Summary
Uma nova abordagem que permite a resolução de alta análise das interações de células de câncer com ácido hialurônico exógeno (HA) é descrita. Superfícies padronizadas são fabricados através da combinação química carbodiimida e impressão microcontact.
Abstract
Invasão e progressão do câncer envolve um fenótipo de células móveis, que está sob regulamentação complexa por fatores de crescimento / citocinas e da matriz extracelular (ECM) componentes dentro do microambiente do tumor. Ácido hialurônico (AH) é um componente ECM estroma que é conhecido para facilitar a progressão do tumor pela invasão melhoria, crescimento e angiogênese 1. Interação da HA com o seu celular CD44 receptor de superfície induz sinalização eventos que promovem o crescimento de células tumorais, sobrevivência e migração, aumentando assim a propagação metastática 2-3. HA é um glicosaminoglicano, aniônicos nonsulfated composto por unidades repetitivas de ácido D-glucurônico e DN-acetilglucosamina. Devido à presença de grupos carboxila e hidroxila em unidades de dissacarídeo repetindo, HA nativa é em grande parte hidrofílica e passíveis de modificações químicas que introduzem grupos sulfato para imobilização photoreative 4-5. Estudos anteriores envolvendo a imobilização de HA em superfícies utilizam o comportamento bioresistant da HA e seu derivado sulfatado para controlar a adesão celular em superfícies 6-7. Nestes estudos de adesão celular ocorre preferencialmente em regiões não-HA padronizadas.
Para analisar as interacções celulares com HA exógeno, desenvolvemos padrões superfícies funcionalizadas que permitam um estudo controlado e de alta resolução de visualização das interações de células cancerosas com HA. Utilizamos a impressão microcontact (UCP) para definir padrões discretos regiões de HA em superfícies de vidro. A "tethering" abordagem que se aplica a química carbodiimida ligando para imobilizar o AH foi utilizado 8. Superfícies de vidro foram microcontact impressos com uma aminosilane e reagiu com uma solução de HA de rácios otimizada de EDC e NHS para habilitar imobilização HA em matrizes padronizadas. Incorporando a química carbodiimida com MCP permitiu a imobilização de HA para regiões definidas, criando superfícies adequadas para aplicações em vitro. Ambas as células de câncer de cólon e células de câncer de mama implicitamente interagiram com as superfícies HA micropatterned. Adesão célula cancerosa ocorreu dentro de 24 horas com a proliferação por 48 horas. Utilizando superfícies HA micropatterned, demonstramos que a adesão de células cancerosas ocorre através do receptor CD44 HA. Além disso, as superfícies HA padronizadas eram compatíveis com microscopia eletrônica de varredura (MEV) e resolução de imagem permitiu elevado de câncer de saliências adesivas celular e espalhar sobre os padrões de HA para analisar a motilidade de células cancerosas em HA exógeno.
Protocol
1. Fotolitos padrão para micropatterned Fabricação Stamp
- Enxágüe um wafer de silício novo com etanol e seco com fluxo de ar. Use uma pinça para manusear wafer e prevenir defeitos de superfície durante todo o processo.
- Transferência de wafer para girar aplicador e tampa superfície do wafer com SU-2025 fotorresiste negativo. Cobrir pelo menos 80% de wafer com fotorresiste. Casaco giro por 10 segundos a 600rpm, seguido por 30 segundos a 3000rpm. Devido à fotossensibilidade do fotorresiste, desligar luzes da sala a partir deste ponto em diante.
- Transferência de fotorresiste wafer de silício revestido de chapa quente para "soft-assar" a 95 ° C por 3 minutos. Remover da placa quente e permitir que um minuto para esfriar.
- Coloque uma máscara pré-fabricado com o padrão desejado na parte superior do wafer de silício coberta de fotorresiste e expor à radiação ultravioleta (UV) irradiação (350-450 nm) por 20 segundos.
- Transferência de wafer de silício para a chapa quente para "hard-bake" a 110 ° C por 6 minutos.
- Ligue as luzes e remover wafer de chapa quente. Padrões distintos devem ser visíveis neste momento.
- Lavar cuidadosamente wafer de silício com SU-8 desenvolvedor fotorresiste. Após 3 lavagens com solução de desenvolvedor, lavar com etanol. Se algum resíduo branco está presente, repita enxaguar com solução desenvolvedor fotorresiste, ou simplesmente submergir o wafer em solução desenvolvedor por 2 minutos e proceda novamente com o etanol enxaguar. Lavar com água e ar seco.
- Mix PDMS (polidimetilsiloxano) solução de elastômero e agente de cura em uma proporção de peso de 10:1. Centrifugar a 900rpm por 5 minutos para remover bolhas de ar.
