Summary
Evaluation de la motilité colique dans le côlon distal de porc Guinée avec le moniteur motilité gastro-intestinale (Gimm) est une approche simple et facile à apprendre à évaluer quantitativement la motilité propulsive dans le tractus gastro-intestinal.
Abstract
Le Moniteur motilité gastro-intestinale (Gimm; recherche Catamount et le développement; St. Albans, VT) est un système in vitro qui surveille la motilité propulsive dans des segments isolés du côlon distal Guinée porc. Le système complet se compose d'un ordinateur, une caméra vidéo, bain d'organes lumineux, bain d'eau chauffée péristaltiques et les pompes de circulation, et de logiciels personnalisés Gimm pour enregistrer et analyser les données. Comparativement aux méthodes traditionnelles de surveillance péristaltisme du côlon, le système permet de Gimm continue, l'évaluation quantitative de la motilité. Le côlon distal Guinée cochon est baigné de réchauffé, une solution de Krebs oxygénée, et des pelotes fécales inséré dans l'extrémité orale sont propulsés le long du segment de côlon à un taux d'environ 2 mm / sec. Films de la procédure fécale granules le long du segment sont capturés, ainsi que le logiciel peut être utilisé Gimm suivre la progression de l'fécale granulés. Tarifs de la motilité propulsive peut être obtenue pour le segment entier ou pour une région particulière de l'intérêt. En plus de l'analyse des modes de motilité induite par bolus, des cartes spatio-temporelles peuvent être construits à partir de segments vidéo capturée afin d'évaluer les modèles d'activité spontanée du moteur. Les applications de ce système comprennent l'évaluation pharmacologique des effets des agonistes des récepteurs et antagonistes sur la motilité propulsive, ainsi que l'évaluation des changements qui découlent de conditions physiopathologiques, tels que l'inflammation ou le stress. Le cochon Guinée côlon distal motilité test de propulsion, en utilisant le système Gimm, est simple et facile à apprendre, et il fournit une méthode fiable et reproductible d'évaluation de la motilité propulsive.
Protocol
1. Préparation des tissus du côlon pour Gimm
- Pour préparer un segment de côlon distal pour le Moniteur de motilité gastro-intestinale (Gimm), la première place du colon isolé dans glacée solution de Krebs (121 mM NaCl, 5,9 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 25 mM NaHCO 3 , 1,2 mM NaH 2 PO 4, et 8 mM de glucose; aéré avec 95% d'O 2 / 5% CO 2). Débarrassez mésentère reste de la paroi extérieure et de faire une petite incision dans la fin orale de sorte qu'il peut être distingué lorsqu'il est placé dans le bain d'organe. Note: les tissus peuvent rester dans une solution de Krebs glacée jusqu'à 2 heures avant l'expérimentation.
- Ensuite, la position de l'entrée et la sortie des conduits dans le bain d'organes afin qu'ils soient hors du champ de la caméra pour éviter les interférences avec l'acquisition de l'image. Continuellement perfuser le bain orgue avec préchauffée (37 ° C) oxygénée (95%, 5% CO 2) solution de Krebs, à un débit de 10 ml / min.
- Garder la trace des extrémités orale vs anales, la broche d'un segment de côlon distal (au moins 5 cm) à chaque extrémité dans le bain d'organe, ce qui permet un faible degré de laxisme sorte que le segment peut se déplacer librement jusqu'à 1 cm au milieu . La fin orale doit être positionné vers le chercheur pour la facilité de placer les matières fécales à granulés. Segments du côlon doit être épinglé de la même manière par le même chercheur pour chaque expérience au sein d'un ensemble donné d'expériences parce que la longueur et la tension du segment affecte le taux de la motilité propulsive, avec étirage longitudinal diminue la vitesse du transit (Dickson et al. , 2007).
- Laisser la préparation à s'équilibrer pendant au moins 30 min.
2. Mise en place Gimm et acquisition de données
- Dans le système de Gimm, le segment colique dans la chambre de perfusion est illuminée par en dessous. Une caméra vidéo numérique interfacé avec un ordinateur est positionné au-dessus de la chambre. Assurez-vous que la source d'illumination de lumière et des logiciels Gimm sont allumés.
- Après la mise en place d'une nouvelle expérience dans l'application logicielle Gimm, commencer le premier essai en insérant un revêtement époxy fécale granulés dans l'extrémité orale du segment du côlon pour initier le péristaltisme. Cliquez sur l'interrupteur à bascule appareil sur l'ordinateur pour activer l'appareil photo et cliquez sur le bouton d'enregistrement pour commencer l'enregistrement. Le mouvement de la pastille dans le sens anal est enregistré par la caméra vidéo et les films numériques sont stockées sur un PC pour analyse ultérieure. Lorsque la pastille a atteint la fin du segment de côlon, cliquez sur le bouton d'enregistrement pour arrêter l'enregistrement.
