Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

Summary

Cet article fournit une description de la manière de disséquer et d'enregistrer à partir de la préparation isolée de la rétine chez la souris. En particulier, nous décrivons comment enregistrer les réponses de lumière provenant d'une population de cellules ganglionnaires marqués par fluorescence et par la suite identifier et d'analyser sa morphologie.

Abstract

Les premières étapes de la vision des vertébrés ont lieu lorsque la lumière stimule les photorécepteurs tige et le cône de la rétine ^1. Cette information est ensuite séparé en ce qui sont connus comme les voies ON et OFF. Les informations sur le signal des photorécepteurs de lumière pour les cellules bipolaires (BCS), qui dépolariser en réponse à des augmentations (Sur CB) ou diminue (Off BC) de l'intensité lumineuse. Cette ségrégation de l'information lumineuse est maintenue au niveau des cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), qui ont des dendrites stratifier soit dans le sublamina Off de la couche interne plexiforme (IPL), où ils reçoivent l'entrée directe excitateurs de Off BCS, ou de la stratification dans les Sur l'sublamina de l'IPL, où ils reçoivent l'entrée directe à partir excitateurs Le BCS. Cette ségrégation des informations concernant les augmentations ou diminutions d'éclairement (On et Off voies) est conservée et signalés au cerveau en parallèle.

Le CGR sont les cellules de sortie de la rétine, et sont donc une cellule important d'étudier afin de comprendre comment l'information est signalée à la lumière des noyaux visuelle dans le cerveau. Les progrès de la génétique de la souris sur les dernières décennies ont abouti à une variété de lignées de souris fluorescentes journaliste, où des populations spécifiques CJR sont étiquetés avec une protéine fluorescente pour permettre l'identification des sous-types du CJR ^{2 3 4} et spécifiques de ciblage pour l'enregistrement électrophysiologique. Ici, nous présentons une méthode pour l'enregistrement des réponses de lumière à partir des cellules ganglionnaires marqués par fluorescence dans une intacte, la préparation rétine isolée. Cette préparation permet de rétine isolée à partir d'enregistrements CGR où la tonnelle dendritiques est intact et les entrées dans la tonnelle dendritiques CJR ensemble sont préservés. Cette méthode est applicable à travers une variété de sous-types de cellules ganglionnaires et se prête à une grande variété d'organismes unicellulaires techniques physiologiques.

Protocol

Déclaration utilisation des animaux: Les animaux ont été soignés conformément aux directives décrites dans le Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire, en utilisant des protocoles approuvés par l'Université du Minnesota de soins des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation.

1) Préparation des solutions

1. Avant d'effectuer l'enregistrement électrophysiologique, des solutions intracellulaire, extracellulaire, et l'enzyme besoin d'être préparés.
2. Solution extracellulaire: mélanger une bouteille (8,8 g) de milieu de poudre d'Ames (Sigma) avec 1 l de H ₂ O et 1,9 g de bicarbonate de sodium (23 mM). À tous les points de la solution extracellulaire est saturé avec 95% O ₂ / 5% mélange de gaz CO _2. Transfert de 200 mL dans un bécher de stockage rétine. Placer la solution restant dans le récipient système de perfusion pour la perfusion par gravité une fois de la rétine est monté.
3. Solution intracellulaire: solution intracellulaire doit avoir été faite précédemment, puis répartie dans 500-1000 aliquotes et conservés à -20 ° C. Solution intracellulaire varie en fonction de l'expérience nécessaire, pour les enregistrements de pince de courant montré ici que nous utilisons (en mM): 125 K-gluconate, 2 CaCl _2, MgCl 2 _2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na _2-ATP, 0,5 mM NaGTP le pH à 7,2 avec KOH ^5. Un traceur fluorescent tel que 10 uM AlexaFluor-594 hydrazide (Invitrogen) peuvent être ajoutées pour visualiser dendrites pendant l'expérience, et neurobiotin (0,3%) peuvent également être inclus dans l'analyse de l'anatomie cellulaire après l'enregistrement. Lorsque vous êtes prêt à enregistrer, le dégel solution intracellulaire.
4. Solution enzymatique: Combiner 10000 unités collagénase (substances chimiques Worthington) avec 83 mg de hyaluronidase (substances chimiques Worthington) dans 4.150 ml de solution extracellulaire. Boutique en 50 aliquotes à -20 ° C. Aliquotes peuvent être utilisées pendant plusieurs semaines. Lorsque vous êtes prêt à traiter la rétine, diluer aliquote dans 500 uL de solution extracellulaire barbotage.
5. Solution tamponnée au phosphate (PBS): dans 800 ml de H ₂ O ajouter 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,4 g de Na ₂ HPO ₄ et 0,24 g de KH ₂ PO _4. Amener le pH à 7,4 avec NaOH. Réglez le volume à 1 L.
6. Tampon phosphate 0,2 M: Dans 800 ml de H ₂ O ajouter 21,8 g de Na ₂ HPO ₄ et 6,4 g de NaH ₂ PO _4. Amener le volume à 1 L.
7. Solution de paraformaldéhyde à 4%: Chauffer 50 ml H ₂ O à 60 ° C. Ajouter paraformaldéhyde 4g, remuez pendant quelques minutes. Ajouter quelques gouttes de NaOH 1M (environ 5 gouttes), continuer à remuer jusqu'à ce qu'une solution soit claire. Ajouter 50 ml tampon phosphate 0,2 M dans un bécher. Vérifiez le pH en utilisant des bandes de pH (~ 7,4). Filtrer et refroidir.
8. Solution de blocage (sérum de chèvre 10%, 0,5% TritonX100): dans 1,8 ml de PBS, ajoutez 0,2 ml de sérum de chèvre et 10 uL de Triton X-100. TritonX-100 sert à permeabilise le tissu.
9. Streptavidine solution (sérum de chèvre 5%, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidine 594): Dans 1,9 ml de PBS ajouter 0,1 ml de sérum de chèvre, 10 uL Triton X-100 et 4 pi de streptavidine 594.

