Biology

צג תנועתיות מערכת העיכול (GIMM)

Published: December 1, 2010 doi: 10.3791/2435

Jill M. Hoffman¹, Elice M. Brooks¹, Gary M. Mawe¹

¹Department of Anatomy and Neurobiology, The University of Vermont

Summary

הערכת תנועתיות המעי במעי הגס שפן ניסיונות דיסטלי עם צג תנועתיות מערכת העיכול (GIMM) היא גישה ישירה ופשוטה ללמוד להעריך כמותית הנעה תנועתיות במערכת העיכול.

Abstract

צג תנועתיות מערכת העיכול (GIMM; למחקר ופיתוח בקטמאונט ו; סנט אלבנס, VT) הוא במערכת במבחנה המנטרת תנועתיות הנעה בקטעים בודדים של המעי הגס שפן ניסיונות דיסטלי. מערכת שלמה כולל מחשב, מצלמת וידאו, אמבטיה איבר מוארים, אמבט מים peristaltic ומחוממת במחזור משאבות, ותוכנה GIMM מנהג להקליט ולנתח נתונים. לעומת שיטות מסורתיות של ניטור תנועה פריסטלטית הגס, מערכת GIMM מאפשר הערכה כמותית של תנועתיות רציפה. המעי הגס שפן ניסיונות דיסטלי טובל חימם פתרון, קרבס מחומצן, וכדוריות צואה הוכנס בסופו של דבר דרך הפה הם מונעים לאורך קטע של המעי הגס בשיעור של כ - 2 מ"מ / sec. סרטים ההליך גלולה צואה לאורך קטע נלכדים, ואת תוכנת GIMM ניתן לעקוב אחר ההתקדמות של גלולה צואה. שיעורי תנועתיות הנעה ניתן להשיג עבור מגזר שלם או לאזור מסוים של עניין. בנוסף ניתוח של בולוס-Induced תבניות תנועתיות, מפות spatiotemporal ניתן לבנות קטעי וידאו שנתפסו כדי להעריך דפוסי פעילות ספונטנית מוטורית. יישומים של מערכת זו כוללת הערכה תרופתי של השפעות אגוניסטים לקולטן ואת היריבים על תנועתיות הנעה, כמו גם הערכה של שינויים הנובעים תנאי pathophysiological, כגון דלקת או מתח. החזיר דיסטלי ניסיונות הנעה תנועתיות המעי הגס assay, באמצעות מערכת GIMM, היא פשוטה ופשוט ללמוד, זה מספק שיטה אמינה לשחזור הערכת תנועתיות הנעה.

Protocol

1. הכנת רקמות קולון עבור GIMM

כדי להכין קטע של מעי גס דיסטלי עבור צג תנועתיות מערכת העיכול (GIMM), במקום הראשון המעי הגס מבודד קר כקרח פתרון קרבס (121 mM NaCl, KCl mM 5.9, 2.5 מ"מ CaCl _2, 1.2 mM MgCl _2, 25 mM NaHCO ₃ , 1.2 mM לאא ₂ PO _4, 8 גלוקוז מ"מ; סודה עם 95% O ₂ / 5% CO _2). לסלק mesentery הנותר מהקיר החיצוני לעשות חתך קטן בסופו של דבר דרך הפה כך ניתן להבחין כאשר הניח לאמבטיה איברים. הערה: רקמה עשויים להישאר פתרון קרבס קר עד 2 שעות לפני ניסויים.
בשלב הבא, עמדת יבוא ו יצוא תעלות באמבטיה האיבר ולכן הם מחוץ לתחום המצלמה כדי למנוע הפרעה עם רכישת התמונה. ברציפות perfuse האמבטיה עם איבר prewarmed (37 ° C) מחומצן (95%, 5% CO ₂₎ הפתרון של Kreb בקצב זרימה של 10 מ"ל / דקה.
מעקב אחר קצות הפה לעומת אנאלי, להצמיד קטע של מעי גס דיסטלי (לפחות 5 ס"מ) על צד באמבטיה איברים, מה שמאפשר מידה קטנה של רפיון כך במגזר יכולים לנוע בחופשיות עד 1 ס"מ באמצע . סוף פומי יש למקם כלפי החוקר על מנת להקל על הצבת גלולה צואה. קטעי המעי הגס צריך להיות מוצמד באופן זהה על ידי החוקר זהה עבור כל ניסוי בתוך מערכת נתונה של ניסויים בגלל אורך מתח של המגזר משפיע על קצב תנועתיות הנעה, עם מתיחה אורכית יורדת קצב המעבר (דיקסון et al. , 2007).
לאפשר הכנת לאזן דקות לפחות 30.