- Lugar padronizados wafer em placa de Petri e despeje sobre PDMS wafer de silício. Se houver bolhas presente, lugar em desicator e vácuo por alguns minutos até que as bolhas desaparecem.
- Cura de noite à temperatura ambiente (RT) para formar um selo elastomérico complementares. Se PDMS não está completamente curada depois de 12 horas, coloque no forno a 60 ° C por 30 minutos.
- Remova cuidadosamente PDMS de wafer de silício. Use um fio da navalha para cortar selo para tamanho desejado. Sonicado em etanol por 15 minutos. Wafers pode ser utilizado várias vezes para criar selos elastoméricos novo.
2. Micropatterning HA
- Plasma vidro limpo slides por 5 minutos. Coloque todos os slides na câmara de vácuo e por 5 minutos. Em seguida, permitir baixo fluxo de oxigênio para entrar na câmara. Por sua vez limpa plasma por 5 minutos. Retire do limpador de plasma e coloque em um prato de Petri usando uma pinça.
- Durante a limpeza de plasma, sonicate selos PDMS em etanol por 15 minutos.
- Prepare uma nova solução de 3% v / v de 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) em 95% etanol v / v em um tubo de centrífuga de 15 mL. Deixar reagir por 5 minutos em temperatura ambiente para formar um silanol.
- Coloque selo padrão de PDMS-up na rotação coater chuck e cubra a superfície com solução padronizada APTMS. Spincoat a 3500rpm por 30 segundos. Não toque na superfície de selo, somente os lados do carimbo de PDMS.
- Transferir a solução para o plasma APTMS limpas as superfícies de vidro: conjunto de selo voltado para baixo em uma extremidade do lado estampados e desliza delicadamente pressionando PDMS por isso é completamente em contato com a superfície do vidro por 1 minuto.
- Remover PDMS selo suavemente, e permitir lâmina de vidro decorado para incubar no RT por 30 minutos. Enxaguar superfícies com padrões com etanol e ar seco. Sonicate PDMS selo por 15 minutos para remover o excesso APTMS.
- Superfícies de calor no forno ou na chapa quente por 1 hora a 115 ° C. Lavar com álcool etílico e secar com o ar.
- Prepare polietileno glicol fresco (PEG)-silano solução de 20% v / v 2 - [metoxi (polyethyleneoxy) propil] trimetoxissilano em tolueno. Isto irá servir como uma região não-adesiva em torno de padrões.
- Transferência de lâmina de vidro decorado para um prato de vidro Petri e incubar em PEG-silano solução por 45 minutos a 75 ° C em uma chapa quente. Enxágüe com tolueno, água e seca com o ar.
- Esterilizar por 1 hora utilizando irradiação germicida ultravioleta em uma câmara de segurança biológica. Proceder em cabine de segurança biológica a partir deste ponto para a frente para manter a esterilidade.
- Preparar a solução aquosa estéril HA.
10mM de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)
5mM de N-hydroxysuccinimide
50μg / mL fluoresceína marcado HA - Aplicar a solução para o HA substratos de vidro modelado em condições estéreis, protegidas da luz. Padronizada substratos devem ser perturbado durante 16-24 horas.
- Aspirar off solução HA, lavar com tampão fosfato (PBS), e cobrir a superfície com 1% de albumina bovina sérica (BSA) em PBS por 1 hora. A superfície está pronta para cultura de células.
3. Cultura de células em HA micropatterned Superfícies
- Expandir MDA-MB-231 células de câncer de mama humano e células LS174T carcinoma colorretal, de acordo com as instruções do fabricante.
- Suspensões única semente de células cancerígenas com densidades entre 0,4 e 1x10
- Superfícies de cultura de células pode ser mantida até 5 dias em condições-padrão incubadora. Mudança de mídia todos os dias. Morfologia das células eo crescimento pode ser observado usando microscópio de luz invertida. Ensaios adicionais celular pode ser aplicado para analisar as respostas à superfície HA.
4. Resultados representativos:
A química carbodiimida utilizada para imobilizar covalentemente HA para lâminas de vidro APTMS padronizada é mostrado na Figura 1A. EDC é um agente de reticulação de comprimento zero que reage com grupos carboxila HA para formar aminas reativas intermediários. Como este intermediário é suscetível à hidrólise, NHS é adicionado para aumentar a eficiência da reação carbodiimida. Como solução HA interage com APTMS micropadrões, uma forma amida estável vínculo entre HA intermediários e amina primária de ATPMS. Um exemplo de HA superfície modelada visualizada usando um microscópio de fluorescência e uma análise de intensidade de fluorescência ImageJ demonstrar a imobilização de HA padronizadas são mostradas (Figura 1B-C).
