Summary
מאמר זה מתאר את הליך הקמת ויזואליזציה של biofilm חיידקי גדל בתוך שקופית 8-גם תא
Abstract
האופי הכרוני של מחלות רבות מיוחסת היווצרות של biofilms חיידקי אשר הסרבן כדי טיפול אנטיביוטי מסורתי. Biofilms הם הקהילה הקשורים חיידקים מצורף משטח ו עטוף מטריצה. תפקידה של המטריצה תאיים הוא רב פנים, כולל הקלת רכישת מזין, מציעה הגנה משמעותית נגד לחצים סביבתיים (למשל, התגובות מארח החיסונית). במאמץ להשיג הבנה טובה יותר באשר לאופן החיידקים בתוך biofilm להגיב מדגיש הסביבה השתמשנו פרוטוקול שבו אנו לחזות biofilms חיידקים אשר נוצרו בשקופית 8-היטב קאמרית. Biofilms הוכתמו BacLight Live / Dead כתם ובדק באמצעות מיקרוסקופ confocal כדי לאפיין את גודל biofilm יחסית, ומבנה תחת תנאים משתנים הדגירה. Z-מחסנית תמונות נאספו באמצעות מיקרוסקופיה confocal ונותחו על ידי סטטמ"מ. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לעזור להבהיר את מנגנון קינטיקה על ידי היוצרים biofilms, כמו גם לזהות את המרכיבים שחשובים מבנה biofilm ויציבות.
Protocol
1. כינונה biofilm חוץ גופית
- מושבות חיידקים (אשר כבר גדל על אגר המתאים לילה), הושעו בתקשורת ואת OD 490 הותאם 0.65
- המתלים חיידקים וכתוצאה מכך היה מדולל אז 01:06 (1 ההשעיה מ"ל חיידקי + 5 מ"ל מראש חימם בינוני) ו מודגרות ב 37 ° C עם 5% CO 2 למשך כ 3 שעות כדי להגיע יומן באמצע השלב.
- לדלל את יומן אמצע ההשעיה 1:2500 עם צמיחה מחומם מראש מדיה מקום 200 μL של דילול לבאר כל שקופית 8-היטב קאמרית.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- לאחר כ 16 שעות, בינוני לשאוב מהפינה של החדר כל ולהוסיף 200 μL טרי, מחומם מראש בינוני - לוותר לאורך הקיר של החדר כדי לא ליצור כוחות גזירה בתוך החדר אשר יכול לשבש את biofilm.
- אם דוגרים יותר מ 24 שעות, שנה בינונית כל 12 שעות או לפי הצורך כדי לשמור על יכולת הקיום חיידקי.
2. ויזואליזציה של biofilm
- לשאוב בינוני מתא אחד, כמתואר לעיל, ולשטוף biofilm תושב פעמיים בעדינות עם מלח סטרילית.
- הוספת 200 μL של (רכיב 3 μL + 3 B מרכיב μL לכל מ"ל של תמיסת מלח) BacLight Live / Dead כתם זה היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הגן על תרבות מן האור מנקודה זו ואילך.
- לשאוב את הכתם ולשטוף פעמיים בעדינות עם תמיסת מלח סטרילית כמו קודם.
- הוספת 200 μL של נייטרלי שנאגרו פורמלין זה היטב דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את הדגימה.
- הסר מקבע כהלכה להיפטר בהתאם להנחיות מוסדיים.
- שטפו פעמיים עם מי מלח ועושה את הנוזלים לשטוף המכילים פורמלין לעיל.
- הסר את בארות פלסטיק משקופית, מוסיפים מלח מספיק זה גם כך שכאשר coverslip מושם על אטם, אין בועות אוויר נוכחים.
- Coverslip וסוגרים את הקצוות של coverslip עם הרכבה בינונית. לק ניתן להשתמש כדי לאטום את שקופיות שקופיות עם זאת לא יהיה כפי קבע.
- אפשר איטום להתייבש במשך שעה בערך 1 לפני בחינת דרך מיקרוסקופ.
3. תוצאות
באיור 1. הנציג תמונות מרוכבים 3D של biofilm נוצר שקופית 8-היטב קאמרית. חיידקים תויגו עם כתם חיידקים חי / מת לחיות שבה לזרוח חיידקים ירוקים מת לזרוח אדום. (א) התמונה של Composite biofilm כל הארכיטקטורה נפרדות עם מגדלים ותעלות מים. (ב) biofilm זהה (A), ראיתי עכשיו ב חתך.
Discussion
הבנת המנגנון שבאמצעותו biofilms הטופס, כמו גם באפיון רכיבי המטריצה שלהם, הוא תחום עניין רב. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות חלבונים או מרכיבים אחרים שתורמים שלמות מבנית של biofilm, וכן לסייע בזיהוי יעד חלבונים אשר עשויים להשאיל את עצמם ביישום הטיפולי.
פעמים הדגירה ו דילולים בפרוטוקול לעיל הוקמו ליצירת biofilm אופטימלי על ידי nontypeable Haemophilus influenzae (NTHI). עבודה חלק ראשוני עשוי להיות נחוץ כדי לייעל את הפעולות הבאות עבור מינים חיידקים אחרים (דילול ראשוני כלומר זמן הדגירה הדרושה להשגת שלב אמצע יומן צמיחה). דילול 1:2500 עבור זריעת הראשונית של התאים הוקמה על מנת להבטיח כי biofilm חזקים יפתחו בחדר שקופיות הנגרמת על ידי אורגניזם הזה ובתוך פעמים הדגירה כאמור, ללא biofilm overgrowing החדר ו / או מתיש מזינים זמין . לפיכך, דילול ראשוני או פעמים הדגירה ייתכן שיהיה צורך מותאם זן חיידקים אחרים.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
העבודה מומן על ידי NIDCD / NIH R01DC003915 אל LO Bakaletz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
