Summary
शाही सेना के हस्तक्षेप में जीन समारोह का विश्लेषण बहुत प्रभावी सिद्ध किया गया है
Abstract
आनुवंशिक स्क्रीनिंग एक जटिल जैविक प्रक्रिया 1 में अंतर्दृष्टि पाने के लिए सबसे शक्तिशाली तरीके उपलब्ध है. आनुवंशिक हेरफेर के लिए पिछले कुछ वर्षों में कई सुधार और उपकरण 2 ड्रोसोफिला में उपलब्ध हो गए हैं . जल्द ही frie और मेलो 3 द्वारा प्रारंभिक खोज की है कि डबल असहाय आरएनए Caenorhabditis एलिगेंस, शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) के लिए एक शक्तिशाली रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए ड्रोसोफिला अंग विकास में जीन के कार्यों का विश्लेषण करने के लिए दिखाया गया था में व्यक्तिगत जीनों की गतिविधि पछाड़ना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद 4, 5.
फेफड़े, गुर्दे, जिगर, और नाड़ी तंत्र सहित कई अंगों, branched ट्यूबलर नेटवर्क से बना रहे हैं कि परिवहन महत्वपूर्ण तरल पदार्थ या गैसों 6, 7. ड्रोसोफिला tracheal गठन के विश्लेषण एक शानदार मॉडल प्रणाली के लिए अन्य ट्यूबलर 8 अंगों के morphogenesis अध्ययन प्रदान करता है. बर्कले ड्रोसोफिला जीनोम परियोजना जीनों के सैकड़ों है कि tracheal प्रणाली में व्यक्त कर रहे हैं पता चला है. ट्यूब गठन की आणविक और सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए, चुनौती tracheal विकास में इन जीनों की भूमिका को समझने की है. यहाँ, हम ड्रोसोफिला भ्रूण में पछाड़ना व्यक्ति के जीन की अभिव्यक्ति के dsRNA इंजेक्शन की एक विस्तृत विधि का वर्णन किया . हम सफलतापूर्वक नीचे dsRNA इंजेक्शन द्वारा अंतर्जात dysfusion (dys) जीन अभिव्यक्ति खटखटाया. Dys bHLH - पीए tracheal संलयन कोशिकाओं में व्यक्त प्रोटीन है, और यह tracheal शाखा संलयन 9, 10 के लिए आवश्यक है. dys - आरएनएआई पूरी तरह से dys अभिव्यक्ति का सफाया और tracheal संलयन दोष में हुई. यह अपेक्षाकृत सरल विधि tissure और ड्रोसोफिला में अंग विकास के लिए requried जीनों की पहचान के लिए एक उपकरण प्रदान करता है.
Protocol
1. भ्रूण संग्रह
- 25 पर सेट पिंजरों ° सी का उपयोग कर 2-4 दिन पुरानी w 1118 flies.Grape रस प्लेटें दिन के दौरान हर घंटे बदल रहे हैं संग्रह से पहले 1-2 दिन की अवधि से अधिक अंडे संग्रह सिंक्रनाइज़
- 1hr के लिए 25 में भ्रूण लीजिए डिग्री सेल्सियस
- अंगूर का रस अगर एक आयताकार टुकड़ा है, बीच में एक धार के साथ हल्के कटौती कट, अगर में एक लाइन छोड़
- एक धातु की जांच का प्रयोग करने के लिए अंगूर का रस की थाली से भ्रूण अंगूर का रस अगर आपके टुकड़ा हस्तांतरण, उन्हें भ्रूण अगर के बीच में लाइन के लिए 45 डिग्री कोण पर अब अक्ष के साथ एक सीधी रेखा में लाइन. के बारे में 50 भ्रूण की एक सीधी रेखा. यकीन है कि पीछे लाइन से दूर ओर इशारा करते हुए अंत के साथ सभी एक ही दिशा में भ्रूण बात करें.
- डबल छड़ी टेप का एक आयताकार टुकड़ा काटें, और यह एक 18x18mm कवर पर्ची के लिए जगह.
