Summary
توضح هذه المقالة إجراءات لتشكيل والتصور لبيوفيلم البكتيريا نما داخل الشريحة الغرفة 8 جيد
Abstract
ويعزى لطبيعة كثير من الأمراض المزمنة إلى تشكيل الأغشية الحيوية البكتيرية التي المعاند للعلاج بالمضادات الحيوية التقليدية. الأغشية الحيوية والمجتمع المرتبطة البكتيريا تعلق على السطح والمغطى في المصفوفة. دور المصفوفة خارج الخلية متعددة الأوجه ، بما في ذلك تسهيل الحصول على المواد الغذائية ، ويوفر حماية كبيرة ضد الضغوط البيئية (مثل المضيف الاستجابات المناعية). في محاولة لاكتساب فهم أفضل لكيفية البكتيريا داخل بيوفيلم الاستجابة للضغوط البيئية التي استخدمناها بروتوكولا حيث تصور لنا الأغشية الحيوية البكتيرية التي شكلت في الشريحة الغرفة 8 أيضا. تم صبغ والأغشية الحيوية مع BacLight لايف / الميت وصمة عار وفحصت باستخدام المجهر مبائر لتوصيف حجم بيوفيلم النسبية ، وهيكل تحت ظروف مختلفة الحضانة. جمعت Z - المكدس الصور عن طريق المجهر وتحليلها بواسطة مبائر COMSTAT. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للمساعدة في توضيح آلية وحركية الذي شكل الأغشية الحيوية ، وكذلك تحديد المكونات التي تعتبر هامة لهيكل بيوفيلم والاستقرار.
Protocol
1. في تشكيل بيوفيلم المختبر
- علقت المستعمرات البكتيرية (التي كانت تزرع على أجار المناسبة بين عشية وضحاها) ، في وسائل الإعلام وعدل OD 490-،65
- ثم تم تخفيفه تعليق الجرثومية الناتجة 01:06 (1 مل تعليق البكتيرية + 5 مل قبل حرارة متوسطة) وحضنت في 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 لحوالي 3 ساعات للوصول إلى مرحلة منتصف السجل.
- تمييع تعليق النمو منتصف سجل 1:2500 مع تحسنت وسائل الاعلام قبل ومكان 200 ميكرولتر من التخفيف في كل بئر من الشريحة 8 الغرفة جيدا.
- احتضان عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2.
- بعد حوالي 16 ساعة والمتوسطة نضح من ركلة ركنية من كل غرفة وإضافة 200 ميكرولتر العذبة ، وقبل حرارة متوسطة -- على طول جدار الاستغناء الغرفة حتى لا تخلق قوى القص داخل الغرفة التي يمكن أن تعطل بيوفيلم.
- إذا احتضان أكثر من 24 ساعة ، وتغير متوسط ساعات كل 12 أو حسب الحاجة للمحافظة على سلامة البكتيريا.
2. تصور بيوفيلم
- نضح المتوسطة من كل غرفة ، على النحو الموصوف أعلاه ، ويغسل بيوفيلم المقيمين بلطف مرتين مع المياه المالحة عقيمة.
- إضافة 200 ميكرولتر لايف / الميت وصمة عار BacLight (العنصر 3 ميكرولتر A + B 3 لكل عنصر ميكرولتر مليلتر من المياه المالحة) إلى كل بئر ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. حماية الثقافة من الضوء من هذه النقطة فصاعدا.
- نضح وصمة عار ، ويغسل مرتين بلطف مع المالحة عقيمة كما كان من قبل.
- إضافة 200 ميكرولتر من الفورمالين محايدة مخزنة على كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح العينة.
- إزالة تثبيتي ، والتصرف بشكل صحيح وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
- تغسل مرتين مع المياه المالحة والتخلص من السوائل التي تحتوي على غسل الفورمالين على النحو الوارد أعلاه.
- إزالة الآبار من الشريحة البلاستيكية ، إضافة إلى ما يكفي من المياه المالحة كل ذلك جيدا انه عندما يتم وضع ساترة على وحشية ، لا فقاعات الهواء موجودة.
- ساترة وختم حواف مع ساترة المتوسطة المتزايدة. ويمكن استخدام طلاء الأظافر لختم الشرائح غير الشرائح لن تكون دائمة.
- السماح للتسرب لتجف لمدة ساعة قبل ما يقرب من 1 إلى دراسة عبر المجهر.
3. النتائج
الشكل 1. الممثل 3D صور مركبة لتشكيل بيوفيلم في الشريحة 8 الغرفة جيدا. وصفت فيها البكتيريا مع البكتيريا لايف / الميت يعيش وصمة عار يتألق البكتيريا الخضراء والحمراء يتألق القتلى. (أ) صورة مركبة تظهر من بيوفيلم كامل بنية متميزة مع الأبراج وقنوات المياه. (ب) في نفس بيوفيلم (A) ، وينظر الآن في المقطع العرضي.
Discussion
فهم الآلية التي شكل الأغشية الحيوية ، فضلا عن المكونات التي تميز بها المصفوفة ، وهي منطقة شديدة الأهمية. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للمساعدة في تحديد البروتينات أو المكونات الأخرى التي تساهم في السلامة الهيكلية للبيوفيلم ، فضلا عن المساعدة في تحديد واستهداف البروتينات التي قد تصلح لتطبيق العلاجية.
وقد تم تأسيس حضانة مرات والتخفيفات في البروتوكول الموصوفة أعلاه المثلى لتشكيل بيوفيلم التي nontypeable المستدمية النزلية (NTHI). قد تكون هناك حاجة إلى بعض الأعمال التمهيدية لتحسين هذه الخطوات بالنسبة للأنواع البكتيريا الأخرى (أي تخفيف الأولي وفترة حضانة اللازمة لتحقيق منتصف سجل النمو التدريجي). وقد تم تأسيسها في تخفيف 1:2500 لبذر الأولي للدوائر لضمان أن بيوفيلم قوية من شأنها تطوير الشرائح في الغرفة التي يسببها حسب هذا الكائن وداخل الحضانة وذكرت مرات ، من دون بيوفيلم overgrowing غرفة و / أو استنفاد المواد المغذية المتوفرة . وبالتالي يجوز التخفيف الأولية والحضانة أو أوقات الحاجة الى تعديلها لأنواع البكتيريا الأخرى.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل العمل من قبل NIDCD / NIH R01DC003915 لBakaletz LO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
