Summary
РНК-интерференция была доказана очень эффективно анализировать функции генов в
Abstract
Генетический скрининг является одним из самых мощных методов, доступных для получения взглянуть на сложный биологический процесс, 1. За эти годы много улучшений и инструментов для генетических манипуляций стали доступны у дрозофилы 2. Вскоре после первоначального открытия Фри и Мелло 3 видно, что двухцепочечной РНК могут быть использованы для нокдаун активности отдельных генов в Caenorhabditis Элеганс, РНК-интерференция (RNAi) было показано, что обеспечивает мощный обратный генетический подход к анализу функций генов в развитии дрозофилы орган 4, 5.
Многие органы, в том числе легких, почек, печени, сосудистой системы, состоят из трубчатых разветвленных сетей, транспорта жизненно важные жидкости или газы, 6, 7. Анализ дрозофилы трахеи образование обеспечивает отличную модель системы для изучения морфогенеза других трубчатых органов 8. Беркли дрозофилы генома проекта выявил сотни генов, которые выражаются в трахеи системы. Для изучения молекулярных и клеточных механизмов трубки образования, задача состоит в том, чтобы понять роль этих генов в развитии трахеи. Здесь мы описали подробный метод дсРНК инъекции в эмбрион дрозофилы нокдаун отдельных экспрессии генов. Мы успешно сбил эндогенных dysfusion (дисфункции) экспрессии генов с помощью инъекции дсРНК. Дисфункции является bHLH-PAS белка выражается в клетках трахеи синтеза, а это необходимо для трахеи филиала слияние 9, 10. дисфункции RNAi полностью устранить дисфункции выражение и в результате трахеи дефект синтеза. Этот сравнительно простой метод обеспечивает инструментом для выявления генов requried для tissure и развития органов у дрозофилы.
Protocol
1. Эмбрион коллекции
- Настройка клетки при 25 ° С с использованием 2-4 дневных ш 1118 пластин сок flies.Grape меняются каждый час в течение суток для синхронизации сбора яиц в течение 1-2 дней до сбора
- Сбор эмбрионов в 1 час при 25 ° С
- Отрежьте прямоугольный кусок виноградного сока агар, вырезать слегка в середине с лезвием, оставьте строку в агар
- Используйте металлический зонд для передачи эмбрионов из виноградного сока пластины Вашей части виноградного сока агар, выстроить их в прямой линии с длинной оси эмбриона на 45 градусов к линии в середине агара. Получите прямой около 50 эмбрионов. Убедитесь, что все эмбрионы указывают в одном направлении, с задним концом направлен от линии.
- Отрежьте прямоугольный кусок двойной ленты палки, и поместить его в 18x18mm скольжения покрытия.
- Возьмите эмбрионов с двойной ленты палки на покровное стекло
- Место покровным стеклом, чтобы стекло, сухие эмбриона в воздухе около 10 мин.
- Обложка эмбриона с тонким слоем масла Хладон 700, сейчас он готов для инъекции.
2. Тяговая иглы
Сделать микроинъекции иглы, потянув стеклянные капилляры. Мы используем иглы съемник от Всемирного точный инструмент (модель ПУЛ-1). Иглы спецификации съемник программы являются: тепло: 1, задержка 4.
3. Заполнение иглы
Вернуться нагрузки иглы использованием Eppendorf p20 пипетки оснащены Эппендорф советы Microloader, как правило, нагрузка 1.5-2 мкл дсРНК
4. Перерыв иглы
- Перед тем как игла, место покровное на слайде.
- Подготовка слайдов с каплей масла в середине слайда
- Включите Picospritzer III picopump для регулировки давления воздуха
- Перерыв заполнен иглу к краю покровным стеклом, создавая острие.
- Когда кончик сломан, шаг на педали из Picospritzer III picopump, некоторые дсРНК будет вытекать из иглы.
- Выньте слайд с покровным.
- Введите иглу под жировая капля в середине слайд подготовлена раньше.
- Отрегулируйте настройку Picospritzer III picopump, чтобы получить 100-200pl дсРНК когда вы выходите на педали. дсРНК можно рассматривать как небольшой капли.
5. Инъекция
- Принесите иглы к задней части первого эмбриона бластодерма в ту же фокальной плоскости и ввести эмбрион от центра около 30-50% длины яйца.
- После того как вы шаг на педали из Picospritzer III picopump, небольшое количество дсРНК будет выглядеть как маленькая точка в месте инъекции.
6. Фенотипический анализ
- После инъекции место вставляются покрыты влажной камере (пластиковые чашки Петри) при 18 ° С до эмбрионы развиваются до желаемого зачаточном состоянии.
- Используйте зонд, чтобы удалить из эмбрионов двусторонний скотч и подтолкнуть их к краю крышки скольжения.
Вымойте эмбрионов за пределы слайда в коллекции флакон с нейлоновая сетка на дне использованием гептан, промыть 3 раза PBT.
Dechorionate эмбрионов в 50% отбеливателя в течение 5 минут, и промыть 3 раза PBT.