- कवर पर्ची पर भ्रूण उठाओ डबल छड़ी टेप के साथ
- एक गिलास स्लाइड के लिए कवर पर्ची प्लेस, के बारे में 10 मिनट के लिए हवा में भ्रूण सूखी.
- 700 हेलोकार्बन तेल की एक पतली परत के साथ कवर, भ्रूण अब यह इंजेक्शन के लिए तैयार है.
2. सुई पुलिंग
गिलास केशिका ट्यूब खींच द्वारा microinjection सुइयों बनाओ. हम विश्व परिशुद्धता उपकरण (मॉडल पुल-1) से एक सुई खींचने का उपयोग करें. गर्मी: 1, 4 देरी सुई खींचने कार्यक्रम विनिर्देशों हैं.
3. सुई भरना
वापस लोड Eppendorf P20 Eppendorf Microloader सुझावों के साथ फिट पिपेट का उपयोग कर सुई, आम तौर पर 1.5-2 μL dsRNA लोड
4. सुई तोड़
- सुई तोड़ने से पहले, एक स्लाइड पर एक coverslip जगह.
- स्लाइड के मध्य में तेल की एक बूंद के साथ एक स्लाइड तैयार
- Picospritzer III picopump पर मुड़ें हवा के दबाव को समायोजित करने के लिए
- एक कवर पर्ची के किनारे के खिलाफ भरा सुई तोड़, एक तेज बिंदु बनाने.
- जब टिप टूट गया है, Picospritzer III picopump के पैर पेडल पर कदम, कुछ dsRNA सुई टिप के बाहर रिसाव जाएगा.
- Coverslip के साथ स्लाइड ले लो.
- पहले तैयार स्लाइड के मध्य में तेल की बूंद के तहत सुई डालें.
- Picospritzer III picopump पर सेटिंग समायोजित 100 200pl dsRNA जब आप पैर पेडल पर कदम. dsRNA एक छोटे से छोटी बूंद के रूप में देखा जा सकता है है.
5. इंजेक्शन
- एक ही फोकल हवाई जहाज़ में पहली blastoderm भ्रूण के पीछे भाग सुई टिप ले आओ और केंद्र बंद 30-50% अंडे की लंबाई लगभग भ्रूण इंजेक्षन.
- के बाद आप Picospritzer III picopump के पैर पेडल पर कदम, dsRNA की एक छोटी राशि इंजेक्शन साइट में एक छोटा सा डॉट के रूप में दिखाई देगा.
6. प्ररूपी विश्लेषण
- इंजेक्शन के बाद, एक कवर 18 की उम्र में नम (प्लास्टिक पेट्री डिश) चैम्बर ° C स्लाइड में जगह जब तक भ्रूण वांछित भ्रूण चरण के लिए विकसित.
- जांच का प्रयोग डबल पक्षीय टेप से भ्रूण को हटाने और उन्हें कवर पर्ची के किनारे करने के लिए धक्का.
स्लाइड बंद हेपटैन का उपयोग कर नीचे में नायलॉन जाल के साथ एक संग्रह शीशी में भ्रूण धो पीबीटी के साथ 3 बार धो लो.
5 मिनट के लिए 50% ब्लीच में Dechorionate भ्रूण, और PBT के साथ 3 बार धो लो.
संग्रह शीशी से नायलॉन जाल का एक टुकड़ा करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण, और तब लगानेवाला (5ml हेपटैन, 4.5ml Pbs, 0.5ml 37% formaldehyde) समाधान के लिए भ्रूण रिलीज में नायलॉन जाल डुबकी. 30min के लिए लगानेवाला समाधान में भ्रूण को ठीक करें.
मेथनॉल के साथ भ्रूण Devitellinize, Eppendorf ट्यूब भ्रूण हस्तांतरण, और मानक प्रोटोकॉल का उपयोग भ्रूण immunostain. - भ्रूण भी उपयुक्त लार्वा चरण के लिए विकसित कर सकते हैं.
