Summary
इस प्रोटोकॉल सार्स के खिलाफ रीकॉम्बीनैंट रिसेप्टर - बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी) आधारित सबयूनिट टीके के अध्ययन के लिए एक सामान्य प्रक्रिया का वर्णन करता है. यह अभिकर्मक और आरबीडी 293T कोशिकाओं में प्रोटीन, आरबीडी और माउस सीरा के निराकरण की गतिविधि की स्थापना की एक सार्स pseudovirus निराकरण परख का उपयोग का पता लगाने के साथ चूहों के टीकाकरण की अभिव्यक्ति के लिए तरीके शामिल हैं.
Protocol
1. पुनः संयोजक सार्स-COV आरबीडी प्रोटीन तैयार
- कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक अभिकर्मक तैयार
- 2X HBS बफर तैयारी: एक साथ मिश्रण के 16 ग्राम NaCl, ना 2 4 HPO * 7 2 हे के 0.4 ग्राम, और HEPES के 13.0 ग्राम. 7.00 पीएच समायोजित और आसुत जल में 1000 एमएल कुल मात्रा लाने के. समाधान के लिए नसबंदी, विभाज्य फ़िल्टरिंग और यह -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान करने के बाद
सुझाव: पीएच मान के कोई बदलाव अभिकर्मक परिणाम को प्रभावित करेगा. इस प्रकार, यह सलाह दी जाती है (उदाहरण के लिए, 6.99, 7.00, या 7.01) 7.00 के आसपास कई पीएच मान का परीक्षण और नीचे शुरू की विधि का उपयोग अभिकर्मक के लिए सबसे अच्छा एक खोजने के है. - 2.5 एम CaCl 2 तैयारी: आसुत जल के लिए 200 एमएल की एक अंतिम मात्रा में 2 CaCl * 2H 2 हे के 73.5 ग्राम जोड़ें . -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान फ़िल्टर
- 2X HBS बफर तैयारी: एक साथ मिश्रण के 16 ग्राम NaCl, ना 2 4 HPO * 7 2 हे के 0.4 ग्राम, और HEPES के 13.0 ग्राम. 7.00 पीएच समायोजित और आसुत जल में 1000 एमएल कुल मात्रा लाने के. समाधान के लिए नसबंदी, विभाज्य फ़िल्टरिंग और यह -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान करने के बाद
- पुनः संयोजक प्लाज्मिड अभिकर्मक और शुद्धि प्रोटीन
- 50-70% पर 293T कोशिकाओं अभिकर्मक पहले confluency 24 घंटे भाजित. T-175 सेमी 40 एमएल DMEM 37 FBS और 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) 10% गर्मी निष्क्रिय (HI) युक्त ° 5% सीओ 2 सी में 2 टिशू कल्चर बोतल में कोशिकाओं के विकास.
- सभी अभिकर्मक अभिकर्मकों कमरे के तापमान पर किया जा चाहिए अभिकर्मक के सामने लाया है. इन अभिकर्मकों 2X HBS, 2.5m 2 CaCl, DiH 2 हे, और rRBD प्लाज्मिड 6 शामिल हैं.
सुझाव: अंतिम रीकॉम्बीनैंट प्लाज्मिड के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति एक संकेत पेप्टाइड होते संस्कृति सतह पर तैरनेवाला व्यक्त पुनः संयोजक प्रोटीन का स्राव सुनिश्चित किया जाना चाहिए का निर्माण. एक 6x उनका टैग आसान शुद्धि के लिए व्यक्त प्रोटीन के सी - टर्मिनल के लिए जोड़ा जा सकता है. - एक 50 (ए) एमएल और एक 15 एमएल (बी) बी.डी. फाल्कन ट्यूब तैयार है, और जैसा कि तालिका 1 में दर्शाए ट्यूबों के लिए अभिकर्मकों जोड़ने. ट्यूब में ट्यूब ए बी 2X HBS बफर जोड़ें, 2.5m CaCl 2 जोड़ने और प्लाज्मिड rRBD, और DiH ओ 2 में आवश्यकता मात्रा लाने
टेबल अभिकर्मक 1. मिश्रण तैयार करने और मात्राएक ए टी 175 सेमी 2 टिशू कल्चर (4000 / μL फ्लास्क) फ्लास्क: rRBD अभिव्यक्ति के लिए तैयार एक ट्यूब ट्यूब बी 2X HBS 2000 μL 2.5m 2 CaCl 200 μL rRBD प्लाज्मिड डीएनए 40 μg DiH 2 करने के लिए हे 2000 μL बी एक 100 मिमी पेट्री पकवान (1000 μL / पकवान): सार्स pseudovirus उत्पादन के लिए तैयार एक ट्यूब ट्यूब बी 2X HBS 500 μL 2.5m 2 CaCl 50 μL एस सार्स-COV प्लास्मिड डीएनए 5 μg एचआईवी-1 प्लाज्मिड (pNL4 - 3.luc.RE) 5 μg DiH 2 करने के लिए हे 500 μL
तालिका 1 में सूचीबद्ध मात्रा एक अभिकर्मक इकाई के लिए कर रहे हैं. यदि अधिक बोतल या बर्तन अभिकर्मक के लिए उपयोग किया जाता है, मात्रा तदनुसार समायोजित. - एक dropwise तरीके से एक ट्यूब में डीएनए कैल्शियम ट्यूब बी समाधान में जोड़ें, जबकि लगातार और कोमल बनाए रखने एक भंवर में मिश्रण. चलो मिश्रण 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं. सफल कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण गठन वेग के आकार और आकार पर निर्भर करता है. इस प्रकार, मिश्रण लगातार धीरे धीरे vortexed होना चाहिए इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए और, एक परिणाम के रूप में, अभिकर्मक प्रभावकारिता में सुधार.