2) Isolement de la rétine de souris

Des outils de dissection nécessaire: 1 # 2 pinces, 2 # 5 pinces, ciseaux ophtalmologique

1. Euthanasier la souris selon des protocoles approuvés, dans ce cas d'asphyxie CO ₂ et du globe oculaire énucléer en insérant doucement une pince à angle # 2 derrière l'œil et soulevant le globe oculaire.
2. Placez le globe oculaire dans un plat de Pétri de 35 mm avec une solution extracellulaire. Couper le nerf optique et tout muscles extraoculaires attachés ou du tissu conjonctif avec des ciseaux ophtalmologique. Coupez la cornée avec un ciseau ophtalmologiques et tirez la lentille en utilisant une pince # 5. Déchirez la sclère avec une paire de pince n ° 5 et l'utilisation de la pince pour couper le nerf optique, où la rétine et la sclère rencontrer au disque optique. Décoller doucement la rétine loin de l'œilleton. Astuce: Ne chaque étape sur les deux rétines avant de passer à l'étape suivante afin de minimiser le temps.
3. Utilisez une pince pour enlever vitreuse attaché à la rétine. Ceci peut être réalisé par "attraper" le vitré transparent au-dessus de la rétine avec une pince. Le vitré, si supprimé avec succès, devrait être visible comme une substance transparente et gélatineuse sur la pince. Astuce: Trancheuse rétines de moitié après l'enlèvement du corps vitré permettra de maximiser la quantité de tissu utilisable et faire monter dans la chambre de plus facile.
4. Gardez les rétines en solution extracellulaire oxygénée à la température ambiante dans un environnement sombre avec la lumière ambiante minimale jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être digéré. Rétines peuvent être stockées de cette façon pour ~ 6 heures.

3) Le traitement de la rétine avec le mélange d'enzymes et de montage dans la chambre d'enregistrement

1. Diluer une aliquote de la collagénase / hyaluronidase dans 500 uL solution extracellulaire, la solution de placer dans un plat de Pétri de 35 mm et le transfert de la rétine.
2. Gardez-la rétine contientING boîte de Petri, couverts et dans les ténèbres, dans une O2 95% / 5% CO ₂ l'environnement pendant 15 min avec agitation douce. Cette étape aides dans la digestion des corps vitré restant et permet de faciliter l'accès à la couche des cellules ganglionnaires. Astuce: pour rétines des animaux plus jeunes avec moins vitreux ou si des effets indésirables observés sont, le temps peut être réduit à environ 5 minutes.
3. Retirez la rétine à partir d'enzymes contenant du milieu et laver abondamment dans la solution extracellulaire
4. Transfert de la rétine dans l'enregistrement de chambre ⁶ avec la couche des photorécepteurs vers le bas. Évacuer liquide restant avec soit une pipette ou de tissus et de déployer les côtés de la rétine pour aplatir le tissu en faisant attention de ne toucher que les bords de la rétine, en particulier en évitant le contact avec la couche de cellules ganglionnaires. Placer un anneau de platine avec plus de filet de nylon rétine pour ancrer les tissus et immédiatement remplir la chambre avec une solution extracellulaire.
5. Montez la chambre de l'enregistrement sur la platine du microscope, fixez le tube de perfusion par gravité et aspiration sous vide et fixez le fil de terre.

