Summary
Gastrointestinal Motilite izleyicisi ile kobay distal kolonda kolonik motilite değerlendirilmesi (Gimm), gastrointestinal sistem itici motilite kantitatif olarak değerlendirmek için öğrenmek için basit ve basit bir yaklaşımdır.
Abstract
Gastrointestinal Motilite Monitör (Gimm Catamount Araştırma ve Geliştirme; St Albans, VT), in vitro sistemde izole kobay distal kolon segmentlerinde itici motilite izler . Komple bir sistem, bir bilgisayar, video kamera, ışıklı organ banyosu, pompalar dolaşan peristaltik ve ısıtmalı su banyosu, ve veri kaydı ve analiz için özel Gimm yazılım oluşur. Kolonik peristaltizm izleme geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, Gimm sistemi motilite sürekli, kantitatif değerlendirme sağlar. Kobay distal kolon ısındı, oksijenli Krebs çözüm yıkandığı ve oral sonuna eklenen fekal pelet yaklaşık 2 mm / sn hızında kolon segment boyunca hareketli. Filmler segment boyunca fekal pelet geçmeden yakalanır ve Gimm yazılım fekal pelet ilerlemeyi izlemek kullanılabilir. Itici motilite oranları tüm segment için veya herhangi bir özel ilgi bölge için elde edilebilir. Bolus indüklenen motilite desen analizine ek olarak, Spatiotemporal haritalar, spontan motor aktivite kalıplarını değerlendirmek için çekilen video segmentleri inşa edilecek. Bu sistem uygulamaları farmakolojik itici motilite reseptör agonistleri ve antagonistleri etkilerinin değerlendirilmesi yanı sıra, enflamasyon ya da stres gibi fizyopatolojik koşullardaki kaynaklanan değişikliklerin değerlendirilmesi. Gimm sistemini kullanarak kobay distal kolon itici motilite testi, öğrenmesi kolay ve basittir ve bu itici motilite değerlendirilmesinde güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.
Protocol
1. Gimm Colon Doku hazırlanması
- Gastrointestinal Motilite Monitör (Gimm), ilk etapta izole kolon (121 mM NaCl, 5.9 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, 1.2 mM MgCl 2, 25 mM NaHCO 3 buz Krebs çözümü için distal kolon segmenti hazırlamak için 1.2 mM NaH 2 PO 4 ve 8 mM glukoz,% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile gazlı). Kalan mezenter dış duvardan uzak temizleyin ve organ banyosuna yerleştirilir zaman ayırt edilir, böylece oral sonunda küçük bir kesi yapmak. Not: doku 2 saat önce deney için buzlu Krebs çözüm kalabilirler.
- Sonra, görüntü elde etme girişimi önlemek için kamera alanının dışında organ banyosuna giriş ve çıkış kanallar yerleştirin. Sürekli prewarmed organ banyosu serpmek (37 ° C) 10 ml / dk akış hızında Krebs çözeltisi oksijenli (% 95,% 5 CO 2).
- Anal vs oral biter takip etmek, orta segmentte 1 cm kadar serbestçe hareket ettiğinden, küçük bir gevşeklik derecesi sağlayan organ banyosunda iki ucundaki pin distal kolon segment (en az 5 cm) . Fekal pelet yerleştirme kolaylığı için araştırmacı doğru sözlü sonuna yerleştirilmelidir. Segment uzunluğu ve gerginlik boylamasına streç ile transit (Dickson ve ark oranını azaltarak, itici motilite oranı etkiler çünkü Kolon bölümleri belirli bir deney seti içindeki her deney için aynı araştırmacı tarafından aynı şekilde tutturulmuş olmalıdır. , 2007).
- Hazırlanması, en az 30 dakika boyunca gelmesini sağlayınız.
2. Gimm ve Veri Toplama ayarlama
- Gimm sisteminde, perfüzyon odasında kolonik segment altından aydınlatılır. Bir bilgisayar ile arabirim bir dijital video kamera odasının üstünde bir konuma sahiptir. Işık aydınlatma kaynağı ve Gimm yazılım hem de açık olduğundan emin olun.
- Gimm yazılım uygulaması yeni bir deneme kurduktan sonra, epoksi kaplı bir fekal pelet peristaltizm başlatmak için kolon segmentinin oral ucunu takarak ilk deneme başlayacak. Kamerayı açmak ve Kayda başlamak için kayıt düğmesine tıklayın bilgisayardaki kamera düğme üzerine tıklayın. Pelet anal yönde hareketi, video kamera tarafından kaydedilen ve dijital filmlerinizi daha sonra analiz için bir PC üzerinde saklanır. Pelet kolon segmentinin sonuna ulaştığında, kaydı durdurmak için kayıt düğmesini tıklatın.