- Pour obtenir une valeur de contrôle pour le taux de propulsion, commencer avec un segment de côlon d'un animal sain et sans appliquer les médicaments. Mener 3-5 essais dans une seule préparation, avec une période de récupération de 5 minutes entre chaque exécution.
- Pour déterminer les effets de certaines conditions ou de la drogue sur la motilité colique, effectuer des essais 3-5 / préparation pour chaque condition expérimentale. En outre, effectuer chaque expérience sur au moins cinq virgules différente d'au moins cinq animaux différents.
- Dans l'analyse des films numériques, le taux de granulés de propulsion fécale est calculé comme le temps qu'il faut pour une pastille de traverser cm X du segment de côlon.
3. Construction de cartes spatio-temporelle
- Les vidéos numériques acquises à partir fonctionne Gimm individuelles peuvent être converties en cartes spatio-temporelle en utilisant le logiciel Gimm personnalisés.
- Sur l'axe horizontal, les changements de diamètre du côlon sont tracées au fil du temps en convertissant l'image du colon dans chaque image vidéo d'une silhouette, et en calculant et en convertissant le diamètre sur toute la longueur en échelle de gris. Le résultat final est que le culot et les zones de détente apparaissent en noir, tandis que les zones de contraction apparaissent en blanc.
- La distance parcourue par la pastille dans le segment du colon est représentée sur l'axe vertical.
4. Représentant cartes spatio-temporelle
- Montré ici sont représentatifs des cartes spatio-temporelle montrant la motilité culot dans les segments du côlon dans diverses conditions expérimentales. Le Y (vertical) représente la position de granulés au fil du temps, tandis que le X (horizontal) axe représente la distance qui le culot progressé à travers le segment du côlon.
- Dans la carte spatio-temporelle d'un colon de contrôle (non traité, normal), le culot va progresser à un taux linéaire de ~ 2 mm / sec. En revanche, l'administration de certains médicaments ou de l'inflammation dans le côlon peut entraîner des motifs motilité perturbée tels que la motilité stoppé et la motilité obstrué.
- Les résultats de Gimm peuvent également être affichés sous forme de graphiques, dans laquelle l'axe des y représente la distance en millimètres parcourue par un culot et le fécale axe x représente le temps en secondes. Par exemple, l'administration de DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly-OL5), uneopiacés μ agoniste des récepteurs, entraîne une diminution de la motilité propulsive dans le côlon.
Discussion
Nerveuses médiée motilité propulsive dans le tractus gastro-intestinal a été décrite pour la première plus d'un siècle par Bayliss et Starling (Bayliss et Starling, 1899). Cette observation a conduit à la désignation des nerfs de l'intestin comme le système nerveux entérique (SNE), une division distincte du système nerveux autonome (Langley, 1921). Neurogène péristaltisme intestinal implique étirer et / ou la stimulation des muqueuses à un moment donné et le réflexe des contractions médiation ci-dessus, ou orales, le niveau de relance et de détente dans le sens aboral. Le résultat est la génération d'un gradient de pression qui propulse le contenu luminal dans un oral à la direction aboral. Dans l'intestin grêle d'une variété d'espèces, et dans l'intestin gros rat, des vagues de contractions péristaltiques peuvent être activées par une perfusion de liquide dans la lumière de certains segments de l'intestin. Dans le côlon distal Guinée porc, naturels ou artificiels pelotes fécales peut être insérée dans l'extrémité orale du côlon et de leurs progrès sur le segment du côlon peuvent être facilement surveillés. Ainsi, le côlon distal de porc Guinée fournit un test simple et utile pour enquêter sur la motilité propulsive dans l'intestin.