2. הגדרת GIMM נתונים רכישה

במערכת GIMM, קטע המעי הגס בחדר זלוף מואר מלמטה. מצלמת וידאו דיגיטלית interfaced עם מחשב ממוקם מעל תא. ודא כי הן את מקור תאורה אור ותוכנה GIMM מופעלים.
לאחר הגדרת ניסוי חדש ביישום התוכנה GIMM, להתחיל את המשפט הראשון על ידי החדרת גלולה אפוקסי מצופה צואה לתוך סוף פומי של המגזר הגס ליזום תנועה פריסטלטית. לחץ על מתג למתג את המצלמה במחשב כדי להפעיל את המצלמה ולחץ על הכפתור שיא כדי להתחיל בהקלטה. התנועה של גלולה בכיוון אנאלי שתועדו על ידי מצלמת וידאו דיגיטלית את הסרטים המאוחסנים במחשב לצורך ניתוח מאוחר יותר. גלולה מתי הגיע סוף קטע המעי הגס, לחץ על לחצן שיא כדי לעצור את ההקלטה.
כדי להשיג שליטה על ערך בשיעור של הנעה, להתחיל עם קטע המעי הגס מבעל חיים בריא מבלי להחיל סמים. ההתנהגות 3-5 ניסויים לקראת יחיד, עם תקופת החלמה של 5 דקות בין כל סיבוב.
כדי לקבוע את ההשפעות של מצבים או תרופות מסוימות על תנועתיות המעי הגס, לבצע 3-5 משפטים / כהכנה כל תנאי הניסוי. בנוסף, לבצע כל ניסוי על לפחות חמישה נקודתיים שונים לפחות חמישה בעלי חיים שונים.
בניתוח של הסרטים הדיגיטליים, בשיעור של הנעה גלולה צואה מחושב הזמן שלוקח גלולה לעבור ס"מ X של קטע המעי הגס.

3. בניית מפות Spatiotemporal

הסרטונים דיגיטלית רכשה פועל GIMM בודדים ניתן להמיר מפות spatiotemporal באמצעות תוכנת GIMM אישית.
על הציר האופקי, השינויים בקוטר הגס הם זממו לאורך זמן על ידי המרת תמונה של המעי הגס בכל מסגרת וידאו צללית, ואת חישוב המרת בקוטר לכל אורך לתוך סולם אפור. התוצאה הסופית היא כי גלולה ותחומי הרפיה מופיעים שחור, בעוד אזורים של התכווצות להופיע לבן.
המרחק נסע ידי גלולה דרך קטע המעי הגס מיוצג על הציר האנכי.

4. מפות Spatiotemporal נציג

המוצגים כאן הם מפות spatiotemporal נציג מראה תנועתיות גלולה במגזרי הגס תחת תנאים ניסויים שונים. הציר (אנכי) y מייצג עמדה גלולה לאורך זמן, ואילו ציר (אופקי) x מייצג את המרחק גלולה התקדם דרך קטע המעי הגס.
במפת spatiotemporal מן המעי הגס שליטה (מטופל, רגיל), גלולה תהיה התקדמות לינארית בשיעור של 2 ~ מ"מ / sec. לעומת זאת, הממשל של תרופות מסוימות או דלקת במעי הגס יכול לגרום תבניות תנועתיות שיבשו כגון תנועתיות נעצרה תנועתיות חסום.
תוצאות מ GIMM יכול להיות גם, כפי שמוצג גרפים, שבה ציר y מייצג את המרחק במילימטרים נסע גלולה צואה ואת ציר x מייצג את הזמן בשניות. לדוגמה, מתן DAMGO (D-Ala2, N-Me-Phe4, גלאי-ol5),μ רצפטור אגוניסט אופיום, גורמת לירידה הנעה תנועתיות במעי הגס.

