Summary
En metod för RNA-interferens (RNAi) genom injektion av dsRNA till unfed fästingar beskrivs. RNAi är den mest använda gener tystas teknik i fästingar där användningen av andra metoder för genetisk manipulation har varit begränsade.
Abstract
Fästingar är obligata hematophagous ektoparasiter av vilda och tama djur och människor, och anses vara andra världen över att myggor som vektorer av sjukdomar hos människan 1 och våra viktigaste faktorer som påverkar boskap över hela världen 2. Fästingar klassificeras i underklassen Acari, Parasitiformes ordning, underordning Ixodida och distribueras över hela världen från Arktis till tropiska regioner 3. Trots ansträngningar att kontrollera fästing angrepp, dessa ektoparasiter är fortfarande ett allvarligt problem för människors och djurs hälsa 4,5.
RNA-interferens (RNAi) 6 är en nukleinsyra baserad omvänd genetisk strategi som omfattar störningar av genuttryck för att bestämma geners funktion och dess effekt på en metabolismväg. Små störande RNA (siRNA) är effektor molekyler av RNAi väg som initieras av dubbelsträngat RNA (dsRNA) och resulterar i en potent sekvensspecifika nedbrytning av cytoplasmiska mRNA som innehåller samma sekvens som dsRNA utlösa 7-9. Post-transkription geners uttryck mekanismer initieras av dsRNA har upptäckts i alla eukaryoter studerat hittills, och RNAi har snabbt utvecklats i en mängd olika organismer som ett verktyg för funktionsgenomik studier och andra program 10.
RNAi har blivit det mest använda gener tystas teknik i fästingar och andra organismer där alternativa metoder för genetisk manipulation inte är tillgängliga eller är otillförlitliga 5,11. Den genetiska karakterisering av fästingar har begränsats till aktuell tillämpning av RNAi 12,13. Under den korta tid som RNAi har funnits, har det visat sig vara ett värdefullt verktyg för att studera funktionen kryssa gen, en karakterisering av den fästingburna patogen gränssnitt och screening och karakterisering av fästing skyddande antigen 14. Häri, är en metod för RNAi genom injektion av dsRNA i unfed fästingar beskrivs. Det är troligt att de kunskaper som förvärvats från denna experimentella strategi kommer att bidra markant till förståelsen av grundläggande biologiska system och utveckling av vacciner för att styra fästing angrepp och förhindra överföring av fästingburna patogener 15-19.
Protocol
1. Generering av dsRNA.
- Syntetisera oligonukleotid grundfärger innehåller T7 promotorn sekvenser för in vitro transkription och syntes av dsRNA (till exempel för Dermacentor variabilis subolesin använda oligonukleotid grundfärger D8AAT75:
5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 "och D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3). - Amplify målgenen med RT-PCR, med 10 pmol för varje oligonukleotid primer och 1-10 ng av RNA fästing totalt.
- Rena PCR-produkten.
- Syntetisera dsRNA med 8 mikroliter av det renade PCR-produkten.
- Kvantifiera dsRNA av spektrometri.
2. Injektion av fästingar med dsRNA.
2,1. Beredning av fästingar för injektion.
- Först, tvätta fästingar i en serie av lösningar genom att skaka dem i varje lösning i en 50 ml för engångsbruk centrifugrör, dekantering lösningen genom ett finmaskigt gallervägg över röret toppen att behålla fästingar. Sekvensen av lösningarna för att tvätta fästingar är kranvatten, 3% väteperoxid, två tvättar med destillerat vatten, 70% etanol och två tvättar med destillerat vatten.
- Blot-torka fästingar på hushållspapper.
- Räkna fästingar i grupper på 20 till 50, beroende på experimentet, placera fästingar från varje grupp i en 1,25 oz plastmugg med ett tätt monterade lock och etikett med den experimentella gruppnummer.
2,2. Kryssa injektion laget.
Den RNAi lag består av tre personer: (1) en person som positioner varje fästing på dubbel tejp som fästs på ett blad av röd dentalvax, (2) en person som sprutar in fästingar och (3) en person som övervakar fästingar efter injektion, andas CO 2 på fästingar för att aktivera dem och räknar levande fästingar i koppar märkta med den experimentella gruppnummer. Alla lagmedlemmar måste använda engångshandskar.
