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Bioengineering

Micropatterned सतहों Hyaluronic एसिड कैंसर कोशिकाओं के साथ संबंधों का अध्ययन करने के लिए

doi: 10.3791/2413 Published: December 22, 2010

Summary

एक उपन्यास दृष्टिकोण है कि exogenous hyaluronic एसिड (हेक्टेयर) के साथ कैंसर कोशिका बातचीत के उच्च संकल्प विश्लेषण की अनुमति देता है वर्णित है. नमूनों सतहों carbodiimide रसायन शास्त्र और microcontact मुद्रण के संयोजन के द्वारा गढ़े हैं.

Protocol

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1. Micropatterned स्टाम्प निर्माण के लिए मानक Photolithography

  1. इथेनॉल के साथ एक नए सिलिकॉन वफ़र कुल्ला और हवा की धारा के साथ शुष्क. वफ़र संभाल और पूरी प्रक्रिया के दौरान सतह दोषों को रोकने संदंश का प्रयोग करें.
  2. स्थानांतरण वफ़र coater स्पिन और एसयू +२०२५ नकारात्मक photoresist के साथ वफ़र सतह को कवर. Photoresist के साथ कवर वफ़र के कम से कम 80%. 10 सेकंड के लिए 600rpm में स्पिन कोट, 3000rpm पर 30 सेकंड के द्वारा पीछा किया. Photoresist की photosensitivity के कारण, इस बिंदु से आगे कमरे से रोशनी बारी.
  3. गर्म थाली "नरम सेंकना" के लिए 3 मिनट के लिए 95 ° सी में लेपित सिलिकॉन वफ़र photoresist स्थानांतरण. गर्म थाली से निकालें और 1 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. Photoresist कवर सिलिकॉन वफ़र के शीर्ष पर वांछित पैटर्न के साथ एक पूर्व गढ़े मुखौटा प्लेस और 20 सेकंड के लिए पराबैंगनी (यूवी) विकिरण (350-450 एनएम) को बेनकाब.
  5. स्थानांतरण 110 पर के लिए "हार्ड सेंकना" गर्म थाली ° सी 6 मिनट के लिए सिलिकॉन वफ़र.
  6. रोशनी पर बारी और गर्म थाली से वफ़र हटाने. अलग पैटर्न में इस बिंदु पर दिखाई जानी चाहिए.
  7. SU-8 photoresist डेवलपर के साथ ध्यान से सिलिकॉन वफ़र कुल्ला. डेवलपर समाधान के साथ 3 rinses के बाद, इथेनॉल के साथ कुल्ला. यदि किसी भी सफेद अवशेषों मौजूद है, photoresist डेवलपर समाधान के साथ कुल्ला दोहराने के लिए, या बस डूब डेवलपर समाधान में 2 मिनट के लिए वफ़र और इथेनॉल के साथ फिर से आगे बढ़ना कुल्ला. पानी और शुष्क हवा के साथ धोएं.
  8. मिक्स polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer और एक 10:1 वजन अनुपात में इलाज एजेंट समाधान. 5 मिनट के हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए 900RPM पर अपकेंद्रित्र.
  9. पेट्री डिश प्लेस में वफ़र नमूनों और सिलिकॉन वफ़र पर PDMS डालना. यदि वहाँ वर्तमान बुलबुले, desicator में जगह एक कुछ मिनट के लिए और वैक्यूम कर रहे हैं जब तक बुलबुले गायब हो जाते हैं.
  10. कमरे के तापमान (आर टी) में रात भर इलाज के लिए एक पूरक elastomeric टिकट के रूप में. यदि PDMS पूरी तरह से ओवन में 12 घंटे, जगह के बाद ठीक नहीं है 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए.
  11. ध्यान से सिलिकॉन वफ़र से PDMS हटायें. धार का प्रयोग इच्छित आकार करने के लिए स्टांप कटौती. इथेनॉल में 15 मिनट के लिए Sonicate. वेफर्स कई बार उपयोग किया जा सकता है के लिए नए elastomeric टिकटों बनाने.