4) la localisation des cellules ganglionnaires EGFP exprimer et la stimulation lumineuse

1. Perfuser la rétine par gravité avec une solution à des taux extracellulaires mL / min ou plus rapide 1. Astuce: Si le taux de perfusion est trop lent, le tissu ne sera pas suffisamment oxygéné et de signalisation synaptique peut être perturbé.
2. Remplir une pipette d'enregistrement avec une solution intracellulaire et l'insérer dans le porte-pipette. Astuce: Pipettes avec des résistances de l'ordre de 3 à 5MΩ donnent les meilleurs résultats.
3. Visualisez la rétine dans l'infrarouge contraste d'interférence différentiel (DIC) optique à faible grossissement (objectif 10X, NA 0,3) pour localiser la pipette d'enregistrement. La lumière infrarouge est utilisée pour minimiser l'exposition rétine à la lumière visible et de minimiser adaptation à la lumière. Déplacer vers un plus fort grossissement (objectif 40X, NA 0,8) et amener l'électrode dans la vue juste au-dessus du tissu.
4. A fort grossissement (objectif 40X), illuminent la rétine avec épifluorescence (480 nm pour EGFP) et sélectionnez une cellule ganglionnaire fluorescentes et marque sur écran d'ordinateur à l'aide de bande (figure 1A).
5. Sous l'éclairage DIC et infrarouge, la position de l'électrode d'enregistrement à proximité de la cellule ganglionnaire ciblés (figure 1A). Nettoyer la zone couvrant la cellule immédiatement en appliquant une légère pression positive à l'électrode d'enregistrement via une seringue en plastique 12cc connecté au détenteur de pipette avec des tuyaux en polyéthylène. Sur l'amplificateur, zéro tous les décalages de tension. Placer sur l'électrode de cellules ganglionnaires sélectionné jusqu'à une fossette apparaît sur la surface cellulaire.
6. Avec l'amplificateur en mode voltage imposé, appliquer une impulsion de test et de suivre le courant passant dans la pipette. Appliquer une pression négative pour créer l'étanchéité entre l'électrode et la cellule. Communiqué de pression négative lorsque la cellule commence à sceller et d'attendre la tenue actuelle est révélatrice d'un sceau GQ électrique entre la membrane cellulaire et la pipette. Appliquer des impulsions douces de pression négative jusqu'en transitoires capacitifs apparaissent, puis relâchez toute application d'une pression. Astuce: si l'accès (série) la résistance est élevée (> 30MΩ), ce qui peut souvent être amélioré par d'autres, très doux, des impulsions de pression négative.
7. Une fois un joint stable a été atteint appliquer une impulsion de pression négative. Après le mode cellule entière est obtenue, permettant d'adapter la cellule à l'obscurité pendant 5 minutes. Enregistrement, en mode courant imposé, la réponse à plein champ, la stimulation de lumière blanche (figure 1B).
8. Après l'enregistrement, AlexaFluor-594 aura diffusé aux dendrites. Le traceur peut être visualisé sous épifluorescence à 594 nm et utilisé pour déterminer si une cellule ganglionnaire est en, hors, ou bi-stratifié par commutation entre épifluorescence et DIC optique infrarouge ^5.
9. Si neurobiotin est inclus dans la pipette et de la rétine va être traitée pour l'immunohistochimie, puis la pipette doit être délicatement retiré de fournir un minimum de perturbations de la membrane.

5) L'analyse de l'anatomie des cellules ganglionnaires enregistrées

Remplissage avec neurobiotin permet plus de l'analyse morphologique détaillée des cellules ganglionnaires après l'enregistrement. Astuce: Si les corrélations spécifiques entre une cellule ganglionnaire enregistrées et la morphologie détaillée est souhaitée, il peut être préférable d'enregistrer et de remplir un seul CJR par préparation.

1. Si neurobiotin a été inclus dans la solution intracellulaire puis placer la rétine dans une solution de paraformaldéhyde et de fixer une nuit à 4 ° C.
2. Rincer avec du PBS, au moins 2 heures, au moins 6 changements. Transfert de la rétine à une plaque contenant une solution de blocage. Laissez-les dans une solution de blocage pendant 2 heures, la température ambiante sur agitateur.
3. Remplacer la solution de blocage avec la solution de streptavidine. Incuber 2 jours à 4 ° C sur agitateur. Rincer la rétine dans le PBS, 6 rinçages, 20 min chacun.
4. Montez la rétine avec Vectashield dans une lame de verre.La rétine doit être placé avec les cellules ganglionnaires place. Effectuer la microscopie confocale (figure 1C).