2,3. Placering av fästingar för injektion.
- Fånga en fästing med Dumont fin pincett och placera den ventrala sidan upp på dubbel tejp som fästs på en 3 "x 6"-ark av rött dentala vax. Den fästingar är nära placerade tillsammans i grupper om 5 fästingar.
- Placera en liten remsa maskeringstejp över den mouthparts av alla 5 fästingar för att ytterligare hålla tillbaka dem, men samtidigt större delen av kroppen utsättas för, så att injektionen processen kan observeras av fästingen injektorn (Figur 1).
2,4. Injektion av fästingar.
- Fästingarna kommer att injiceras i nedre högra kvadranten av ventrala yta exoskelett.
- Först, stick ett hål i exoskelett med hjälp av en Monoject insulin spruta med ett ½ ", 29 gauge nål (Figur 2a).
- Injicera fästingar omedelbart med 0,2-0,5 ìl dsRNA lösning (5 x 10 till 5 Oktober x 10 11 molekyler per mikroliter) med en skräddarsydd Hamilton spruta med en 1 tum, 33 gauge kanyl med en 45 ° fasad punkt (figur 2b) . Nålen bör placeras långt in fästingen hålighet att försäkra placering och bibehållande av dsRNA. En del vätska kommer sannolikt att fly från injektionsstället (Figur 2c). Försiktighet bör iakttas inte över injicera fästingar, vilket skulle orsaka förlust av hemolymph och kan orsaka död på fästingen.
- Rengör Hamilton sprutan efter avslutad injektion i varje försöksgrupp. innan du använder för en annan experimentell grupp. Fyll sprutan först från en bägare som innehåller 3% väteperoxid och sedan utvisa till ett avfallskärl, och upprepa 15 gånger. Fyll sprutan från en bägare som innehåller sterilt vatten och sedan utvisa in i en papperskorg, och upprepa 15 gånger. Var noga med att inte böja kolven i Hamilton sprutan, för om böjda, kommer kolven inte rör sig smidigt och svara på lätt beröring krävs för injektion av fästingar.
2,5. Behandling av fästingar efter injektionen.
- Plocka upp den injicerade fästingen omedelbart från dubbel tejp med fin pincett och placera den i en plast återhämtning behållare (ca 6 "x 6" och vikare med maskeringstejp för att förhindra flykt av fästingar). Fästingarna kommer att kortfattat inaktiv efter injektion men ska snart börja krypa runt i skålen.
- Breath CO 2 på fästingar direkt efter att placera dem i återvinningen behållaren för att aktivera fästingar. När fästingar är krypande och aktiva kommer injektionen såret läker snabbt och de kommer sannolikt att överleva.
- Räkna fästingar efter antalet i varje försöksgrupp och placera dem i en märkt plastmugg med ett tätt monterade lock. Byte fästingar ska injiceras för att ersätta alla att någon dog innan injicera nästa försöksgruppen.
2,6. Tick innehav.
- Placera fästingar i en fuktkammare (12tim ljus: 12 tim mörkt fotoperiod vid 22-25 ° C och 95% relativ humidity) intryckt i 1 dag.
- Placera fästingar i tick-utfodring celler, en per experimentell grupp, limmas på ett får och låta dem foder med ett lika stort antal uninjected manliga eller kvinnliga fästingar (beroende på vilket kön inte injicerades). Kvinna fästingar som foder för att fylla upp, har de som tas bort från fåren efter 10 dagars utfodring eller när kontrollen honorna somnade värden samlas in och vägs.
- Placera fästingar i kartonger, och håll i fuktig kammare till dess att äggläggning. Utvärdera äggläggning genom att väga ägget massproducerade av alla fästingar i gruppen.
2,7. Analys av fästing fenotypen efter RNAi.
- Utvärdera kryssa fenotypen efter utfodring genom att bestämma hur många fästingar som överlevde, kryssa vikt, äggläggning och ägg fertilitet. Dock kan andra analyser göras beroende på riktade genen och målen för studien.
3. Analys för att bekräfta utsläckning av geners uttryck med RT-PCR.
- Dissekera spottkörtlar och inälvor från enskilda fästingar från kontroll-injiceras och dsRNA-injiceras grupper efter utfodring.