- Dropwise और भी तरीके में 293T कोशिकाओं की (4000 μL / फ्लास्क) में मिश्रण जोड़ें. इनक्यूबेटर में 37 में संस्कृति कोशिकाओं ° सी 5% सीओ 2 में.
- ताजा सीरम मुक्त OPTI-सदस्य मैं कम सीरम (50 एमएल / फ्लास्क) मध्यम 8-10 घंटे के बाद अभिकर्मक के साथ संस्कृति के माध्यम से बदलें. संस्कृति कोशिकाओं को उसी हालत में दो और दिनों के लिए आगे बढ़ें.
- सतह पर तैरनेवाला युक्त व्यक्त rRBD प्रोटीन 72 घंटे बाद अभिकर्मक लीजिए. सेल मलबे को हटाने के 15 मिनट के लिए 6000 rpm पर अपकेंद्रित्र. एकत्र की है और 4 ° C रातोंरात सतह पर तैरनेवाला दुकान protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल जोड़ें.
- अगले दिन, संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से rRBD पुनः संयोजक प्रोटीन शुद्ध नी NTA Superflow निम्नलिखित निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर.
- शुद्ध Amicon अल्ट्रा -15 एकाग्रता ट्यूबों का उपयोग प्रोटीन ध्यान लगाओ. प्रोटीन एकाग्रता के बाद,एकाग्रता ट्यूबों पीबीएस जोड़ने और फिर अपकेंद्रित्र elution बफर में imidazole हटायें. प्रोटीन एकाग्रता और दुकान -80 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक प्रोटीन शुद्ध गणना.
2. माउस टीकाकरण और नमूना संग्रह
- पूर्व गर्म सिग्मा सहायक 40-45 प्रणाली (एसएएस) डिग्री सेल्सियस निर्माता के निर्देशों के अनुसार. शीशी प्रति 1 एमएल पीबीएस जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
- तालिका 2 में प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन सहायक पायस तैयार करें. पिपेट एक 1.5 एमएल ट्यूब में rRBD प्रोटीन की गणना. ट्यूब और 2-3 करने के लिए पायस फार्म मिनट लिए सख्ती भंवर SAS सहायक के बराबर मात्रा में जोड़ें.
सुझाव: तालिका 2 में सूचीबद्ध मात्रा एक माउस के लिए कर रहे हैं. वास्तविक माउस इस्तेमाल किया संख्या के अनुसार मात्रा समायोजित करें. प्रत्येक समूह के लिए, साथ में प्रत्येक टीके के लिए आवश्यक प्रोटीन और सहायक मिश्रण. हमेशा की शुद्धता सुनिश्चित करने के टीकाकरण के लिए एक अतिरिक्त नमूना तैयार.
टेबल 2 माउस प्रतिरक्षण प्रोटोकॉलसमूह 1 सेंट टीका
(200 μL / माउस)2 एन डी टीका
(200 μL / माउस)3 तीसरी टीका
(200 μL / माउस)rRBD प्रोटीन पीबीएस में 20 μg प्रोटीन
(100 μL) + 100 μL SASपीबीएस में 10 μg प्रोटीन (100 μL) + 100 μL SAS पीबीएस में 10 μg प्रोटीन (100 μL) + 100 μL SAS पीबीएस नियंत्रण 100 μL पीबीएस +
100 μL SAS100 μL पीबीएस +
100 μL SAS100 μL पीबीएस +
100 μL SAS - Subcutaneously प्राइम - छुटकारा महिला / BALB सी (4-6 पुराने सप्ताह, 5 चूहों / समूह) चूहों, और rRBD और एसएएस के साथ दो बार को बढ़ावा देने के रूप में तालिका 2 में संकेत दिया. नियंत्रण के रूप में पीबीएस समूह का उपयोग करें. उपचर्म इंजेक्शन के लिए आम तौर पर चुना साइट कंधे ब्लेड के बीच ढीली त्वचा है. वैकल्पिक रूप से, उदर पेट सामान्यतः प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह आसान करने के लिए इंजेक्षन, और इंजेक्शन साइटों से किसी भी रिसाव निरीक्षण कर सकते हैं. जब टीकों के दोहराया खुराक का उपयोग किया जाता है, यह आसान है के लिए विभिन्न इंजेक्शन साइटों का चयन करने के लिए, संभावित स्थानीय त्वचा प्रतिक्रियाओं को रोकने.
