Summary
Este artigo descreve o procedimento para a formação e visualização de um biofilme bacteriano cresceu dentro de uma câmara de corrediça de 8 poços
Abstract
A natureza crônica de muitas doenças é atribuído à formação de biofilme bacteriano que são recalcitrantes ao tratamento com antibióticos tradicionais. Biofilmes são comunidades associadas bactérias ligado a uma superfície e envolto em uma matriz. O papel da matriz extracelular é multifacetado, incluindo a facilitação de aquisição de nutrientes, e oferece proteção significativa contra estresses ambientais (por exemplo, respostas imune do hospedeiro). Em um esforço para adquirir uma melhor compreensão de como as bactérias dentro de um biofilme responder às pressões ambientais que temos utilizado um protocolo em que nós visualizamos biofilme bacteriano que se formaram em um slide de câmara de 8 poços. Os biofilmes foram coradas com o BacLight Live / Morto mancha e examinadas com um microscópio confocal para caracterizar o tamanho relativo do biofilme, e estrutura sob diferentes condições de incubação. Z-stack imagens foram coletados por meio de microscopia confocal e analisados por COMSTAT. Este protocolo pode ser usado para ajudar a elucidar o mecanismo e cinética por que formam biofilmes, bem como identificar os componentes que são importantes para a estrutura do biofilme e estabilidade.
Protocol
1. In Vitro formação de biofilme
- Colônias de bactérias (que foram cultivadas em ágar apropriado durante a noite), foram suspensas em mídia e do OD 490 foi ajustado para 0,65
- A suspensão resultante bacteriana foi então diluída 1:06 (1 mL de suspensão bacteriana + 5 mL de médio pré-aquecido) e incubados a 37 ° C com 5% de CO 2 por aproximadamente 3 horas para chegar log-mid fase.
- Diluir o log-mid 1:2.500 suspensão crescimento com pré-aquecido media e colocar 200 mL da diluição em cada poço de uma câmara de corrediça 8-bem.
- Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Após aproximadamente 16 horas, médio aspirado de canto de cada câmara e adicionar 200 mL fresco, médio pré-aquecido - dispensar ao longo da parede da câmara de modo a não criar uma força de cisalhamento dentro da câmara, que poderia interromper o biofilme.
- Se incubar mais de 24 horas, a mudança média a cada 12 horas ou conforme necessário para manter a viabilidade bacteriana.
2. Visualização de biofilme
- Aspirar médio de cada câmara, como descrito acima, e lavar biofilme residente duas vezes delicadamente com soro fisiológico estéril.
- Adicionar 200 mL de BacLight Live / Morto mancha (3 mL componente A + 3 B componente mL por mL de solução salina) para cada poço e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Proteger a cultura da luz a partir deste ponto em diante.
- Aspirar a mancha e lave delicadamente duas vezes com solução salina estéril como antes.
- Adicionar 200 mL de formalina tamponada neutra a cada poço e incubar por 30 minutos em temperatura ambiente para corrigir espécime.
- Remover fixador e descartar corretamente de acordo com as diretrizes institucionais.
- Lavar duas vezes com solução salina e descarte dos fluidos de lavagem que contêm formol como acima.
- Remove os poços de plástico do slide, adicionar bastante soro fisiológico para cada poço de modo que quando uma lamela é colocado sobre a junta, sem bolhas de ar estão presentes.
- Lamínula e vedação das bordas da lamínula com meio de montagem. Unha polonês pode ser usado para selar o slides no entanto os slides não será tão permanente.
- Permitir que o selante para secar por aproximadamente 1 hora antes do exame através de microscopia.
3. Resultados
Figura 1. Representante 3D imagens compostas de um biofilme formado em um slide de câmara de 8 poços. As bactérias foram rotulados com o Live / Dead mancha onde vivem bactérias fluorescentes e bactérias verdes mortos fluorescência vermelha. (A) Imagem composta de biofilme inteiro mostrando a arquitetura distinta, com torres e canais de água. (B) O mesmo que no biofilme (A), agora visto na seção transversal.
Discussion
Compreensão do mecanismo pelo qual os biofilmes formulário, bem como caracterizar seus componentes de matriz, é uma área de intenso interesse. Este protocolo pode ser usado para ajudar a identificar proteínas ou outros componentes que contribuem para a integridade estrutural do biofilme, bem como ajudar a identificar e alvo proteínas que podem se prestam a uma aplicação terapêutica.
Os tempos de incubação e diluições no protocolo acima descrito foram estabelecidas para a formação de biofilme ideal por Haemophilus influenzae não tipáveis (NTHi). Algum trabalho preliminar pode ser necessária para otimizar estes passos para outras espécies de bactérias (ou seja, diluição inicial e tempo de incubação necessário para atingir meados de log fase de crescimento). A diluição 1:2.500 para a semeadura inicial das câmaras foi estabelecido para assegurar que um biofilme robusta iria desenvolver na câmara de slides como induzido por este organismo e dentro do período de incubação afirmou, sem o biofilme overgrowing da câmara e / ou esgotar nutrientes disponíveis . Assim, a diluição inicial e tempos de incubação, ou podem precisar de ser ajustado para outras espécies de bactérias.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O trabalho foi financiado pela NIDCD / NIH R01DC003915 a LO Bakaletz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