Трансфер эмбрионов из коллекции флакон на кусок нейлоновой сетки, а затем падение нейлоновая сетка в фиксирующий раствор (5 мл гептана, 4,5 мл PBS, 0,5 мл 37% формальдегида), чтобы освободить эмбрионов. Fix эмбрионов в фиксирующий раствор в течение 30 минут.
Devitellinize эмбрионов с метанолом, трансфер эмбрионов трубки Эппендорф, и immunostain эмбрионов с использованием стандартных протоколов. - Эмбрионы могут также разработать соответствующие личиночной стадии.
- Подготовка слайдов с каплей масла хладон 700 в середине
- Передача один личинок на слайд, положить покровное стекло на верхнем
- Соблюдайте личинки при ярком поле микроскопа.
7. Представитель Результаты:
Примером дсРНК сбить dysfusion (дисфункции) генов в эмбрион Drosophlia показан на Рис1. GFP-дсРНК вводят эмбрионы отрицательного контроля. Дисфункции является транскрипцией bHLH PAS фактор выражается в клетках трахеи синтеза. GFP-дсРНК вводят эмбрионы демонстрируют нормальное трахеи синтеза, а DYS белок присутствует в области термоядерного синтеза клетками (рис. 1А). С другой стороны, дисфункции дсРНК вводят эмбрионы не удалось показать филиала синтеза, а DYS белки нет в слиянии клетки (рис. 1В). Когда дсРНК вводят эмбрионы развиваются до личиночной стадии, дисфункции дсРНК вводят личинок показали удалось филиала синтеза (Fig.1D) по сравнению с GFP-дсРНК вводят отрицательного контроля (рис. 1в). Эти результаты показали, эффективное сбить эндогенной экспрессии генов дисфункции по дсРНК инъекции в эмбрионы дрозофилы
Рисунок 1. Удаление дисфункции функции дисфункции RNAi показывает, трахеи слияние гвидеоэффекты. Бластодерма эмбрионов (W 1118) вводили либо GFP-дсРНК (отрицательный контроль) или дисфункцией дсРНК и анализировали на трахеи дефектов. () Этап 16 эмбрион вводят GFP-дсРНК и окрашивали α-DYS и МАБ 2A12, что пятна трахеи просвет. Заметно показан боковой ствол, который расплавился. Стрелки указывают на боковой ствол DYS-положительных клеток синтеза. (В) Этап 16 эмбриона вводят дисфункции дсРНК и окрашивали α-DYS и МАБ 2A12. Эмбрионов показало отсутствие бокового ствола слияния (звездочка означает нормальное расположение бокового ствола синтеза в контрольных эмбрионов). Нет DYS-положительных клеток наблюдалось, что свидетельствует о дисфункции РНК по сути упразднил DYS белка. (От С до D) второго возраста личинки либо с GFP-дсРНК или дисфункции дсРНК были рассмотрены светлого поля микроскопию для трахеи дефектов. (C) Сайты плавления обозначены звездочкой в GFP-дсРНК вводят контроль личинок. (D) бокового ствола не удалось соединить в дис-РНК вводили личинки, (*) указывает нормальное расположение боковых слияние ствола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод дсРНК инъекции присутствует здесь дает очень чувствительный и быстрый анализ функций генов дрозофилы трахеи развития. Этот метод потенциально может быть применена для анализа функции гена и для других тканей и органов развитии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Стивена Экипажи для dysfusion кДНК, DYS антител и W 1118 мух.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | |
| Picospritzer III picopump | Parker Hannifin Corporation | 051-0500-900 | |
| Micro-pipettes | Fisher Scientific | 21170M | |
| Microloaders | Eppendorf | 930001007 |
References
- St Johnston, D., Nusslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-219 (1992).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Emerging technologies for gene manipulation in Drosophila melanogaster. Nat. Rev. Genet. 6, 167-178 (2005).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Misquitta, L., Paterson, B. M. Targeted disruption of gene function in Drosophila by RNA interference (RNA-i): a role for nautilus in embryonic somatic muscle formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 1451-1456 (1999).
- Horowitz, A., Simons, M. Branching morphogenesis. Circ. Res. 103, 784-795 (2008).
- Hogan, B. L., Kolodziej, P. A. Organogenesis: molecular mechanisms of tubulogenesis. Nat. Rev. Genet. 3, 513-523 (2002).
- Ghabrial, A., Luschnig, S., Metzstein, M. M., Krasnow, M. A. Branching morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 19, 623-647 (2003).
- Jiang, L., Crews, S. T. Dysfusion transcriptional control of Drosophila tracheal migration, adhesion, and fusion. Mol. Cell. Biol. 26, 6547-6556 (2006).
- Jiang, L., Crews, S. T. The Drosophila dysfusion basic helix-loop-helix (bHLH)-PAS gene controls tracheal fusion and levels of the trachealess bHLH-PAS protein. Mol. Cell. Biol. 23, 5625-5637 (2003).