Péristaltisme est un réflexe neurale complexe qui implique un certain nombre de composés neuroactifs et les récepteurs. En conséquence, les composés qui affectent la neurotransmission dans l'ENS affecter le taux de la motilité propulsive. La sérotonine, libérée principalement par les cellules entérochromaffines de la muqueuse intestinale, est impliqué dans l'initiation de la péristaltique réflexe. En utilisant le cochon Guinée côlon distal, Grider et ses collègues ont démontré que la motilité propulsive est renforcée par l'administration intralumenal du 5-HT4 agonistes des récepteurs (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Grider et al, 1998), tandis bain de l'application des cinq -HT 3 et 5-HT4 antagonistes des récepteurs diminue le taux de propulsion (Kadowaki et al, 1996;. Linden et al, 2003b.). Par ailleurs, l'inhibition du transporteur de sérotonine aux inhibiteurs sélectifs du recaptage de la sérotonine (ISRS) augmente le péristaltisme à de faibles concentrations, mais diminue le péristaltisme des concentrations plus élevées, probablement en raison de la désensibilisation des récepteurs 5-HT (Kadowaki et al, 1996;.. Wade et al, , 1996). D'autres molécules de signalisation qui contribuent à la Guinée de porc motilité propulsive comprennent l'acétylcholine agit sur les récepteurs nicotiniques, ce qui est le médiateur principal de la signalisation interneuronales dans les intestins. Blocage de la transmission synaptique avec l'antagoniste du récepteur nicotinique hexaméthonium diminue de propulsion granulés à des concentrations élevées, tandis que moins concentrations n'affectent pas le taux de propulsion (Kadowaki et al., 1996). Les opiacés et les agonistes des récepteurs opioïdes, qui ont longtemps été connus pour avoir des effets inhibiteurs sur la motilité gastro-intestinale, une diminution de propulsion culot dans le modèle de porc Guinée motilité propulsive (Foxx-Orenstein et al, 1998;.. Wood et al, 2009). Fait intéressant, daikenchuto, une médecine traditionnelle japonaise à base d'herbes utilisés en clinique pour traiter les vomissements, maux d'estomac, et la motilité désordonnée, diminue le taux de propulsion granulés lorsqu'il est administré avec de la naloxone, un antagoniste des opioïdes, et quand il est administré seul, les résultats du péristaltisme inverse (Wood et al. 2009). Ces résultats illustrent l'utilité du modèle de porc Guinée motilité propulsive pour évaluer les contributions de différents composés et de leurs récepteurs sur les habitudes de la motricité colique.
Un certain nombre d'études ont démontré que l'inflammation entraîne des changements dans les propriétés électriques et synaptiques des neurones du côlon (Linden et al, 2003a;.. Lomax et al, 2005), et que ces changements peuvent persister pendant des semaines après la guérison de l'inflammation (Krauter . et al, 2007; Lomax et al, 2007).. L'impact de la colite induite par les changements neuroplastiques sur la motilité propulsive peuvent être étudiés dans le côlon distal Guinée porc en utilisant le système Gimm. Ce système a plusieurs avantages sur la méthode traditionnelle de contrôle la motilité colique, qui évalue la motilité propulsive simplement en mesurant le temps une boulette fécale parcourt une distance donnée. Des études antérieures de l'inflammation induite par plasticité neuronale dans le côlon ont indiqué qu'il ya une diminution de la vitesse de granulés de propulsion (Linden et al, 2003a;.. Linden et al, 2005), mais des études plus récentes utilisant le système de Gimm ont révélé plus de changements complexes (Strong et al., 2010). Par exemple, le taux de granulés de propulsion est diminué dans les régions ulcérées du côlon distal enflammées, et pourtant la motilité est accéléré dans les régions adjacentes, un phénomène qui n'a pas été reconnu par plus tôt, le «chronomètre» méthode. D'autres études ont montré que les troubles de la motricité pendant la phase active de l'inflammation peut être restauré à l'inhibition de la COX-2 (Linden et al., 2004), et pourtant la motilité altérée qui persiste au-delàla résolution de l'inflammation est la COX-2 insensibles (Krauter et al., 2007). En outre, dans ces études plus tard, des cartes spatio-temporelles générées par le système Gimm révélé une tendance progressive de la motilité colique qui a été observé dans l'après-inflammatoires animaux qui contribue à la diminution des taux de propulsion.
En conclusion, le cochon Guinée côlon distal motilité test de propulsion représente un débit élevé des moyens de mesurer les effets des composés d'essai et les conditions pathologiques sur la motilité colique, en outre, le système Gimm propose une approche simple et directe pour évaluer la motilité propulsive du côlon in vitro. Il permet de mesurer en continu les granulés de propulsion, ainsi que la génération de cartes spatio-temporelle pour étudier les modes d'activité spontanée. Par rapport aux méthodes traditionnelles, il peut également donner phénomène plus complexe qui peut être quantifié et les moyens réanalysé multiples sous forme de fichiers numériques sont enregistrées dans le système et sont facilement accessibles.
Disclosures
La production de cette vidéo a été parrainé par la recherche et le développement Catamount, Inc, qui fabrique l'instrument utilisé dans cet article.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Krebs’ Solution | ||||
| Isoflurane | Anesthesia | Webster Veterinary | ||
| Epoxy-coated fecal pellet | native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated | |||
| Forceps | Fine Science Tools | |||
| Micro Scissors | Fine Science Tools | |||
| Stainless Steel Pins | ||||
| Beakers | 500 mL | |||
| Gas Tank | 95% O2/5% CO2 | |||
| Timer | ||||
| Gastrointestinal Motility Monitor | Catamount Research and Development | http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm |
References
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