Summary
RNA-Interferenz wurde als sehr effektiv erwiesen, um Genfunktionen in Analyse
Abstract
Genetisches Screening ist eine der leistungsstärksten Methoden zur Einblicke in komplexe biologische Prozess 1. Im Laufe der Jahre viele Verbesserungen und Werkzeuge zur genetischen Manipulation geworden in Drosophila 2 zur Verfügung. Bald nach der ersten Entdeckung von Frie-und Mello 3, dass doppelsträngige RNA verwendet werden, um knockdown die Aktivität einzelner Gene in Caenorhabditis elegans, der RNA-Interferenz (RNAi) gezeigt, dass eine leistungsstarke Reverse genetische Ansatz bieten, um Genfunktionen in Drosophila Orgel Entwicklung zu analysieren war sein 4, 5.
Viele Organe, einschließlich Lunge, Niere, Leber und Kreislauf-System sind von verzweigten röhrenförmigen Netzwerken zusammen, dass der Transport lebenswichtigen Flüssigkeiten oder Gase 6, 7. Die Analyse von Drosophila tracheale Bildung bietet ein exzellentes Modellsystem zur Morphogenese von anderen röhrenförmigen Organen 8-Studie. Die Berkeley Drosophila-Genom-Projekt hat hunderte von Genen, die in den Tracheen exprimiert werden aufgedeckt. Zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen der tube formation, ist die Herausforderung, die Rolle dieser Gene in trachealen Entwicklung zu verstehen. Hier haben wir beschrieben, eine detaillierte Methode der dsRNA-Injektion in Drosophila-Embryo den Zuschlag einzelner Gen-Expression. Wir haben erfolgreich niedergeschlagen endogenen dysfusion (Dys) Genexpression durch dsRNA Injektion. Dys ist ein bHLH-PAS-Protein in trachealen Fusion exprimiert, und es ist für die tracheale Filiale Fusion 9, 10 erforderlich. dys-RNAi vollständig eliminiert dys Ausdruck und führte in trachealen Fusion Defekt. Diese relativ einfache Methode stellt ein Werkzeug, um Gene für tissure und Organentwicklung in Drosophila requried identifizieren.
Protocol
1. Embryo-Entnahme
- Set up Käfigen bei 25 ° C mit 2-4 Tage alten w 1118 flies.Grape Saft Platten pro Stunde während des Tages verändert, um die Entnahme der Eizellen über 1-2 Tage vor der Sammlung synchronisieren
- Sammeln Embryonen für 1 Stunde bei 25 ° C
- Schneiden Sie ein rechteckiges Stück von Traubensaft Agar, leicht in der Mitte mit einer Rasierklinge geschnitten, lassen Sie eine Zeile in der Agar-
- Verwenden Sie ein Metall-Sonde Embryonen aus Traubensaft Platte Transfer zu Ihrem Stück Traubensaft Agar, Linie sie in einer geraden Linie mit dem Embryo längere Achse bei 45 Grad-Winkel auf der Linie in der Mitte des Agar. Holen Sie sich eine gerade Linie von etwa 50 Embryonen. Achten Sie darauf, alle Embryonen in die gleiche Richtung, mit hinteren Ende zeigt weg von der Linie.
- Schneiden Sie ein rechteckiges Stück Doppel-Klebeband, und legen Sie es zu einem 18x18mm Deckglas.
- Pick up Embryonen mit Doppel-Klebeband auf das Deckglas
- Legen Sie das Deckglas auf einen Objektträger, trocken der Embryo in der Luft für ca. 10 min.
- Bedecken Sie den Embryo mit einer dünnen Schicht von 700 Halocarbonöl, jetzt ist es fertig zur Injektion.
2. Pulling Needle
Machen Mikroinjektion Nadeln, indem Glaskapillaren. Wir verwenden eine Nadel puller von World Precision Instruments (Modell PUL-1). Die Nadel-Abzieher-Programm Spezifikationen sind: Wärme: 1, Delay 4.
3. Füllen des Needles
Back-Belastung Nadeln mit der Eppendorf-Pipette mit p20 Eppendorf Microloader Tipps ausgestattet, in der Regel laden 1,5-2 ul dsRNA
4. Break the Needles
- Bevor Sie das Nadel, statt einem Deckglas auf einem Objektträger.
- Bereiten Sie eine Folie mit einem Tropfen Öl in der Mitte des Schlittens
- Schalten Sie den Picospritzer III picopump, um den Luftdruck einstellen
- Break the gefüllt Nadel gegen die Kante eines Deckglases, wodurch eine scharfe Spitze.
- Wenn die Spitze gebrochen ist, Schritt auf dem Fußpedal von Picospritzer III picopump, werden einige dsRNA austreten der Nadelspitze.
- Nehmen Sie die Folie mit dem Deckglas.
- Legen Sie die Nadel unter die Öltropfen in der Mitte der Folie vorbereitet, bevor.
- Passen Sie die Einstellung auf dem Picospritzer III picopump bis 100-200PL dsRNA erhalten, wenn Sie auf das Fußpedal Schritt. dsRNA kann als kleine Tröpfchen zu sehen.