- Utdrag totala RNA från enskilda vävnadsprover.
- Analysera avskrifter målgenen i enskilda vävnader genom realtids-RT-PCR och normalisera RNA-nivåer mot fästing 16S rRNA med genNorm metoden (ddCT metod som genomförts av Bio-Rad iQ5 Standard Edition, version 2.0).
- Kör dissociation kurvor i slutet av reaktionen att säkerställa att endast en amplicon bildas och att amplicons denaturera konsekvent i samma temperatur för varje prov.
- Jämför mRNA nivåer (normaliserade Ct-värden) mellan kontroll-injiceras och dsRNA-injiceras fästingar med Student `s t-test (P = 0,05).
4. Representativa resultat:
Protokollet som beskrivs här har använts i vårt laboratorium för RNAi i många olika ixodid fästing arter (tabell 1). Mängden dsRNA injiceras i fästingar varierar med storleken på fästingen, större fästing arter kan rymma en större volym. Negativa kontrollen fästingar bör injiceras med en orelaterad dsRNA. Flera dsRNAs som subolesin 14-19,22-25,27-32,34 och beta-aktin 20,21 kan användas som positiva kontroller. Observera att det är viktigt att tvätta sprutan mellan behandlingarna för att undvika att blanda dsRNA lösningar. Om protokollet är gjort rätt ska mindre än 5% dödlighet erhållas från injektionsproceduren efter 24 timmar. En typisk fenotyp efter genen ÖVERVÄLDIGANDE i fästingar visas i figur 3 med en panel av fästingar injiceras med pooler av dsRNA för att screena för fästingen skyddande antigener.
| Tick arter | dsRNA injiceras | Referenser |
| Ixodes scapularis | cDNA bibliotek, subolesin, aktin, nukleotidas, NF-kB, akirin | 21, 22, 29, 30 |
| Dermacentor variabilis | subolesin, GST, ubiquitin, vATPase, selenoproteins M och W2a, hematopoetisk stamcellstransplantation / progenitorceller protein-liknande, aktin proteasom 26S subenheten, ferritin1, varisin, akirin | 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 |
| Dermacentor marginatus | subolesin | 22 |
| Amblyomma americanum | cDNA bibliotek, subolesin, akirin | 17, 22, 30 |
| Amblyomma hebraeum | subolesin, voraxin | 28 |
| Rhipicephalus sanguineus | Rs86, subolesin | 22, 23 |
| Rhipicephalus MicroPlus | GST, ubiquitin, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a, flagelliform silkesprotein, von Willebrands faktor | 16, 18, 25, 27 |
| Rhipicephalus annulatus | ubiquitin, subolesin, EF1a, GIII | 16 |
Tabell 1. Tick arter där RNAi protokoll som har använts.
Figur 1. Placering av fästingar, ventrala uppåt på dubbel tejp följs ett ark rött dentala vax. Den fästingar är placerade i grupper om 5, varefter en liten remsa maskeringstejp placeras över mouthparts för att ytterligare säkra fästingar samtidigt som injektorn att observera kroppen på fästingen under injektion.
Figur 2. Injektionsproceduren innefattar (a) piercing det nedre högra kvadranten av fästingen exoskelett med insulin SYRinge utrustad med en 29 nål för att skapa en injektionsstället, (b) omedelbar injektion av dsRNA på denna webbplats med hjälp av en Hamilton spruta med en 33 gauge nål som (c) sannolikt kommer att resultera i några läckage av fästing hemolymph / vätskor.
Figur 3. En panel av fästing sex grupper där RNAi använts för att screena för kryssa skyddande antigener i Amblyomma americanum. De fenotypiska förändringarna i fästingar kan ses i jämförelse med den positiva subolesin RNAi kontroll och den negativa oberoende dsRNA kontroll. I detta experiment effekten av RNAi på fästing dödlighet, vikter och äggläggning i varje grupp var statistiskt analyserats.
