Summary
この記事では、8ウェルチャンバースライドの中で成長細菌バイオフィルムの形成と可視化のための手順を説明します
Abstract
多くの疾患の慢性的な性質は、従来の抗生物質治療に反抗的な細菌バイオフィルムの形成に起因する。バイオフィルムは、表面に付着すると、マトリックスで包まれ、コミュニティ、関連する細菌である。細胞外マトリックスの役割は、栄養買収を促進を含め、多面的であり、環境ストレス（例えば、宿主の免疫応答）に対する有意な保護を提供しています。バイオフィルム内の細菌は、我々は8ウェルチャンバースライドに形成されている細菌のバイオフィルムを視覚特徴プロトコルを使用した環境ストレスに応答する方法として理解をさらに深めようとする努力で。バイオフィルムは、LIVE / DEAD染色BacLightで染色し、様々な培養条件下での相対的なバイオフィルムのサイズ、および構造を特徴づけるために共焦点顕微鏡を用いて検討した。 Z -スタックのイメージは、共焦点顕微鏡を介して収集し、犯罪統計システムにより分析した。このプロトコルは、バイオフィルムが形成されるメカニズムと動態の解明に役立つだけでなく、バイオフィルムの構造と安定にとって重要なコンポーネントを識別するために使用することができます。
Protocol
（1） 体外バイオフィルム形成における
- 細菌のコロニーは、（一晩、適切な寒天上に成長されている）、メディアに懸濁し、OD 490は 0.65に調整した
- その結果細菌懸濁液は、その後1時06（1 mLの細菌懸濁液+ 5 mLを予め温めておいた培地）に希釈し、℃で約3時間、5％CO 2で中期対数増殖期に到達するために37℃でインキュベートした。
- 8ウェルチャンバースライドの各ウェルに予め温めておいたメディアと場所希釈液200μLと中期対数増殖サスペンション1:2500に希釈する。
- 37℃5％CO 2をインキュベートする。
- 約16時間後に、それぞれの室の隅から吸引培地および200μLの新鮮、予め温めておいた培地に追加 - バイオフィルムを破壊する可能性がありますチャンバー内部のせん断力を作成しないようにチャンバーの壁に沿ってディスペンスを。
- 長い24時間以上インキュベートした場合、培地ごとに12時間を変更するか、または細菌の生存性を維持するために必要。
2。バイオフィルムの可視化
- 上記のように、各チャンバーから培地を吸引し、滅菌生理食塩水で二回軽く常駐バイオフィルムを洗浄する。
- 各ウェルにBacLight LIVE / DEAD染色（3μL成分の生理食塩水mL当たり+ 3μL成分B）200μLを加え、15分間室温でインキュベートする。この時点以降からの光からの文化を守る。
- 汚れを吸引し、以前と同様に滅菌生理食塩水で軽く2回洗浄する。
- 各ウェルに緩衝ホルマリン中性の200μlを加え、試料を固定するために室温で30分間インキュベートする。
- 固定液削除し、適切に制度的なガイドラインに準拠して処分する。
- 生理食塩水で2回洗浄し、上記のようにホルマリンが含まれる洗浄流体を処分。
- スライドからプラスチック製の井戸を削除、カバースリップがガスケットに配置されている場合、に気泡が存在しないこともそのそれぞれに十分な生理食塩水に追加します。
- 封入剤とカバーガラスのカバースリップとシールの縁。マニキュアは、しかし、スライドが永久にできなくなるスライドを密封するために使用することができます。
- シーラントは、顕微鏡を介して調べる前に約1時間乾燥することができます。
3。結果
図1 8ウェルチャンバースライドで形成されたバイオフィルムの代表的な3D合成画像。細菌は、緑と死菌が赤色蛍光を発する蛍光を発するデッド/ライブ染色ここで生菌で標識した。塔と水路で異なるアーキテクチャを示す全体のバイオフィルムの（A）合成画像。 （B）（）内と同じバイオフィルム、今の断面に見られる。
Discussion
バイオフィルムが形成されるメカニズム、ならびにそれらのマトリックス成分の特性などを、理解することは、強い関心の領域です。このプロトコルは、治療への応用に彼ら自身を貸すことができるタンパク質または特定するバイオフィルムの構造的完全性に寄与するだけでなく、役立つ他の成分と標的タンパク質を識別しやすくするために使用することができます。
上述のプロトコールのインキュベーションの時間および希釈液を分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHI）で最適なバイオフィルム形成のために確立されている。いくつかの予備的作業は、他の細菌種（ すなわち、初期希釈し、中期対数増殖期を達成するために必要なインキュベーション時間）のためのこれらのステップを最適化するために必要な場合があります。チャンバーの初期シードのための1:2500希釈は、堅牢なバイオフィルムは、チャンバー内で開発することを保証するために設立され、この微生物によって誘導され、インキュベーション時間内にチャンバおよび/または利用可能な栄養素を消耗してovergrowingバイオフィルムなしで、述べてスライド。したがって、初期希釈したり、インキュベーション時間は、他の細菌種のために調整する必要があります。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
作業は、LO BakaletzにNIDCD / NIH R01DC003915によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