5. Injektion
- Bringen Sie die Nadelspitze auf den hinteren Teil des ersten Blastoderm Embryo in der gleichen Bildebene und spritzen den Embryo aus der Mitte rund 30-50% Ei Länge.
- Nachdem Sie auf das Fußpedal der Picospritzer III picopump Schritt wird eine kleine Menge an dsRNA als kleiner Punkt in der Injektionsstelle auftreten.
6. Phänotypische Analyse
- Nach der Injektion, legen Sie die Folie in einem überdachten feuchten Kammer (Kunststoff-Petrischale) bei 18 ° C, bis die Embryonen, um die gewünschte Embryonalstadium entwickeln.
- Verwenden Sonde Embryonen aus dem doppelseitigen Klebeband entfernen und schieben Sie sie an den Rand des Deckglases.
Waschen Sie die Embryonen aus der Folie in eine Sammlung Fläschchen mit Nylon-Mesh an der Unterseite mit Heptan, 3 x waschen mit PBT.
Dechorionate Embryonen in 50% Bleichmittel für 5 min und 3 x waschen mit PBT.
Transfer-Embryonen aus der Sammlung Fläschchen, ein Stück Nylon-Mesh, und dann tauchen die Nylon-Mesh in die Fixierlösung (5ml Heptan, 4,5 ml PBS, 0,5 ml 37% Formaldehyd) zu Embryonen freizugeben. Fix Embryonen in die Fixierlösung für 30min.
Devitellinize Embryonen mit Methanol-Embryonen zu einem Eppendorf-Röhrchen, und immunostain die Embryonen unter Verwendung von Standard-Protokollen. - Embryonen können auch geeignete Larvenstadium entwickeln.
- Bereiten Sie eine Folie mit einem Rückgang von Halocarbon 700 Öl in der Mitte
- Transfer ein Larven auf die Folie, legen ein Deckglas auf dem Gipfel
- Beachten Larven unter Hellfeld-Mikroskop.
7. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel für dsRNA knock down dysfusion (dys-) Gen in Drosophlia Embryo ist in Fig1 gezeigt. GFP-dsRNA injizierten Embryonen sind die Negativ-Kontrolle. Dys ist ein bHLH PAS Transkriptionsfaktor in trachealen Fusion exprimiert. GFP-dsRNA injizierten Embryonen zeigen normale Luftröhre Fusion und Dys Protein in Fusion-Zellen (Abbildung 1A). Auf der anderen Seite, injiziert dys-dsRNA Embryonen zeigen gescheitert Filiale Fusion und Dys-Proteine sind nicht in Fusion-Zellen (Abbildung 1B). Wenn dsRNA injizierten Embryonen zu Larvenstadium entwickeln, zeigten die dys-dsRNA injiziert Larven gescheitert Filiale Fusion (Fig.1D) im Vergleich zu GFP-dsRNA injiziert negative Kontrolle (Abbildung 1C). Diese Ergebnisse zeigten, effektive knock down der endogenen dys Genexpression durch dsRNA-Injektion in Drosophila-Embryonen
Abbildung 1. Beseitigung von Dys-Funktion durch dys-RNAi zeigt tracheale Fusion defects. Blastoderm Embryonen (w 1118) wurden entweder mit GFP-dsRNA (negative Kontrolle) oder dys-dsRNA injiziert und untersucht für Luftröhrendefekten. (A) 16. Etappe Embryo mit GFP-dsRNA injiziert und gefärbt mit α-Dys-und MAb 2A12, die Flecken der Tracheallumen. Prominent angezeigt wird die seitliche Rumpf, der hat fusioniert. Pfeile deuten auf seitliche Rumpf Dys-positive Zellen Fusion. (B) 16. Etappe Embryo mit dys-dsRNA injiziert und gefärbt mit α-Dys-und MAb 2A12. Der Embryo zeigte einen Mangel an seitlichen Kofferraum Fusion (die Sternchen zeigt die normale Lage eines lateral-Stamm Fusion unter Kontrolle Embryonen). Keine Dys-positive Zellen beobachtet, was darauf hinweist, dass die dys-RNA effektiv abgeschafft Dys-Protein. (C bis D) Second-Larvenstadium entweder mit GFP-dsRNA oder dys-dsRNA wurden von Hellfeld-Mikroskopie für Luftröhrendefekten untersucht. (C) Websites der Fusion sind mit einem Sternchen in GFP-dsRNA injiziert Kontrolle Larven angegeben. (D) Die seitliche Rumpf in der dys-RNA injiziert Larven Sicherung fehlgeschlagen ist, zeigt (*) die normale Lage eines seitlichen Kofferraum Fusion.
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Discussion
Die dsRNA Injektionsverfahren hier anwesend ermöglicht eine sehr sensible und schnelle Analyse der Genfunktion in Drosophila trachealen Entwicklung. Diese Methode kann möglicherweise angewendet Genfunktion für andere Gewebe-und Organentwicklung zu analysieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Stephen Crews für dysfusion cDNA, Dys-Antikörper und w 1118 fliegt danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
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