- Sevk oranı için bir kontrol değeri elde etmek için, sağlıklı bir hayvanın bir kolon segmenti ve ilaç uygulamadan başlar. Her çalışma arasında 5 dakikalık bir iyileşme süresi, tek bir hazırlık 3-5 deneyler.
- Kolonik motilite belirli koşullar veya ilaçların etkilerini belirlemek için, her deneysel durum için 3-5 denemeler / hazırlık yaparlar. Buna ek olarak, en az beş farklı hayvanların en az beş farklı iki nokta üst üste her bir deney gerçekleştirir.
- Dijital film analizi, fekal pelet sevk oranı kolonik segment X cm çapraz bir pelet için gereken süre olarak hesaplanır.
3. Uzaysal Haritalar İnşaatı
- Tek tek Gimm çalışır elde edilen dijital video, özel Gimm yazılımı kullanılarak Spatiotemporal haritalar dönüştürülebilir.
- Yatay eksen, kolon çapı değişiklikleri videonun her karesini bir siluet kolon görüntü dönüştürme ve hesaplanması ve gri-skala içine boydan boya çapı dönüştürme zamanla çizilir. Sonuçta daralma alanlarda beyaz görünmesini pelet ve dinlenme alanları, siyah görünür.
- Kolon segment üzerinden pelet tarafından katedilen mesafe dikey ekseni temsil edilmektedir.
4. Temsilci Spatiotemporal Haritalar
- Çeşitli deneysel koşullar altında kolon segmentlerinde pelet motilite gösteren temsili Spatiotemporal haritalar burada gösterilir. X (yatay) eksen pelet kolon segment üzerinden ilerlediğini mesafe temsil ederken, y (dikey) eksen, zamanla pelet konumu temsil eder.
- Uzaysal harita bir kontrol kolon (normal, işlenmemiş), pelet ~ 2 mm / sn hızında doğrusal ilerleme olacaktır. Buna karşılık, bazı ilaçlar ya da kolonda enflamasyon idaresi durduruldu motilite ve tıkalı motilite gibi kesintiye motilite desenler neden olabilir.
- Y ekseni fekal pelet ve x-ekseni saniye cinsinden zamanı temsil tarafından katedilen mesafe milimetre olarak temsil eden, Gimm gelen sonuçları da grafik olarak gösterilen olabilir. Örneğin, DAMGO (D-ALA 2, N-Me-Phe4, Gly-ol5) yönetimi, biropiat μ-reseptör agonisti, kolon itici hareketliliğinde azalmaya neden olur.
Discussion
Gastrointestinal sistem, sinir aracılı itici motilite bir asır önce ilk defa Bayliss ve Starling (Bayliss ve Starling, 1899) tarafından tarif edilmiştir. Bu gözlem, enterik sinir sistemi (ENS), otonom sinir sisteminin farklı bir bölümü (Langley, 1921) gibi bağırsak sinirler atama yol açtı. Nörojenik bağırsak peristaltizm belirli bir noktaya ve refleks aracılı kasılmaları şeyden önce, ya da sözlü, aboral yönünde uyaran ve rahatlama düzeyine yayma ve / veya mukozal stimülasyonu gerektirir. Sonuç aboral yönde bir sözlü luminal içeriğini propels bir basınç gradiyenti nesil. Türlerin çeşitli ince bağırsak ve kalın bağırsak sıçan, kasılmaların peristaltik dalgalar barsak segmentlerinin lümen içine sıvı infüzyonu tarafından aktif hale getirilebilir. Kobay distal kolonda kolon oral ucunu, doğal ya da yapay fekal pelet eklenecek ve kolon segment boyunca ilerleme kolayca takip edilebilir. Böylece, kobay distal kolon, bağırsak itici motilite araştırmak için basit ve kullanışlı bir çalışma sağlar.