As superfícies HA micropatterned permitir o estudo das interações das células de câncer com HA expgenous. Ambos MDA-MB-231 de mama humano e do cólon humano LS174t linhas celulares de cancro preferencialmente aderem às regiões micropatterned HA (Figura 2). Imagens de alta resolução usando microscopia eletrônica de varredura pode ser usado para analisar as interações das células em cultura com superfícies HA imobilizada (Figura 3).
Figura 1 HA superfícies micropatterned (A) Esquema descrevendo o desenvolvimento de superfícies funcionais HA, (B) imagem da fluorescência da fluoresceína (verde) com etiqueta HA superfície micropatterned. (C) mapa de distribuição de pixels 3D usando software ImageJ demonstrando os padrões HA discreta. Barra de escala = 100μm. Modificado a partir do 9 com permissão da Elsevier.
Figura 2. Adesão celular em superfícies Cancer HA micropatterned. Ambos os dois pontos (A) e mama (B) carcinoma preferencialmente aderiu em manchas HA com 24 horas de cultura. Modificado a partir do 9 com permissão da Elsevier.
Figura 3. Interação das células cancerosas com HA. (A) de digitalização de imagens de microscopia eletrônica de células de câncer de cólon (A) cultivadas em superfícies HA mostrado em baixa ampliação (esquerda) e alta ampliação (à direita; de quadrados à esquerda) e de células de câncer de mama (B) cultivadas em superfícies HA mostrado na baixa ampliação (esquerda) e alta ampliação (à direita; de quadrados à esquerda).
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Discussion
O método apresentado micropatterning HA permite o estudo das interações celulares com HA exógeno. HA é conhecida por desempenhar um papel fundamental na progressão do câncer 1 no entanto tem havido estudos limitados a investigar a interação de células de câncer em duas dimensões superfícies HA padronizadas. Um estudo controlado sobre micropadrões exógenos HA permite a visualização de alta resolução de adesão de células cancerosas, crescimento e migração e pode elucidar ainda mais os fundamentos de câncer.
Ao combinar a química carbodiimida e impressão microcontact, temos desenvolvido superfícies com padrões distintos HA para estudar as interações célula cancerosa. Este método permite que as superfícies de forma consistente padrão compatível com cultura de células e técnicas de análise, incluindo mas não limitado a coloração de imunofluorescência, microscopia eletrônica de varredura, a inibição, a migração, etc
Além disso, técnicas de fotolitografia permitem a microfabricação fácil de qualquer padrão desejado, para controlar a imobilização de HA para aplicações específicas. Por exemplo, a fabricação de selos de PDMS com listras linear seria imobilizar HA em uma matriz linear e pode ser útil na análise da migração de células ao longo padronizada HA.
Embora tenhamos utilizado este método principalmente para elucidar interações célula cancerosa com HA, esta técnica é aplicável para estudar as interações com outros tipos celulares. Além disso, este método pode ser usado para imobilizar uma grande variedade de moléculas de HA. A HA temos imobilizado é fluorescente etiquetado com um peso molecular de 800 kDa. No entanto, intervalos de HA em tamanho 2000-25000 unidades de dissacarídeo repetindo, e resposta celular foi demonstrada ser dependente do peso molecular HA 10-11. Este protocolo pode, portanto, ser aplicada para imobilizar HA de diferentes pesos moleculares para investigar a resposta celular para HA exógeno.
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Disclosures
Figura esquemática de vídeo reproduzido com permissão; Direitos Autorais Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. Reconstruindo o nicho de diferenciação das células-tronco embrionárias usando biomateriais. Macromol. Biosci. 2010; 21 de outubro. [Epub ahead of print].
Acknowledgments
Os autores reconhecem o uso do laboratório de análise de superfície na Universidade Johns Hopkins, financiado, como parte da Pesquisa em Ciências Materiais e Centro de Engenharia através da National Science Foundation. LED é um estagiário e um IGERT National Science Foundation Graduate Fellow. Esta pesquisa foi parcialmente financiado pelo NIH conceder U54CA143868.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-2025 photoresist | MicroChem Corp. | Y111069 | |
| SU-8 developer | MicroChem Corp. | Y020100 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane) | Gelest Inc. | SIM6492.7 | |
| 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 24500 | |
| Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA) | Sigma-Aldrich | F1177 | Reconstitute with 10ml of DI water |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC | HTB-26 | |
| LS174t colon carcinoma cells | ATCC | Cl-188 |
References
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