Discussion
Även andra metoder har beskrivits för RNAi i fästingar 14, 33, beskrev injektion av dsRNA här är det mest använda i både unfed (tabell 1) och matas fästingar 16,25,34. RNAi har visat sig vara ett värdefullt verktyg för studier av fästingen geners funktion, karakteriseringen av tick-patogen gränssnitt och screening och karakterisering av fästing skyddande antigen 14,35. Framför allt har RNAi blivit den mest värdefullt verktyg för funktionella analyser i fästingar 35.
Metodiskt kommer RNAi utvecklas sannolikt till mer effektiva metoder som kan tillåta genen ÖVERVÄLDIGANDE i ett stort antal individer. Mekanismen för dsRNA-inducerad RNAi i fästingar bör förfinas för att bidra till en bättre förståelse och utnyttjande av denna genetiska tillvägagångssätt i denna art 35,36. Omfattningen av off-target effekter av RNAi i fästingar är också en viktig fråga som måste angripas fullt ut 14,27. Slutligen kommer RNAi sannolikt ge omfattande bidrag till studiet av fästingen genreglering och systembiologi och fästingen-patogen gränssnitt och kan ha en inverkan på utvecklingen av vacciner för att styra kryssa infestationer och överföring av fästingburna patogener.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i våra laboratorier för givande diskussioner och tekniskt bistånd. Denna video presentation stöddes av Associate Dean för forskning och Institutionen för veterinärmedicinska Patobiologi, Centrum för veterinär Health Sciences, Oklahoma State University. Forskningen har finansierats av Ministerio de Ciencia e Innovación, Spanien (projekt BFU2008-01244/BMC), den CSIC intramural projektet PA1002451 till JF, begåvad Walter R. Sitlington ordförande för livsmedel djurförsök till KMK, CVHS 2009 RAC bidrag, OAES djurhälsa Fonder och USDA, National Research Initiative Konkurrenskraftiga Grant, nr 2007 till 04.613.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Access RT-PCR system | Promega | A1250 | |
| Purelink PCR purification kit | Invitrogen | K3100-02 | |
| Megascript RNAi kit | Ambion | AM1626M | |
| Red dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72674 | |
| Plastic cups, 1.25 oz and lids | Solo Cup Company, Urbana Ill. | ||
| Fine forceps | Electron Microscopy Sciences | Various | |
| Insulin syringe | Monoject | Fitted with a ½", 29 gauge needle | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 701SN,33/.375”/45DGR | Custom made |
| TriReagent | Sigma | 93289 | |
| iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green | Bio-Rad | 170-8892 | |
| Real-time PCR detection system | Bio-Rad | Several | Please refer to http://www.bio-rad.com/ |
References
- de la Fuente, J. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).
- Peter, R. J. mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future. Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).
- Barker, S. C., Murrell, A. Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names. Parasitol. 129, S15-S36 (2004).
- Willadsen, P. Tick control: Thoughts on a research agenda. Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).
- de la Fuente, J., Kocan, K. M. Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species. Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Cerutti, H. RNA interference: traveling in the cell and gaining functions. Trends Genet. 19, 39-46 (2003).
- Kavi, H. H.
- Mello, C. C., Conte, D. J. r
- Zhou, D. RNA interference and potential applications. Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).
- Ramakrishnan, V. G. Application of RNA interference in tick salivary gland research. J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).
- Aljamali, M. N. RNA interference: applicability in tick research. Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).
- Aljamali, M. N. RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum. Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).
- de la Fuente, J. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
- de la Fuente, J. Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale. Genomics. 90, 712-722 (2007).
- AlmazäN, C. Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations. Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).
- de la Fuente, J. Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).
- Zivkovic, Z. Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale. BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).
- de la Fuente, J. Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin. Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).
- de la Fuente, J. RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens. Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).
- de la Fuente, J. The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction. Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).
- de la Fuente, J. Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference. Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).
- de la Fuente, J. Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference. Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).
- Nijhof, A. M. Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens. Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).
- Kocan, K. M. Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections. Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).
- de la Fuente, J. Evidence of the role of tick subolesin in gene expression. BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).
- Smith, A. The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition. Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).
- Galindo, R. C. Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates. Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).
- Canales, M. Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin. Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).
- Kocan, K. M. Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis. BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).
- Zivkovic, Z. Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks. BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).
- Karim, S. Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA. BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).
- Kocan, K. M. Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA. Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).
- de la Fuente, J. Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies. Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).
- Kurscheid, S. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).