2. हा micropatterning

  1. प्लाज्मा साफ कांच 5 मिनट के लिए स्लाइड. कक्ष और 5 मिनट के लिए निर्वात में सभी स्लाइड्स रखें. तो ऑक्सीजन की कम प्रवाह की अनुमति देने के कक्ष में प्रवेश करने के लिए. 5 मिनट के लिए मुड़ें प्लाज्मा क्लीनर. प्लाज्मा और संदंश का उपयोग कर एक पेट्री डिश में क्लीनर जगह से निकालें.
  2. प्लाज्मा सफाई के दौरान, इथेनॉल में 15 मिनट के लिए PDMS टिकटों sonicate.
  3. 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 95% v / v इथेनॉल में एक ताजा 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) के 3% v / v समाधान तैयार करें. आरटी पर 5 मिनट के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए एक silanol फार्म की अनुमति दें.
  4. प्लेस स्पिन coater चक पर PDMS पैटर्न स्टांप और कवर APTMS समाधान के साथ सतह नमूनों है. 3500rpm पर 30 सेकंड के लिए Spincoat. स्टांप सतह को छूने, केवल PDMS स्टाम्प के पक्ष मत करो.
  5. स्थानांतरण APTMS प्लाज्मा के समाधान के कांच साफ सतहों: सेट स्टांप नमूनों पक्ष के एक छोर पर नीचे का सामना करना पड़ रहा है और धीरे PDMS दबाने फिसलना तो यह पूरी तरह से 1 मिनट के लिए कांच की सतह के साथ संपर्क में है.
  6. PDMS धीरे स्टांप निकालें, और आरटी नमूनों गिलास स्लाइड में 30 मिनट के लिए सेते अनुमति देते हैं. इथेनॉल और शुष्क हवा के साथ नमूनों सतहों कुल्ला. Sonicate PDMS 15 मिनट के लिए अतिरिक्त APTMS हटाने के लिए स्टाम्प.
  7. ओवन में या गर्म थाली पर 115 से कम 1 घंटे के लिए हीट सतहों डिग्री सेल्सियस इथेनॉल के साथ कुल्ला और सूखी हवा के साथ.
  8. [Methoxy (polyethyleneoxy) propyl] टोल्यूनि में trimethoxysilane - ताजा polyethylene (खूंटी) glycol silane 20% v / v 2 के समाधान तैयार है. यह एक गैर चिपकने वाला पैटर्न आसपास के क्षेत्र के रूप में काम करेगा.
  9. एक गिलास पेट्री डिश और 75 में 45 मिनट के लिए सेते खूंटी silane समाधान में स्थानांतरण नमूनों गिलास स्लाइड ° C एक गर्म थाली पर. टोल्यूनि, पानी, और हवा के साथ सूखा के साथ कुल्ला.
  10. 1 एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में यूवी germicidal विकिरण का उपयोग घंटे के लिए जीवाणुरहित. आगे इस बिंदु बाँझपन बनाए रखने से जैविक सुरक्षा कैबिनेट में आगे बढ़ें.
  11. जलीय बाँझ हा समाधान तैयार है.
    1-एथिल-3 (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) के 10mm
    एन hydroxysuccinimide के 5mm
    50μg / एमएल fluorescein लेबल हा
  12. बाँझ परिस्थितियों में नमूनों ग्लास substrates के लिए हा समाधान लागू करें और प्रकाश से रक्षा की. नमूनों substrates के 16-24 घंटे के लिए undisturbed होना चाहिए.
  13. बंद हा समाधान Aspirate के साथ धोने फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस), और पीबीएस में 1% गोजातीय सीरम (BSA) के 1 घंटे के लिए albumin के साथ सतह को कवर. सतह अब सेल संस्कृति के लिए तैयार है.

