Summary
بروتوكول للكفاءة
Abstract
أفادت الأنباء أن مرضى سرطان الثدي قد موجودة مسبقا الاستجابات المناعية ضد الأورام 1،2 بهم. ومع ذلك ، فشلت هذه الاستجابات المناعية لتوفير الحماية الكاملة ضد تطوير أو تكرار الاصابة بسرطان الثدي. للتغلب على هذه المشكلة عن طريق زيادة وتيرة ورم الخلايا التائية التفاعل ، واستخدمت العلاج المناعي بالتبني. وقد استخدمت مجموعة متنوعة من البروتوكولات لتوسيع خلايا الورم T - معينة. هذه البروتوكولات ، ومع ذلك ، وتقتصر على استخدام المضادات الورم فيفو السابقين لتنشيط خلايا T مستضد محدد. قريب جدا ، وقد استخدمت المشتركة السيتوكينات سلسلة غاما مثل IL - 21 IL - 2 ، IL - 7 ، IL - 15 ، وحدها أو في تركيبة من أجل تعزيز مكافحة الورم الاستجابات المناعية 3. ومع ذلك ، فإنه ليس واضحا ما سيعمل أفضل صياغة لتوسيع خلايا الورم T التفاعل. هنا نقدم بروتوكولا لتفعيل انتقائية وتوسيع التفاعل ورم الخلايا التائية من نموذج FVBN202 الماوس المعدلة وراثيا من سرطان الثدي HER-2/neu إيجابية للاستخدام في علاج الخلايا T بالتبني من سرطان الثدي. البروتوكول يتضمن تنشيط خلايا T مع bryostatin-1/ionomycin (B / I) و IL - 2 في غياب مستضدات الورم لمدة 16 ساعة. B / I التنشيط يقلد الاشارات بين الخلايا التي تؤدي إلى تنشيط الخلايا T عن طريق زيادة نشاط البروتين كيناز سي والكالسيوم داخل الخلايا ، على التوالي 4. هذا البروتوكول على وجه التحديد ينشط الخلايا T - ورم معين في حين قتل خلايا T لا صلة لها بالموضوع. يتم تربيتها في B / I - تنشيط خلايا T مع IL - 7 و IL - 15 لمدة 24 ساعة وبعد ذلك مع نابض IL - 2. بعد 24 ساعة ، ويتم غسل الخلايا التائية ، تقسيم ، والمثقف مع IL - 7 + IL - 15 ليوم 4 إضافية. يتم تحديد فعالية وخصوصية للورم المضادة للورم في خلايا الجسم الحي السابقين T الموسعة.
Protocol
1. عزل الخلايا اللمفاوية 5
- ورم الغدد الليمفاوية عزل تجفيف أو الطحال من الفئران الحاملة للورم FVBN202 المعدلة وراثيا وإعداد وحيدة الخلية في تعليق الجليد الباردة RPMI1640 تستكمل مع FBS 10 ٪. B / I التنشيط في 50 مل من أنابيب البولي بروبلين النتائج المخروطية في زيادة الغلة الخلايا التائية مقارنة أنابيب البوليسترين. ويتم حقن كيتامين زيلازين الملكية الفكرية للتخدير. يستخدم خلع عنق الرحم كوسيلة من وسائل القتل الرحيم.
- ثقافة الخلايا (10 6 خلية / مل) في المتوسط كاملة تحتوي على 15 ٪ FBS مع bryostatin 1 - 5 (نانومتر) وionomycin (1 ميكرومتر) جنبا إلى جنب مع 80 يو / مل من IL - 2 (Peprotech) لمدة 16 ساعة.
- غسل خلايا ثلاث مرات مع المتوسط الدافئة (37 درجة مئوية) والثقافة في الخلايا 6 10 / مل في المتوسط الكامل مع IL - 7 (10 نانوغرام / مل) و IL - 15 (10 نانوغرام / مل) (Peprotech) لمدة 24 ساعة .
- نبض الخلايا مع IL - 2 (40 يو / مل) لمدة 24 ساعة.
- انقسام الخلايا والثقافة لهم IL - 7 و IL - 15 (10 نانوغرام / مل) لمدة 4 ايام. تغيير متوسطة وانقسام الخلايا إذا لزم الأمر كل أيام 2.