Les résultats représentatifs

Si la rétine est saine et la dissection a été un succès, les cellules ganglionnaires individuelles devraient être visibles sous DIC à fort grossissement (figure 1A). Rétines malsain aura gros noyaux granulé et devraient être jetés. Si la réponse synaptique des cellules ganglionnaires une donnée est intacte, alors la cellule doit répondre à l'apparition de lumière ou de compenser avec des potentiels d'action et, dans le cas d'une cellule ganglionnaire intrinsèquement photosensibles (figure 1B), une dépolarisation soutenue.

Figure 1. Localisation, d'enregistrement et de la coloration d'une cellule ganglionnaires de la rétine marqué par fluorescence (A). GFP CJR positifs visualisés sous un éclairage à un grossissement de 40X à épifluorescence (à gauche) et sous un éclairage DIC (à droite). (B) réponse à la lumière d'une cellule de Synaptic M2 ganglionnaires intrinsèquement photosensibles rétine enregistrée dans la cellule entière mode courant imposé par RGC marquées par fluorescence. (C) M1 cellules ganglionnaires de la rétine intrinsèquement photosensibles qui a été identifié sous épifluorescence, ciblées pour l'ensemble des cellules d'enregistrement, rempli de neurobiotin, puis traitées pour l'immunohistochimie.

Discussion

Cette technique est applicable à tous les enregistrements de cellules ganglionnaires rétiniennes à partir d'une rétine isolée. Bien que, dans la lignée de souris utilisée ci-dessus intrinsèquement photosensibles, exprimant la mélanopsine CGR sont étiquetés avec EGFP ^{2, 5,} ce protocole est facilement transférable à d'autres lignes marquées par fluorescence CJR ou peuvent être généralisés à enregistrer à partir de CGR choisis au hasard ainsi. Cette technique est particulièrement précieux, car la tonnelle dendritiques de chaque RGC et ses neurones d'entrée respectives sont laissés entièrement intacts. Les enregistrements peuvent être facilement réalisées dans les modes de pince de courant ou tension, cellule attachée ou lâche-patch de configuration, ou peut même être utilisé pour le patch nucléées, à l'intérieur ou en dehors des configurations de patch-out de la rétine des membranes des cellules ganglionnaires. Cette technique pourrait être facilement adaptée pour enregistrer à partir marqué par fluorescence déplacées cellules amacrines ⁷ ou même non déplacées cellules amacrines ⁸ Une limitation de l'utilisation de la fluorescence pour localiser les cellules ganglionnaires de la rétine est que doit toujours être exposés à la lumière pour l'identification du CJR avant l'enregistrement . Ainsi, cette préparation peut ne pas être approprié pour l'enregistrement tige réponses à médiation à moins chromophore exogène est inclus dans la solution du bain et / ou l'œilleton et rétiniennes épithélium pigmentaire sont laissés attachés à la rétine ^9. Si l'objectif est d'enregistrer les réponses de lumière tige-médiatisée, des précautions particulières doivent être prises pour éviter le blanchiment de l'rhodopsine photopigment. Dissection doit être effectuée sous des conditions de lumière infrarouge (c'est à dire ^10).

Pour effectuer une dissection de succès, il est important que la dissection être effectuée aussi rapidement que possible. Il est particulièrement important que le vitré est enlevé avec succès avec la pince. Si le vitré est restantes, puis en suivant une digestion enzymatique de la rétine sera recouverte d'une pellicule visqueuse faire patcher succès difficile. Pour obtenir de bons enregistrements, il est particulièrement important que la rétine est bien oxygéné, ce qui signifie que la solution extracellulaire est vigoureusement bouillonné et le débit est suffisamment élevée dans la chambre. Il est également important de minimiser l'exposition des tissus légers fois la rétine est isolée de l'œilleton.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ames’ Medium	Sigma-Aldrich	A1420
Collagenase	Worthington Biochemical	LS005273
Hyaluronidase	Worthington Biochemical	LS002592
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
AlexaFluor 594 Hydrazyde	Invitrogen	A10442
Neurobiotin	Vector Laboratories	SP1120
Electrodes	Sutter Instrument Co.	BF120-69-10
Forceps	Fine Science Tools	11252-30
Ophthalmologic Scissor	Fine Science Tools	15000-00
Streptavidin 594	Invitrogen	S32356
Vectashield	Vector Laboratories	H-1000
Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-001
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210