Peristaltizm nöroaktif bileşikleri ve reseptörlerin sayısı içeren karmaşık bir sinir refleks. Sonuç olarak, ENS de nörotransmisyon etkileyen bileşikler itici motilite oranını etkilemez. Serotonin, bağırsak mukozasının enterochromaffın hücreleri öncelikle piyasaya peristaltik refleks başlanması yer almaktadır. Itici motilite 4 5-HT reseptör agonistleri (Foxx-Orenstein ve ark, 1998; Grider ve ark, 1998) intralumenal idaresi tarafından geliştirilmiş olduğunu göstermiştir kobay distal kolon, Grider ve arkadaşları kullanarak, uygulama, 5 banyo -HT 3 ve 4, 5-HT reseptör antagonistleri sevk oranı (. Linden ve ark, 2003b. Kadowaki ve ark, 1996) azalır. Ayrıca, serotonin seçici gerialım inhibitörlerinin (SSRI) ile serotonin taşıyıcı inhibisyonu henüz 5-HT reseptörleri (Kadowaki ve ark, 1996, duyarsızlaştırma nedeniyle muhtemelen daha yüksek konsantrasyonlarda peristaltizm, azaltan, düşük konsantrasyonlarda peristaltizm artırır. Wade ve ark , 1996). Kobay itici motilite katkıda bulunan diğer sinyal molekülleri bağırsaklarda internöronal sinyal birincil arabulucu nikotinik reseptörleri, oyunculuk asetilkolin içerir. Sevk oranı (Kadowaki ve ark, 1996) daha az konsantrasyonlarda etkilemez Engelleme nikotinik reseptör antagonisti hexamethonium sinaptik iletim, yüksek konsantrasyonlarda pelet tahrik azalır. Uzun gastrointestinal motilite üzerine inhibitör etkileri olduğu bilinmektedir Opiatlar ve opioid reseptör agonistleri, kobay itici motilite modeli pelet tahrik azaltmak (; Wood ve ark, 2009 Foxx-Orenstein ve ark, 1998). İlginçtir, opioid antagonisti nalokson ile birlikte uygulandığında daikenchuto, kusma, karın ağrısı ve düzensiz motilite tedavisi için klinik olarak kullanılan geleneksel Japon bitkisel ilaç, pelet sevk oranı azalır ve tek başına verildiğinde ters peristaltizm sonuçları (Wood ve ark. 2009). Bu bulgular, çeşitli bileşikler ve bunların reseptörleri kolonik motilite desen katkıları değerlendirmek için kobay itici motilite modeli yararlılığını göstermektedir.
Bir dizi çalışmada, inflamasyon kolon nöron (. Linden ve ark, 2003a; Lomax ve ark, 2005) Elektrik ve sinaptik özelliklerinde değişikliklere neden olduğunu göstermiştir ve bu değişiklikler (Kräuter inflamasyon kurtarma aşağıdaki hafta devam edebilir et al, 2007; Lomax ve ark, 2007). Kolit indüklenen nöroplastik değişikliklerin itici motilite Gimm sistemini kullanarak kobay distal kolon etkisi araştırılmıştır. Bu sistem, sadece bir fekal pelet belli bir mesafe yolculuk zamanı ölçmek için itici motilite değerlendirir kolonik motilite, izleme geleneksel yöntem üzerinde birçok avantajı vardır. Gimm sistemi kullanarak daha fazla son araştırmalar, henüz daha ortaya koymuştur; kolonda enflamasyon kaynaklı nöral plastisite Önceki çalışmalarda pelet tahrik (Linden ve ark, 2005 Linden ve ark, 2003a) hızında bir azalma göstermiştir karmaşık değişiklikler (Güçlü ve ark, 2010). Örneğin, ülserli bölgelerde iltihaplı distal kolon pelet sevk oranı azalır, henüz motilite bitişik bölgeler, daha önceki "kronometre" yöntemi tarafından tanınan bir fenomen ivme. Diğer çalışmalarda aktif inflamasyon aşamasında dismotilite COX-2 (Linden ve ark, 2004), henüz ötesinde devam değişmiş motilite inhibe ile restore edilebilir olduğunu göstermiştirinflamasyon çözünürlük COX-2 büyüklüğüne duyarsız (Kräuter ve ark, 2007). Ayrıca, bu daha sonraki çalışmalarda, Gimm sistem tarafından üretilen Spatiotemporal haritalar tahrik azalmış oranları katkıda post-inflamatuar hayvanlarda gözlenmiştir kolonik motilite adım adım bir model ortaya koymuştur.
Sonuç olarak, yüksek verim kobay distal kolon itici motilite tahlil kolonik motilite test bileşikleri ve patolojik durumların etkilerini ölçmek anlamına gelir temsil eder, Ayrıca, Gimm sistemi in vitro kolonik itici motilite değerlendirmek için basit ve anlaşılır bir yaklaşım sağlar. Pelet tahrik sürekli ölçümlerin yanı sıra spontan aktivite desen çalışması için Spatiotemporal haritaların üretimi için izin verir. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, aynı zamanda dijital dosyaları sisteme kaydedilir ve kolayca erişilebilir quantitated ve tekrar analiz birden çok yolu olabilir daha karmaşık bir olgu verebilmesidir.