2. توسيع تحديد طية من الخلايا T التي كتبها عدد الخلايا وتحليل التدفق الخلوي 5
- عدد الخلايا التي المجهر الضوئي
- تعد مناسبة التخفيف الخلية (1:100) في الزرقاء التريبان وإضافة ميكرولتر قليلة على عدادة الكريات
- 9 مربعات العد وتحديد مجموع عدد الخلايا بقسمة عدد الخلايا إلى عدد من الغرف مضروبا في عامل التخفيف. إلا أن النتائج الحالية رقم 4 × 10 خلية / مل.
- تحديد نسبة CD8 CD4 + + وخلايا تي في الخلايا عن طريق توسيع التدفق الخلوي
- استكملت كتلة غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة لمستقبلات القطعة Fc بواسطة زراعة الخلايا مع anti-CD16/CD32 الأضداد (Biolegend) لمدة 20 دقيقة على الجليد وغسل الخلايا ثم مرتين مع 2 مل من الجليد الباردة مع PBS أزيد الصوديوم 1 ٪ .
- وصمة عار على زراعة الخلايا مع FITC - CD4 والأضداد PE - CD8 لمدة 20 دقيقة على الجليد وغسل الخلايا ثم مرتين مع 2 مل من الجليد الباردة PBS تستكمل مع FBS 1 ٪ و 0.1 ٪ أزيد الصوديوم.
- تحديد الخلايا مع بارافورمالدهيد 1 ٪ وتشغيل عينات على بيكمان كولتر FC 500 و تحليل استخدام الإصدار 4.3 برنامج القمة.
3. الموسع تحديد الورم خصوصية فيفو السابقين الخلايا T
- ثقافة توسيع فيفو السابقين الخلايا الليمفاوية في المتوسط الكامل في نسبة 10:01 العصبية الإيجابية مع الخلايا السرطانية المشع MMC (15000 RAD) لمدة 24 ساعة 5
- supernatants الحصاد وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى المستخدمة. 5،6
- كشف الإنترفيرون γ باستخدام الماوس الإنترفيرون γ ELISA تعيين دينار بحريني (Pharmingen) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. 5،6
4. تحديد المضادة للورم وظيفة خلايا تي فيفو السابقين الموسع 5،6
- احتضان خلايا T مع الخلايا السرطانية في 10:01 المستجيب : النسب المستهدفة لمدة 48 ساعة في المتوسط الكامل في المتوسط 3 مل كاملة (RPMI - 1640 تستكمل مع 100U / مل من البنسلين ، 100μg / الستربتوميسين مل ، 10 ٪ FBS ، والجلوتامين β -- المركابتويثانول) و20U / مل من IL - 2 (Peprotech) في 6 اطباق الثقافة جيدا 37 ° C CO / 5 ٪ 2.
- أداء ثلاث الضد اللون لتلوين العصبونات (anti-c-Erb2/c-neu ، استنساخ - 4 ، Calbiochem) ، يليه مفتش الماوس PE المضادة ، Annexin V - FITC والتأيد Propidium (PI) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة دينار بحريني (Pharmingen)
- على الخلايا العصبية بوابة ورم إيجابي وتحليل جدوى (Annexin V-/PI-) من الخلايا السرطانية
5. الفأر نموذج من سرطان الثدي
ويمكن استخدام إناث الفئران المعدلة وراثيا FVBN202 (مختبرات نهر تشارلز) عن مصدر الخلايا التائية الورم التفاعل. هذه الفئران overexpress an unactivated الفئران العصبية التحوير في إطار تنظيم MMTV المروج ، ونتيجة لسرطان الثدي تطوير عفوية بين 4-10 شهرا من العمر 7. تطوير هذه الفئران قبل تحولها الى تضخم الثدي مماثلة لسرطان الأقنية في الموقع (DCIS) قبل وضع carcinoma8 عفوية. وتستخدم عفوية الفئران الحاملة للورم والجهات المانحة من خلايا تي.