- प्रतिरक्षण और प्रत्येक टीकाकरण के बाद 10 दिनों से पहले चतनाशून्य करनेवाली औषधि के साथ रेट्रो - कक्षीय, और गर्मी सीरा 56 डिग्री सेल्सियस 30 मिनट के लिए पूरक निष्क्रिय करने के लिए के माध्यम से चूहों भरो. स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस पर माउस सीरा उपयोग करें जब तक.
3. निराकरण Pseudovirus निराकरण परख का उपयोग कर जांच
- सार्स pseudovirus तैयार
- 100 मिमी टिशू कल्चर पेट्री डिश में 293T कोशिकाओं भाजित (2x10 6 कोशिकाओं / पकवान) अभिकर्मक पहले 16 घंटे, और कोशिकाओं के रूप में ऊपर बढ़ने.
- अभिकर्मक के रूप में तालिका 1 में दर्शाए अभिकर्मकों तैयार करें. सह transfect एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग एस सार्स-COV प्रोटीन और प्लाज्मिड एन्कोडिंग लि दोषपूर्ण, luciferase व्यक्त एचआईवी -1 (pNL4 3.luc.RE) जीनोम कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक अभिकर्मक का उपयोग कर.
- 10 एमएल ताजा DMEM 10% FBS और% 1 पी / एस 8-10 घंटे के बाद अभिकर्मक युक्त के साथ मध्यम बदलें. सतह पर तैरनेवाला युक्त सार्स pseudovirus 72 घंटे बाद अभिकर्मक लीजिए.
- 0.45 सुक्ष्ममापी फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर pseudovirus. विभाज्य और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक.
- सार्स pseudovirus निराकरण परख
- 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों में 293T 10 में सार्स-COV रिसेप्टर ACE2 (ACE2/293T) 4 cells/100 / μL अच्छी तरह व्यक्त कोशिकाओं को संक्रमण से पहले 16 घंटे भाजित .
- 2 गुना द्वारा सार्स pseudovirus पतला ACE2/293T कोशिकाओं में वायरस टिटर का पता लगाने के लिए.
- Serially 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों में माउस सीरा पतला, और titrated सार्स pseudovirus के बराबर मात्रा में जोड़ें. 37 ° C पर एक एच. के लिए प्लेटें Preincubate
- ऊष्मायन के बाद, ACE2/293T कोशिकाओं को सीरा - pseudovirus मिश्रण के 100 μL जोड़ने के लिए, और 37 पर कोशिकाओं के विकास के लिए जारी ° 5% सीओ 2 में सी. ताजा DMEM 24 घंटे बाद जोड़ें.
- पूरी तरह से प्लेटों से संस्कृति supernatants 72 घंटे बाद संक्रमण को दूर. 1X luciferase सेल संस्कृति lysis अभिकर्मक (60 μL / अच्छी तरह से) जोड़ें, और 1-2 घंटे के लिए लगातार प्लेटों के कमरे के तापमान पर मिलाते साथ lysis सेल को बढ़ावा देने.
- स्थानांतरण luminometer प्लेटें में सेल lysates (50 μL / अच्छी तरह से) (96 अच्छी तरह प्लेटें Microfluor). Luciferase परख प्रणाली में शामिल luciferase सब्सट्रेट (50 μL अच्छी तरह /) जोड़ें, और अल्ट्रा 384 luminometer में रिश्तेदार luciferase गतिविधि का पता लगाने.
- 50% निष्क्रिय करने एंटीबॉडी (50 NT) टिटर 6 के रूप में सार्स pseudovirus निराकरण टिटर और वर्तमान की गणना.
Discussion
सेल घनत्व के एक महत्वपूर्ण कैल्शियम फास्फेट आधारित अभिकर्मक की प्रभावकारिता को प्रभावित कारक है. हमारे अनुभव में, कम से कम 70% कक्षों की confluency सबसे अच्छा परिणाम लाता है. इस प्रकार, क्रम में अभिकर्मक दक्षता में सुधार करने के लिए, यह सिफारिश की है कि सेल घनत्व confluency के 50-70% के आसपास में रखा जाना. कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक विधि आम तौर पर अन्य अभिकर्मक तरीकों, जैसे लिपिड 16 अभिकर्मक के साथ तुलना में कम कुशल हो सोचा है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, हम एक संशोधित कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक तरीका है जिससे लगातार और धीमी गति से एक भंवर में अभिकर्मक समाधान के मिश्रण उचित आकार और आकार के साथ एक वेग के गठन सुनिश्चित करता है का इस्तेमाल किया है, इस प्रकार अभिकर्मक दक्षता में सुधार.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (AI68002 RO1) के संयुक्त राज्य अमेरिका के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Na2HPO4*7H2O | Sigma-Aldrich | S2429 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| OPTI-MEM I Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836170001 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30450 | |
| Sigma adjuvant system | Sigma-Aldrich | S6322 | |
| Luciferase assay system | Promega Corp. | E1501 | |
| Luciferase cell culture lysis reagent (5X) | Promega Corp. | E1531 | |
| Amicon Ultra - 15 | EMD Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor 96-well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7905 | |
| Ultra 384 luminometer | Tecan Group Ltd. |
References
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