Discussion

עצב בתיווך הנעה תנועתיות במערכת העיכול תוארה לראשונה מעל לפני מאה שנה על ידי בייליס ו סטרלינג (בייליס ו סטרלינג, 1899). תצפית זו הובילה ייעוד של העצבים של המעי כמו מערכת העצבים enteric (ENS), חלוקה ברורה של מערכת העצבים האוטונומית (Langley, 1921). תנועה פריסטלטית במערכת העיכול neurogenic כולל מתיחה ו / או גירוי הרירית בנקודה מסוימת ואת ההתכווצויות בתיווך רפלקס לעיל, או בעל פה, את רמת הגירוי הרפיה בכיוון aboral. התוצאה היא דור חדש של הפרש לחצים המניע את התוכן luminal בתוך הפה לכיוון aboral. בתוך המעי הדק של מגוון מינים, במעי עכברוש גדול, גלים של התכווצויות peristaltic יכול להיות מופעל על ידי עירוי נוזלים לתוך לומן של חלקי המעי. במעי הגס שפן ניסיונות דיסטלי, כדורי צואה טבעיים או מלאכותיים יכול להיות מוכנס לתוך סוף פומי של המעי הגס ואת התקדמותם לאורך קטע של המעי הגס ניתן לפקח בקלות. לפיכך, המעי הגס שפן ניסיונות דיסטלי מספק assay פשוט ושימושי על חקירת הנעה תנועתיות במעי.

תנועה פריסטלטית היא רפלקס עצביות מורכבות כולל מספר תרכובות neuroactive ואת הקולטנים. כתוצאה מכך, תרכובות המשפיעות עצבית ב ENS להשפיע על שער של תנועתיות הנעה. סרוטונין, שפורסמו בעיקר רירית המעי מתאי enterochromaffin, עוסקת בייזום של רפלקס peristaltic. שימוש החזיר דיסטלי גיניאה המעי הגס, Grider ועמיתיו הראו כי הנעה תנועתיות מוגברת על ידי הממשל intralumenal של 5-HT ₄ אגוניסטים לקולטן (פוקס אורנשטיין, et al, 1998;.. Grider et al, 1998), ואילו באמבט של היישום של 5 _HT-3 ו - 5-HT ₄ אנטגוניסטים לקולטן ומצמצם את קצב הנעה (Kadowaki et al, 1996;. לינדן et al, 2003).. יתר על כן, עיכוב טרנספורטר הסרוטונין עם בררני ספיגה חוזרת של סרוטונין (SSRIs) מגביר תנועה פריסטלטית בריכוזים נמוכים, אך פוחתת תנועה פריסטלטית בריכוזים גבוהים יותר, כנראה עקב הפחתת רגישות של קולטני 5-HT (Kadowaki et al, 1996;.. ווייד ואח', 1996). מולקולות איתות אחרים שתורמים תנועתיות שפן ניסיונות הנעה כוללים אצטילכולין הפועל על קולטנים ניקוטינית, אשר המתווך העיקרי של איתות איטרניורונאליים במעיים. חסימת ההולכה הסינפטית עם אנטגוניסט לרצפטור ניאציניות hexamethonium פוחתת הנעה גלולה בריכוזים גבוהים, בעוד ריכוזי פחותה אינם משפיעים על שיעור של הנעה (Kadowaki et al. 1996). אופיאטים, ו אגוניסטים לקולטן אופיואידים, אשר כבר זמן רב ידוע על ההשפעות מעכבות על תנועתיות מערכת העיכול, ירידה הנעה גלולה במודל הנעה שפן ניסיונות תנועתיות (פוקס אורנשטיין, et al, 1998;.. Wood et al, 2009). מעניין, daikenchuto, הרפואה המסורתית צמחים יפני בשימוש קליני לטיפול, הקאות, כאבי בטן, ועל הפרעות תנועתיות, ומצמצם את קצב הנעה גלולה כאשר מנוהל עם נלוקסון היריב אופיואידים, וכאשר ניתנת לבד, התוצאה היא תנועה פריסטלטית הפוכה (Wood et al. 2009). ממצאים אלו ממחישים את השימושיות של המודל הנעה תנועתיות קביה להעריך את התרומה של מרכיבים שונים הקולטנים שלהם על דפוסי תנועתיות המעי הגס.