6. ممثل النتائج :
تنشيط خلايا T مع B / I عن النتائج 16 ساعة في قتل الخلايا التائية السذاجة التي لا يتم توعيتهم مع الورم في الجسم الحي. بعد الانتقائية B / الأول من الخلايا التائية الورم التفاعل أنهم توسيع تصل إلى 2.8 أضعاف في غضون 6 ايام الثقافة مع السيتوكينات سلسلة غاما (الشكل 1). كلا CD8 + و + CD4 يتم توسيع الخلايا التائية بالتساوي مع السيتوكينات سلسلة غاما (الشكل 2). فيفو السابقين الخلايا T - الموسعة تظهر استجابة عالية ضد الأورام التي كانت الفئران المانحة توعيتهم ، وتقييمها من قبل لإنتاج الإنترفيرون γ في وجود سرطان الثدي إيجابي العصبية الماوس (MMC) خلايا الورم (الشكل 3). يمكن توسيع فيفو السابقين الخلايا التائية تحفز الخلايا العصبية الإيجابية في سل الورم MMCليرة سورية بحيث بقاء الخلايا السرطانية تنخفض من 92 ٪ إلى 61 ٪ في غضون 48 ساعة (الشكل 4).
الشكل 1. توسيع الغطاء من الخلايا الليمفاوية في نقاط زمنية مختلفة التالية B / I التنشيط (يوم 1) ، وبحكم التوسع المجراة مع السيتوكينات سلسلة غاما (أيام 3 و 5 و 7)
الشكل 2. نسبة مجموع CD4 + و CD8 + الخلايا التائية قبل وبعد التوسع لمدة 7 أيام مع السيتوكينات سلسلة غاما.
الشكل 3. الورم تحفيز الإنترفيرون γ إنتاج خلايا تي المعزولة من الفئران الحاملة للورم قبل وبعد التوسع لمدة 7 أيام مع السيتوكينات سلسلة غاما ، وذلك باستخدام الإنترفيرون γ ELISA
الشكل 4. ظيفة السامة للخلايا في الجسم الحي السابقين توسيع الخلايا التائية مع السيتوكينات سلسلة غاما ضد سرطان الثدي إيجابي العصبية الماوس (MMC) الخلايا السرطانية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن تحقيق التوسع الانتقائي للورم خلايا تي التفاعل مع وظيفة مضادة للورم المستجيب من البروتوكول المقترح باستخدام B / I التنشيط وبحكم التوسع المجراة مع السيتوكينات سلسلة غاما IL - 2 ، IL - 7 و IL - 15. بينما IL - 2 هو عامل نمو الخلايا التائية التي يمكن أن تدعم التمايز والتوسع في الخلايا التائية مستضد معين ، يمكن أن تمنع IL - 7 موت الخلايا المبرمج للخلايا T ودعم قدرتها على الاستمرار في التوسع. يمكن IL - 15 دعم الخلايا التائية الذاكرة التي هي مهمة لتوليد طويلة الأجل لمكافحة الورم الردود على بالتبني علاج الخلايا T 9-11. ويمكن تغيير النظام ، ومزيج من هذه السيتوكينات تؤثر على تمايز الخلايا التائية الذي وسع بدوره قد يحسن أو الحد من فعاليتها 12 المضادة للورم. والبروتوكول المقترح لا يتطلب تحديد مستضدات الأورام. انتقائية توسع الورم التفاعل النتائج خلايا تي في إنتاج أعداد كبيرة من الخلايا التائية المضادة للورم التي يمكن استخدامها لعلاج الخلايا T بالتبني من مرضى السرطان. لقد أظهرنا في وقت سابق ان فيفو السابقين توسيع الخلايا التائية الحيوانات المحمية ضد سرطان الثدي بعد العلاج بالخلايا بالتبني تي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة CA104757 المنحة R01 (MH Manjili). نحن نعترف بامتنان دعم مركز سرطان سي يو ماسي ومؤسسة الكومنولث للبحوث السرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bryostatin 1 | Sigma-Aldrich | B7431-10ug | |
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | |
| Mouse IL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| Mouse IL-15 | PeproTech Inc | 210-15 | |
| Human IL-2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| β- mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 556547 | |
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | |
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | |
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | |
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | |
| formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | |
| Light microscope | VWR international | V200073 | |
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Biosciences | 555138 | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