3. हा Micropatterned सतहों पर सेल संस्कृति

  1. विस्तार एमडीए MB-231 मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं और निर्माता के निर्देशों के अनुसार LS174T कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कोशिकाओं,.
  2. बीज 0.4 और 1x10 के बीच घनत्व के साथ कैंसर की कोशिकाओं के एकल कक्ष निलंबन 2 गिलास सतह क्षेत्र के अनुसार और हा पर कैंसर की कोशिकाओं सतहों immobilized . Humidified इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में 5% सीओ 2 के साथ बनाए रखा वायुमंडल में सेते हैं . सेल आसंजन 24 घंटे के भीतर होते हैं और औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर देखा जा सकता है है चाहिए
  3. सेल संस्कृति सतहों मानक इनक्यूबेटर परिस्थितियों में 5 दिनों के लिए रखा जा सकता है. मीडिया हर दूसरे दिन बदलें. सेल आकारिकी और विकास औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए मनाया जा सकता है. अतिरिक्त सेलुलर assays हा सतह के लिए प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

carbodiimide covalently APTMS नमूनों गिलास स्लाइड के लिए हा स्थिर किया रसायन शास्त्र चित्र 1A में दिखाया गया है. EDC crosslinking शून्य - लंबाई एजेंट है कि हा carboxyl समूहों के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए amine-प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती फार्म है. के रूप में इस मध्यवर्ती hydrolysis के लिए अतिसंवेदनशील है, एन एच एस carbodiimide प्रतिक्रिया दक्षता बढ़ाने के लिए जोड़ा जाता है. के रूप में हा समाधान APTMS micropatterns, हा मध्यवर्ती और ATPMS के प्राथमिक amine के बीच एक स्थिर एमाइड बंधन रूपों के साथ interacts. हा सतह नमूनों का एक उदाहरण एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन और एक ImageJ प्रतिदीप्ति तीव्रता विश्लेषण का उपयोग कर हा के नमूनों स्थिरीकरण दिखाना है दिखाए जाते हैं (चित्रा 1B-सी ) visualized.

हा micropatterned सतहों expgenous हा के साथ कैंसर कोशिका बातचीत के अध्ययन सक्षम हैं. दोनों एमडीए MB-231 मानव स्तन और LS174t मानव बृहदान्त्र कैंसर कोशिका लाइनों preferentially हा micropatterned क्षेत्रों (चित्रा 2) का पालन करें. उच्च संकल्प इमेजिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग का उपयोग हा immobilized सतहों (चित्रा 3) के साथ संवर्धित कोशिकाओं की बातचीत का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 हा micropatterned सतहों (ए) योजनाबद्ध हा कार्यात्मक सतहों के विकास का वर्णन, (बी) fluorescein के प्रतिदीप्ति छवि (हरी) लेबल हा micropatterned सतह. (सी) 3D पिक्सेल वितरण नक्शा ImageJ असतत हा पैटर्न प्रदर्शन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. स्केल बार = 100μm. Elsevier से अनुमति के साथ 9 से संशोधित.

चित्रा 2
चित्रा 2. हा micropatterned सतहों पर कैंसर कोशिका आसंजन. दोनों (एक) बृहदान्त्र और स्तन (बी) कार्सिनोमा preferentially संस्कृति के 24 घंटे के के साथ हा पैच पर पालन. Elsevier से अनुमति के साथ 9 से संशोधित.

चित्रा 3
चित्रा 3. हा के साथ कैंसर सेल बातचीत. (ए) पेट के कैंसर की कोशिकाओं (ए) हा सतहों पर कम बढ़ाई (बाएं) और उच्च आवर्धन (ठीक है, बाईं तरफ के वर्गों के) में सभ्य दिखाया इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों को स्कैन करने और स्तन कैंसर की कोशिकाओं के (बी) हा पर दिखाया सतहों पर सुसंस्कृत कम बढ़ाई (बाएं) और उच्च आवर्धन (ठीक है, बाईं तरफ के वर्गों का).