מספר מחקרים הראו כי דלקת מוביל לשינויים המאפיינים החשמליים סינפטיים של נוירונים הגס (לינדן et al, 2003 א,.. לומאקס et al, 2005), וכי שינויים אלו יכולים להימשך שבועות לאחר החלמה מדלקת (Krauter . et al, 2007; לומאקס et al, 2007).. ההשפעה של קוליטיס-Induced שינויים neuroplastic על תנועתיות הנעה יכול להיחקר במעי הגס שפן ניסיונות דיסטלי באמצעות מערכת GIMM. במערכת זו יש מספר יתרונות על פני השיטה המסורתית של ניטור תנועתיות המעי הגס, אשר מעריך תנועתיות הנעה פשוט על ידי מדידת זמן גלולה צואה נוסע למרחק נתון. מחקרים קודמים של פלסטיות עצבית, דלקת הנגרמת במעי הגס הראו שיש ירידה למהירות של גלולה הנעה (לינדן et al, 2003 א,.. לינדן et al, 2005), אך החקירות האחרונות יותר באמצעות מערכת GIMM חשפו יותר שינויים מורכבים (Strong et al. 2010). לדוגמה, בשיעור של גלולה הנעה הוא ירד באזורים כיבים דיסטלי של המעי הגס דלקת, אך תנועתיות מואץ באזורים סמוכים, תופעה שלא היתה מוכרת קודם לכן לפי שיטת "סטופר". מחקרים אחרים הראו כי dysmotility בשלב פעיל של דלקת ניתן לשחזר עם עיכוב COX-2 (לינדן et al., 2004), אך תנועתיות שינו כי נמשכת מעברהרזולוציה של דלקת הוא COX-2 רגישות (Krauter et al. 2007). יתרה מכך, מחקרים אלה מאוחר יותר, מפות spatiotemporal שנוצר על ידי מערכת GIMM גילה דפוס בשלבים של תנועתיות המעי הגס כי נצפתה שלאחר דלקת חיות תורם שיעורי ירידה של הנעה.

לסיכום, החזיר דיסטלי גיניאה תנועתיות המעי הגס הנעה assay מייצג תפוקה גבוהה באמצעות מדידת ההשפעות של תרכובות הבדיקה במצבים פתולוגיים על תנועתיות המעי הגס, יתר על כן, מערכת GIMM מספק גישה פשוטה וישירה להעריך הנעה תנועתיות המעי הגס במבחנה. היא מאפשרת מדידה רציפה של גלולה הנעה, כמו גם את הדור של מפות spatiotemporal ללמוד דפוסי הפעילות הספונטנית. לעומת שיטות מסורתיות, זה יכול גם להניב תופעה מורכבת יותר כי ניתן ונרשמת ודרכי reanalyzed מרובות כקבצים דיגיטליים נשמרים במערכת נגישים בקלות.

Disclosures

ההפקה של הוידאו הזה מומן על ידי מחקר ופיתוח בקטמאונט ו, Inc, אשר מייצרת את המכשיר משמש במאמר זה.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Krebs’ Solution
Isoflurane	Anesthesia	Webster Veterinary
Epoxy-coated fecal pellet				native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated
Forceps		Fine Science Tools
Micro Scissors		Fine Science Tools
Stainless Steel Pins
Beakers				500 mL
Gas Tank				95% O₂/5% CO₂
Timer
Gastrointestinal Motility Monitor		Catamount Research and Development		http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm