Summary
Detta protokoll beskriver ett allmänt förfarande för att studera rekombinant receptor-bindande domän (RBD)-baserade subenheten vaccin mot sars. Den innehåller metoder för transfektion och uttryck RBD protein i 293T celler, immunisering av möss med RBD och detektering av neutralisering aktiviteten av mus serum med hjälp av en etablerad sars-analys pseudovirus neutralisering.
Abstract
Baserat på deras säkerhetsprofil och förmåga att inducera potent immunsvar mot infektioner, har subenhet vaccin använts som kandidater för en mängd olika patogener 1-3. Eftersom däggdjursceller systemet klarar av post-translationell modifiering, och utgör därmed ordentligt vikta och glykosylerade proteiner har rekombinanta proteiner som uttrycks i däggdjursceller visat störst potential att hålla en hög antigenicitet och immunogenicitet 4-6.
Även om inga nya fall av sars har rapporterats sedan 2004, framtida utbrott är ett ständigt hot, och därför är utvecklingen av vaccin mot sars-CoV en försiktig förebyggande åtgärd och bör genomföras. I RBD av sars-CoV S protein spelar en viktig roll i receptorbindning och induktion av specifika neutraliserande antikroppar mot virusinfektion 7-9. Därför, i detta protokoll, beskriver vi nya metoder för att utveckla en RBD-baserad subenheten vaccin mot sars. Kortfattat var det rekombinanta RBD protein (rRBD) uttryckt i supernatant av däggdjurs-293T celler för att få en korrekt vikt protein med korrekt exteriör och hög immunogenicitet 6. Den transfektion av rekombinant plasmid kodning RBD till cellerna var då utförs med hjälp av ett kalcium metod fosfat transfektion 6,10 med vissa ändringar. Jämfört med lipid transfektion metoden 11,12, detta är modifierad kalciumfosfat transfektion metoden billigare, lättare att hantera, och har potential att nå hög effekt när en transfektion komplex med lämplig storlek och form bildas 13,14. Slutligen var en sars pseudovirus neutralisering test infördes i protokollet och används för att upptäcka de neutraliserande aktivitet i serum av möss vaccinerade med rRBD protein. Denna analys är relativt säker, inte innebär en smittsam sars-CoV, och kan utföras utan krav på en biosäkerhet-3 laboratorium 15.
Protokollet som beskrivs här kan också användas för att utforma och studera rekombinanta subenheten vacciner mot andra virus med klass I fusionsproteiner, till exempel HIV, RS-virus (RSV), ebolavirus influensavirus, liksom Nipah och Handra virus. Dessutom kan metoderna för att generera en pseudovirus och därefter upprättande av en analys pseudovirus neutralisering tillämpas på alla dessa virus.
Protocol
1. Rekombinant sars-CoV RBD Protein Förberedelser
- Förbered kalcium reagens fosfat transfektion
- 2X HBS buffert preparatet: Blanda ihop 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, och 13,0 g HEPES. Justera pH till 7,00 och ta upp den totala volymen till 1000 ml i destillerat vatten. Efter filtrering lösningen för sterilisering, delprov och lagra det vid -20 ° C.
Tips: Alla variationer av pH-värdet skulle påverka transfektion resultaten. Därför är det lämpligt att testa flera olika pH-värden runt 7,00 (exempelvis 6,99, 7,00 eller 7,01) och hitta den bästa för de transfektion med metoden infördes nedan. - 2,5 M CaCl 2 preparatet: Tillsätt 73,5 g CaCl 2 * 2H 2 O till destillerat vatten i en slutlig volym på 200 ml. Filtrera lösningen och förvara vid -20 ° C.
- 2X HBS buffert preparatet: Blanda ihop 16 g NaCl, 0,4 g Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, och 13,0 g HEPES. Justera pH till 7,00 och ta upp den totala volymen till 1000 ml i destillerat vatten. Efter filtrering lösningen för sterilisering, delprov och lagra det vid -20 ° C.
- Rekombinant plasmid transfektion och proteinrening
- Dela 293T celler med 50-70% confluency 24 timmar före transfektion. Väx celler i T-175 cm 2 kolvar vävnadskultur i 40 ml DMEM innehåller 10% värmeinaktiveras (HI) FBS och 1% Penicillin / streptomycin (P / S) vid 37 ° C i 5% CO 2.
- Alla transfektion reagens bör tas upp till rumstemperatur innan transfektion. Dessa reagenser inkluderar 2X HBS, 2.5M CaCl 2, DiH 2 O och rRBD plasmid 6.
Tips: Den slutliga rekombinant plasmid konstruera används för proteinuttryck bör innehålla en signal peptid för att säkerställa sekretion av uttryckt rekombinanta proteiner till kulturen supernatanten. En 6x Hans tagg kan läggas till C-terminalen det uttryckta proteinets för enkel rening. - Förbered en 50 ml (A) och en 15 ml (B) BD Falcon rör, och lägga reagens rören som anges i tabell 1. Lägg 2X HBS buffert för att tub A. I röret B, tillsätt 2,5 miljoner CaCl 2 och rRBD plasmid och föra volymen till kravet i DiH 2 O.
Tabell 1. Transfektion blandning förberedelse och volymerA. En T-175 cm 2 vävnadsodling kolv (4000 ml / kolv): förbereda rRBD uttryck Rör A Rör B 2X HBS 2000 mikroliter 2,5 M CaCl 2 200 mikroliter rRBD plasmid-DNA 40 mikrogram DiH 2 O 2000 mikroliter B. En 100-mm petriskål (1000 ml / fat): förbereda för sars pseudovirus produktion Rör A Rör B 2X HBS 500 mikroliter 2,5 M CaCl 2 50 mikroliter Sars-CoV S plasmid-DNA 5 mikrogram HIV-1 plasmid (pNL4-3.luc.RE) 5 mikrogram DiH 2 O 500 mikroliter
De volymer som anges i tabell 1 för en transfektion enhet. Om fler flaskor eller maträtter används för transfektion, justera volymen därefter. - Lägg till DNA-kalcium i rör B i röret A i ett droppvis sätt, samtidigt som konstant och varsam blandning i en virvel. Låt blandningen sätta sig i rumstemperatur i 20-30 min. Nyckeln till en framgångsrik kalciumfosfat transfektion beror på storleken och formen på de bildade fällningen. Därför bör blandningen vortexed konstant och långsamt för att tillgodose detta krav och som ett resultat, förbättra transfektion effekt.
- Lägg blandningen i en droppvis och till och med sätt in 293T celler (4000 ml / flaska). Kultur celler i inkubator vid 37 ° C i 5% CO 2.
- Byt odlingsmedium med färska serumfritt OPTI-MEM Jag reducerade-Serum Medium (50 ml / flaska) 80-10 timmar efter transfektion. Fortsätt att kulturen celler för två dagar i samma skick.
- Samla supernatanten som innehåller uttryck rRBD protein 72 timmar efter transfektion. Centrifugera vid 6000 rpm i 15 min för att avlägsna celler skräp. Lägg cocktail proteashämmare för att den insamlade supernatanten och förvara vid 4 ° C över natten.
- Nästa dag, rena rRBD rekombinant protein från supernatant med Ni-NTA Superflow efter tillverkarens anvisningar.
- Koncentrera renat protein med Amicon Ultra -15 koncentration rör. Efter proteinkoncentration,Lägg PBS koncentrationen rören och centrifugera igen för att ta bort imidazol i eluering buffert. Beräkna protein koncentration och lagra renat protein vid -80 ° C fram till användning.
2. Mus vaccination och Provtagning
- Pre-varm Sigma adjuvant system (SAS) till 40-45 ° C enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt 1 mL PBS per flaska och blanda väl.
- Förbered protein-adjuvans emulsion enligt protokollet i tabell 2. Pipettera beräknas rRBD protein i ett 1,5 ml rör. Tillsätt lika stor mängd SAS adjuvans till röret och vortexa kraftigt i 2-3 minuter för att bilda emulsion.
Tips: De volymer som anges i tabell 2 för en mus. Justera volym enligt den faktiska musen använda nummer. För varje grupp, blanda ihop de proteiner och adjuvans krävs för varje vaccin. Alltid förbereda ett extra prov för vaccinering för att säkerställa noggrannheten.
Tabell 2. Mouse immunisering protokollGrupp 1 st vaccin
(200 mikroliter / mus)2: a vaccin
(200 mikroliter / mus)3: e vaccin
(200 mikroliter / mus)rRBD protein 20 mikrogram protein i PBS
(100 mikroliter) + 100 mikroliter SAS10 mikrogram protein i PBS (100 mikroliter) + 100 mikroliter SAS 10 mikrogram protein i PBS (100 mikroliter) + 100 mikroliter SAS PBS-kontroll 100 mikroliter PBS +
100 mikroliter SAS100 mikroliter PBS +
100 mikroliter SAS100 mikroliter PBS +
100 mikroliter SAS - Subkutant prime-vaccinera kvinnliga BALB / c möss (4-6 veckor gammal, 5 möss / grupp), och öka två gånger med rRBD och SAS anges i tabell 2. Använd PBS grupp som kontroll. Webbplatsen för subkutan injektion oftast valt är den lösa huden mellan skulderbladen. Alternativt är den ventrala buken används ofta, eftersom det är lättare att injicera, och kan iaktta eventuella läckage från injektionsstället. När upprepade doser av vaccin som används, är det lätt att välja olika injektionsställen, förebygga potentiella lokala hudreaktioner.
- Utfallande möss via retro-orbital med bedövning före immunisering och 10 dagar efter varje vaccination och värme serum vid 56 ° C i 30 min för att inaktivera komplement. Förvara mus serum vid -20 ° C fram till användning.
3. Neutralisering Detektering med hjälp av analys Pseudovirus neutralisering
- Förbered sars pseudovirus
- Dela 293T celler i 100 kultur mm vävnad petriskålar (2x10 6 celler / fat) 16 h före transfektion, och växa celler som ovan.
- Förbered transfektion reagens som anges i tabell 1. Co-transfektera en plasmid kodning sars-CoV S protein och en plasmid kodning env-defekt, luciferas-uttrycker HIV-1-genomet (pNL4-3.luc.RE) med kalcium reagens fosfat transfektion.
- Byt medium med 10 mL färsk DMEM innehåller 10% FBS och 1% P / S 8-10 timmar efter transfektion. Samla supernatanten innehållande sars pseudovirus 72 timmar efter transfektion.
- Filtrera pseudovirus genom ett 0,45 ìm filter. Alikvotera och förvara vid -80 ° C fram till användning.
- SARS pseudovirus neutralisering analys
- Dela 293T celler som uttrycker sars-CoV receptorn ACE2 (ACE2/293T) vid 10 4 cells/100 mikroliter / brunn i 96-brunnar vävnadsodling 16 timmar före infektion.
- Späd SARS pseudovirus med 2-faldigt att upptäcka viruset titer i ACE2/293T celler.
- Seriellt späda mus serum i 96-hålsplattor vävnadsodling och lägga lika volym titrerad sars pseudovirus. Preincubate plattorna vid 37 ° C under 1 h.
- Efter inkubation, tillsätt 100 ìl av serum-pseudovirus blandningen ACE2/293T celler, och fortsätter att växa celler vid 37 ° C i 5% CO 2. Lägg färska DMEM 24 timmar senare.
- Helt ta bort kulturen supernatanterna från plattorna 72 timmar efter infektion. Lägg 1X luciferas cell reagens kultur lys (60 mikroliter / brunn), och främja cellslys med konstant skakning av plattor för 1-2 timmar i rumstemperatur.
- Överföring cell lysates (50 mikroliter / brunn) i luminometer plattor (Microfluor plattor med 96 brunnar). Lägg luciferas substrat (50 mikroliter / brunn) som ingår i luciferas analyssystem, och upptäcka relativa luciferas aktivitet i Ultra 384 luminometer.
- Beräkna sars titer pseudovirus neutralisering och presentera som 50% neutraliserande antikroppstiter (NT 50) 6.
Discussion
Celltäthet är en viktig faktor som påverkar effekten av kalciumfosfat-baserade transfektion. Enligt vår erfarenhet tar mindre än 70% confluency av cellerna de bästa resultaten. Således, i syfte att förbättra transfektion effektivitet, rekommenderas att celltäthet hållas på omkring 50-70% av confluency. Den kalciumfosfat transfektion metod är i allmänhet vara mindre effektiva jämfört med andra transfektion metoder, såsom lipid transfektion 16. Men i detta protokoll, använde vi en modifierad kalcium metod fosfat transfektion där konstant och långsam blandning av transfektion lösning i en virvel säkerställer bildandet av en fällning med lämplig storlek och form, och därmed förbättra transfektion effektivitet.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NIH) i USA (RO1 AI68002).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Na2HPO4*7H2O | Sigma-Aldrich | S2429 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430 | |
| HI FBS | Invitrogen | 10438 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| OPTI-MEM I Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11836170001 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30450 | |
| Sigma adjuvant system | Sigma-Aldrich | S6322 | |
| Luciferase assay system | Promega Corp. | E1501 | |
| Luciferase cell culture lysis reagent (5X) | Promega Corp. | E1531 | |
| Amicon Ultra - 15 | EMD Millipore | UFC901024 | |
| Microfluor 96-well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 7905 | |
| Ultra 384 luminometer | Tecan Group Ltd. |
References
- Pitcovski, J., Gutter, B., Gallili, G., Goldway, M., Perelman, B., Gross, G., Krispel, S., Barbakov, M., Michael, A. Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine. 21, 4736-4743 (2003).
- Tait, A., Hall, F. R. Theileria annulata: control measures, diagnosis and the potential use of subunit vaccines. Rev. Sci. Tech. 9, 387-403 (1990).
- Qi, Z., Zhou, L., Zhang, Q., Ren, L., Dai, R., Wu, B., Wang, T., Zhu, Z., Yang, Y., Cui, B., Wang, Z., Wang, H., Qiu, Y., Guo, Z., Yang, R., Wang, X. Comparison of mouse, guinea pig and rabbit models for evaluation of plague subunit vaccine F1+rV270. Vaccine. 28, 1655-1660 (2010).
- Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
- Du, L., Zhao, G., Li, L., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Antigenicity and immunogenicity of SARS-CoV S protein receptor-binding domain stably expressed in CHO cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 384, 486-490 (2009).
- Du, L., Zhao, G., Chan, C. C., Sun, S., Chen, M., Liu, Z., Guo, H., He, Y., Zhou, Y., Zheng, B. J., Jiang, S. Recombinant receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein expressed in mammalian, insect and E. coli cells elicits potent neutralizing antibody and protective immunity. Virology. 393, 144-150 (2009).
- Ambrosino, D. M. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78, 4552-4560 (2004).
- Li, W., Moore, M. J., Vasilieva, N., Sui, J., Wong, S. K., Berne, M. A., Somasundaran, M., Sullivan, J. L., Luzuriaga, K., Greenough, T. C., Choe, H., Farzan, M. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 426, 450-454 (2003).
- He, Y., Zhou, Y., Liu, S., Kou, Z., Li, W., Farzan, M., Jiang, S. Receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein induces highly potent neutralizing antibodies: implication for developing subunit vaccine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 324, 773-781 (2004).
- Batard, P., Jordan, M., Wurm, F. Transfer of high copy number plasmid into mammalian cells by calcium phosphate transfection. Gene. 270, 61-68 (2001).
- Pramfalk, C., Lanner, J., Andersson, M., Danielsson, E., Kaiser, C., Renstrom, I. M., Warolen, M., James, S. R. Insulin receptor activation and down-regulation by cationic lipid transfection reagents. BMC. Cell Biol. 5, 7-7 (2004).
- Rosser, M. P., Xia, W., Hartsell, S., McCaman, M., Zhu, Y., Wang, S., Harvey, S., Bringmann, P., Cobb, R. R. Transient transfection of CHO-K1-S using serum-free medium in suspension: a rapid mammalian protein expression system. Protein Expr. Purif. 40, 237-243 (2005).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Jiang, M., Deng, L., Chen, G. High Ca(2+)-phosphate transfection efficiency enables single neuron gene analysis. Gene Ther. 11, 1303-1311 (2004).
- Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, 140-149 (2004).
- Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors. Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).
