatomie van de geregistreerde ganglioncellen
Vullen met neurobiotin zorgt voor meer gedetailleerde morfologische analyse van de ganglioncellen volgende opname. Tip: Indien specifieke correlaties tussen een opgenomen ganglion cel en gedetailleerde morfologie gewenst is, kan het best op te nemen en vul slechts een RGC per voorbereiding.
- Als neurobiotin werd opgenomen in de intracellulaire oplossing dan plaats in het netvlies paraformaldehyde oplossing en vast overnacht bij 4 ° C.
- Spoel in PBS, minimaal 2 uur, ten minste zes veranderingen. Overdracht van het netvlies op een bord met het blokkeren van oplossing. Laat in het blokkeren van oplossing voor 2 uur, kamertemperatuur op shaker.
- Vervang de blokkering oplossing met de Streptavidine oplossing. Incubeer 2 dagen bij 4 ° C op shaker. Spoel het netvlies in PBS, 6 spoelt, 20 min elk.
- Monteer het netvlies met Vectashield in een glasplaatje.Het netvlies moet worden geplaatst met het ganglion cellen omhoog. Voer confocale microscopie (figuur 1C).
Representatieve resultaten
Als het netvlies is gezond en de dissectie succesvol was, moet de individuele ganglioncellen zichtbaar zijn onder DIC hoge vergroting (Figuur 1A). Ongezonde netvliezen zal hebben grote, gegranuleerd kernen en moeten worden weggegooid. Als de synaptische reactie van een bepaald ganglion cel intact is, dan moet in de cel reageren op licht het ontstaan van of te compenseren met actie potentialen en, in het geval van een intrinsiek-lichtgevoelige ganglion cel (Figuur 1B), een aanhoudende depolarisatie.
Figuur 1. Lokalisatie, opnemen en kleuring van een fluorescent gelabelde retinale ganglion cel. (A) GFP positieve RGC zichtbaar onder epifluorescerende verlichting bij 40x vergroting (linker paneel) en onder DIC verlichting (rechter paneel). (B) Synaptic het licht reactie van een M2 intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglion cel opgenomen in whole-cell stroomtang modus van fluorescent gelabelde RGC. (C) M1 intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglion cel was die in het kader epifluorescentie, gericht op whole-cell-opname, gevuld met neurobiotin, en vervolgens verwerkt voor immunohistochemie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze techniek is toepasbaar op elk retinale ganglion cel opnamen uit een geïsoleerde netvlies. Hoewel in de muis lijn hierboven gebruikte intrinsiek lichtgevoelige, melanopsine expressie RGC zijn gelabeld met EGFP 2, 5, dit protocol is gemakkelijk overdraagbaar naar andere fluorescent gelabelde RGC lijnen of kan worden gegeneraliseerd naar opnemen van willekeurig geselecteerde RGC ook. Deze techniek is bijzonder waardevol omdat de dendritische prieel van elk RGC en haar respectieve inbreng neuronen worden gelaten volledig intact. Opnamen kunnen direct worden uitgevoerd in stroom of spanning klem modi, cel-aangesloten of losse-patch configuratie, of kan zelfs gebruikt worden voor kern patch worden, binnen-of buiten-out patch configuraties van retinale ganglion cel membranen. Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast om op te nemen van de fluorescent gelabelde ontheemden amacrine cellen 7 of zelfs niet-verplaatste amacrine cellen 8 Een beperking van het gebruik van fluorescentie te lokaliseren ganglion cellen is dat het netvlies altijd moet worden blootgesteld aan voordat het licht voor de RGC identificatie om de opname te . Zo kan dit preparaat niet geschikt voor het opnemen van rod-gemedieerde respons, tenzij exogene chromofoor is opgenomen in het bad oplossing en / of de oogschelp en retinale pigment epitheel worden overgelaten aan het netvlies 9. Als het doel is om op te nemen staaf-gemedieerde licht de reacties, dan speciale voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om te voorkomen dat bleken van de photopigment rhodopsine. Dissection moeten worden uitgevoerd onder infrarood licht (dat wil zeggen 10).
Voor het uitvoeren van een succesvolle dissectie, is het belangrijk dat de dissectie zo snel uitgevoerd worden als mogelijk. Het is vooral belangrijk dat het glasvocht wordt verwijderd met de tang. Als het glasvocht is overgebleven, dan na enzymdigestie het netvlies zal worden bedekt met een kleverige film maken van een succesvolle patching moeilijk. Voor het verkrijgen van goede opnamen is het bijzonder belangrijk dat het netvlies is goed zuurstof, wat betekent dat de extracellulaire oplossing wordt krachtig te laten borrelen en het debiet voldoende hoog is door de kamer. Het is ook belangrijk om blootstelling aan licht van het weefsel te minimaliseren zodra het netvlies is geïsoleerd van de oogschelp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Wij danken Darwin Hang voor zijn technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ames’ Medium | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | |
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | |
| Electrodes | Sutter Instrument Co. | BF120-69-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
References
- Wassle, H.
- Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
- Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
- Siegert, S. Genetic address book for retinal cell types. Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29, 476-482 (2009).
- Newman, E. A., Bartosch, R. An eyecup preparation for the rat and mouse. J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neuroscience. 160, 126-139 (2009).
- Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision. J Neurosci. 27, 692-699 (2007).
- Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination. J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).
- Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina. Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).