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Discussion

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हा micropatterning विधि प्रस्तुत exogenous हा के साथ सेल बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है. हा कैंसर 1 प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा जाना जाता है लेकिन वहाँ सीमित कैंसर कोशिकाओं के दो आयामी हा नमूनों सतहों पर बातचीत की जांच अध्ययन किया गया है . बहिर्जात हा micropatterns पर एक नियंत्रणीय अध्ययन कैंसर कोशिका आसंजन, विकास, और प्रवास के उच्च संकल्प के दृश्य की अनुमति देता है और कैंसर के आगे बुनियादी बातों को स्पष्ट कर सकते हैं.

Carbodiimide रसायन शास्त्र और microcontact मुद्रण के संयोजन से, हम अलग हा कैंसर सेल बातचीत का अध्ययन करने के पैटर्न के साथ सतहों विकसित किया है. इस विधि लगातार नमूनों सतहों सेल संस्कृति और सहित विश्लेषण तकनीक के साथ संगत की अनुमति देता है, लेकिन सीमित immunofluorescent धुंधला नहीं है, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, निषेध, प्रवास, आदि

इसके अतिरिक्त, photolithographic तकनीक किसी भी वांछित पैटर्न का आसान microfabrication अनुमति देते हैं, हा के विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए स्थिरीकरण नियंत्रण. उदाहरण के लिए, रैखिक धारियों के साथ PDMS टिकटों fabricating एक रैखिक सरणी में हा स्थिर और नमूनों हा के साथ सेल प्रवास का विश्लेषण करने में उपयोगी हो सकता है.

हालांकि हम मुख्य रूप से हा के साथ स्पष्ट कैंसर सेल बातचीत के लिए इस विधि का उपयोग किया है, इस तकनीक को अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ बातचीत के अध्ययन के लिए लागू होता है. इसके अतिरिक्त, इस विधि हा अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हा हम स्थिर है fluorescently 800 केडीए के एक आणविक भार के साथ लेबल है. हालांकि, 2000 से आकार में पर्वतमाला हा - 25000 दोहरा disaccharide इकाइयों, और सेलुलर प्रतिक्रिया हा आणविक वजन 10-11 पर निर्भर होना प्रदर्शित किया गया है. इस प्रोटोकॉल इसलिए आणविक भार अलग सेल exogenous हा प्रतिक्रिया की जांच की हा स्थिर करने के लिए लागू किया जा सकता है.

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Disclosures

वीडियो योजनाबद्ध अनुमति के साथ reproduced आंकड़ा; कॉपीराइट Wiley-VCH वेर्लग GmbH एंड कं KGaA. डिकिन्सन ले, कुसुमा एस, Gerecht एस biomaterials का उपयोग भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव आला पुनर्निर्माण. Macromol. Biosci. 2010, 21 अक्टूबर. [प्रिंट से आगे ePub].

Acknowledgments

लेखक जॉन्स हॉपकिन्स, सामग्री अनुसंधान विज्ञान और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन के माध्यम से इंजीनियरिंग सेंटर के हिस्से के रूप में वित्त पोषित सतह विश्लेषण प्रयोगशाला का उपयोग स्वीकार करते हैं. एलईडी एक IGERT प्रशिक्षु और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रेजुएट बंदे है. इस शोध आंशिक रूप से NIH अनुदान U54CA143868 द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SU-2025 photoresist MicroChem Corp. Y111069
SU-8 developer MicroChem Corp. Y020100
Sylgard 184 Dow Corning
3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) Sigma-Aldrich 281778
2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) Gelest Inc. SIM6492.7
1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide Thermo Fisher Scientific, Inc. 22980
N-hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Fisher Scientific, Inc. 24500
Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) Sigma-Aldrich F1177 Reconstitute with 10ml of DI water
MDA-MB-231 breast carcinoma cells ATCC HTB-26
LS174t colon carcinoma cells ATCC Cl-188

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References

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Micropatterned सतहों Hyaluronic एसिड कैंसर कोशिकाओं के साथ संबंधों का अध्ययन करने के लिए
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Dickinson, L. E., Gerecht, S. Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells. J. Vis. Exp. (46), e2413, doi:10.3791/2413 (2010).More

Dickinson, L. E., Gerecht, S. Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells. J. Vis. Exp. (46), e2413, doi:10.3791/2413 (2010).

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