Disclosures
Bu makalede kullanılan alet üreten Catamount Araştırma ve Geliştirme, Inc, bu video üretim sponsor oldu.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Krebs’ Solution | ||||
| Isoflurane | Anesthesia | Webster Veterinary | ||
| Epoxy-coated fecal pellet | native guinea pig pellet dried and epoxy (black nail polish) coated | |||
| Forceps | Fine Science Tools | |||
| Micro Scissors | Fine Science Tools | |||
| Stainless Steel Pins | ||||
| Beakers | 500 mL | |||
| Gas Tank | 95% O2/5% CO2 | |||
| Timer | ||||
| Gastrointestinal Motility Monitor | Catamount Research and Development | http://www.catamountresearch.com/products/gimm.htm |
References
- Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. J of Physiol (Lond). 24, 99-143 Forthcoming.
- Dickson, E. J., Spencer, N. J., Hennig, G. W., Bayguinov, P. O., Ren, J., Heredia, D. J., Smith, T. K. An enteric occult reflex underlies accommodation and slow transit in the distal large bowel. Gastroenterology. 132, 1912-1924 (2007).
- Foxx-Orenstein, A. E., Jin, J. G., Grider, J. R. 5-HT4 receptor agonists and delta-opioid receptor antagonists act synergistically to stimulate colonic propulsion. Am J Physiol. 275, 979-983 (1998).
- Grider, J. R., Foxx-Orenstein, A. E., Jin, J. G. 5-Hydroxytryptamine4 receptor agonists initiate the peristaltic reflex in human, rat, and guinea pig intestine. Gastroenterology. 115, 370-380 (1998).
- Kadowaki, M., Wade, P. R., Gershon, Participation of 5-HT3, 5-HT4, and nicotinic receptors in the peristaltic reflex of guinea pig distal colon. Am J Physiol. 271, 849-857 (1996).
- Krauter, E. M., Strong, D. S., Brooks, E. M., Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Changes in colonic motility and the electrophysiological properties of myenteric neurons persist following recovery from trinitrobenzene sulfonic acid colitis in the guinea pig. Neurogastroenterol Motil. 19, 990-1000 (2007).
- Langley, J. N. The Autonomic Nervous System. , Heffer. Cambridge, UK. (1921).
- Linden, D. R., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea-pig distal colon. J Physiol. 547, 589-601 (2003).
- Linden, D. R., Sharkey, K. A., Ho, W., Mawe, G. M. Cyclooxygenase-2 contributes to dysmotility and enhanced excitability of myenteric AH neurones in the inflamed guinea pig distal colon. J Physiol. 557, 191-205 (2004).
- Linden, D. R., Chen, J. X., Gershon, M. D., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Serotonin availability is increased in mucosa of guinea pigs with TNBS-induced colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 285, 207-216 (2003).
- Linden, D. R., Couvrette, J. M., Ciolino, A., McQuoid, C., Blaszyk, H., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Indiscriminate loss of myenteric neurones in the TNBS-inflamed guinea-pig distal colon. Neurogastroenterol Motil. 17, 751-760 (2005).
- Lomax, A. E., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. Synaptic facilitation and enhanced neuronal excitability in the submucosal plexus during experimental colitis in guinea-pig. J Physiol. 564, 863-875 (2005).
- Lomax, A. E., O'Hara, J. R., Hyland, N. P., Mawe, G. M., Sharkey, K. A. Persistent alterations to enteric neural signaling in the guinea pig colon following the resolution of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292, 482-491 (2007).
- Strong, D. S., Cornbrooks, C. F., Roberts, J. A., Hoffman, J. M., Sharkey, K. A., Mawe, G. M. Purinergic neuromuscular transmission is selectively attenuated in ulcerated regions of inflamed guinea pig distal colon. J Physiol. 588, 847-859 (2010).
- Wade, P. R., Chen, J., Jaffe, B., Kassem, I. S., Blakely, R. D., Gershon, Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16, 2352-2364 (1996).
- Wood, M. J., Hyman, N. H., Mawe, G. M. The Effects of Daikenchuto (DKT) on Propulsive Motility in the Colon. J Surg Res. , (2009).