- हेलोकार्बन 700 तेल के बीच में एक बूंद के साथ एक स्लाइड तैयार
- स्लाइड एक लार्वा स्थानांतरण करने के लिए, शीर्ष पर एक आवरण पर्ची डाल
- उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत लार्वा निरीक्षण.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
DsRNA का एक उदाहरण नीचे dysfusion Drosophlia भ्रूण में (dys) जीन Fig1 में दिखाया गया है है दस्तक. GFP-dsRNA इंजेक्शन भ्रूण नकारात्मक नियंत्रण कर रहे हैं. Dys bHLH पीए प्रतिलेखन tracheal संलयन कोशिकाओं में व्यक्त कारक है. GFP-dsRNA इंजेक्शन भ्रूण सामान्य tracheal संलयन दिखाने के लिए, और Dys संलयन कोशिकाओं (चित्रा 1A) में मौजूद प्रोटीन है. दूसरी ओर, dys - dsRNA इंजेक्शन भ्रूण में विफल रहा शाखा संलयन दिखाने, और Dys प्रोटीन संलयन कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) में मौजूद नहीं हैं. जब dsRNA इंजेक्शन भ्रूण लार्वा मंच को विकसित करने, dys - dsRNA इंजेक्शन लार्वा GFP-dsRNA इंजेक्शन नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 1C) की तुलना में असफल शाखा संलयन (Fig.1D) से पता चला. इन परिणामों से पता चला है अंतर्जात dys जीन अभिव्यक्ति के प्रभावी ड्रोसोफिला भ्रूण में dsRNA इंजेक्शन द्वारा नीचे दस्तक
चित्रा 1 dys समारोह के dys आरएनएआई द्वारा हटाना. Tracheal संलयन घ पता चलता हैefects. Blastoderm भ्रूण (W 1118) या तो (नकारात्मक नियंत्रण) GFP-dsRNA या dys dsRNA इंजेक्शन के साथ थे और tracheal दोष के लिए assayed. (ए) स्टेज 16 भ्रूण GFP-dsRNA के साथ इंजेक्शन और α-Dys और MAB 2A12 कि दाग tracheal लुमेन के साथ दाग. प्रमुखता से पार्श्व ट्रंक, जो इनकार किया है दिखाया गया है. तीर पार्श्व ट्रंक Dys पॉजिटिव संलयन कोशिकाओं को इंगित करें. (बी) स्टेज 16 भ्रूण dys - dsRNA के साथ इंजेक्शन और α Dys और MAB 2A12 के साथ दाग. भ्रूण पार्श्व ट्रंक संलयन (तारांकन नियंत्रण भ्रूण में एक पार्श्व ट्रंक संलयन के सामान्य स्थान इंगित करता है) की कमी देखी गई. कोई Dys पॉजिटिव कोशिकाओं मनाया गया, दर्शाता है कि dys शाही सेना प्रभावी ढंग से Dys प्रोटीन समाप्त कर दिया. (डी सी) के साथ या तो GFP dsRNA या dys - dsRNA दूसरा instar लार्वा tracheal दोष के लिए उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की गई. (सी) संलयन की साइटें GFP dsRNA इंजेक्शन नियंत्रण लार्वा में एक तारांकन द्वारा इंगित कर रहे हैं. (डी) पार्श्व ट्रंक dys शाही सेना इंजेक्शन लार्वा में फ्यूज करने में विफल रहा है, (*) एक पार्श्व ट्रंक संलयन के सामान्य स्थान इंगित करता है.
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Discussion
यहाँ dsRNA इंजेक्शन विधि वर्तमान ड्रोसोफिला tracheal विकास में एक जीन समारोह की एक बहुत संवेदनशील है और तेजी से विश्लेषण सक्षम बनाता है. इस विधि संभावित अन्य ऊतक और अंग के विकास के लिए जीन समारोह का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए dysfusion सीडीएनए, Dys एंटीबॉडी और w 1118 मक्खियों के लिए स्टीफन कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
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