Summary
В этой статье описывается порядок формирования и визуализации бактериальной биопленки выросли в 8-и камера слайд
Abstract
Хронический характер многих заболеваний связано с образованием бактериальной биопленки, которые непокорных к традиционной антибактериальной терапии. Биопленки общин связанных с ними бактерий прилагается к поверхности и помещены в матрицу. Роль внеклеточного матрикса многогранен, включая содействие питательных приобретения, а также предлагает существенную защиту от стрессов окружающей среды (например, иммунной реакции). В стремлении приобрести лучшее понимание того, как бактерии в биопленки реагировать на экологические стрессы мы использовали протокол котором мы представляем бактериальных биопленок, которые формируются в 8-и камер слайда. Биопленки окрашивали BacLight Live / Мертвое пятно и изучены с помощью конфокальной микроскопии для характеристики относительного размера биопленки и структуры при различных условиях инкубации. Z-Stack изображения были собраны с помощью конфокальной микроскопии и проанализированы КОМСТАТ. Этот протокол может быть использован для выяснения механизма и кинетики которым биопленки форме, а также определить компоненты, которые являются важными для структуры биопленки и стабильности.
Protocol
1. В формировании биопленки Vitro
- Бактериальные колонии (которые были выращены на соответствующие агар на ночь), были приостановлены в средствах массовой информации и OD 490 доводили до 0,65
- В результате бактериальной суспензии разбавляют 1:6 (1 мл бактериальной суспензии + 5 мл подогретого среды) и инкубировали при 37 ° C с 5% CO 2 примерно на 3 часа, чтобы достичь середины логарифмической фазы.
- Развести середине журнала роста подвески 1:2500 с подогретого СМИ и месте 200 мкл в каждую лунку 8-а камера слайд.
- Инкубировать при 37 ° C с 5% CO 2.
- Примерно через 16 часов, аспирация среды от углу каждой камеры и добавить 200 мкл свежей, подогретого средне - обойтись вдоль стены камеры, чтобы не создавать силы сдвига в камеру, которая может нарушить биопленки.
- Если инкубацию более 24 часов, изменение среды каждые 12 часов или по мере необходимости для поддержания жизнеспособности бактериальных.
2. Визуализация биопленки
- Аспирируйте среды от каждой камеры, как описано выше, и мыть резидент биопленки дважды мягко стерильным физиологическим раствором.
- Добавить 200 мкл BacLight Live / Мертвое пятно (3 мкл компонент + 3 мкл B компонент на мл физиологического раствора) в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут. Защитить культуру от света от этого момента.
- Аспирируйте пятна и мыть дважды мягко стерильным физиологическим раствором, как раньше.
- Добавить 200 мкл нейтральных буферный формалин в каждую лунку и инкубировать 30 минут при комнатной температуре, чтобы исправить образца.
- Удалить фиксатор и правильно распоряжаться в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
- Промыть два раза физиологическим раствором и распоряжаться мыть жидкостями, содержащими формалин, что и выше.
- Удалите пластиковую скважин слайдов, добавить достаточно соленый в каждую лунку так, что когда покровное делается на прокладку, без воздушных пузырьков присутствуют.
- Покровное и печатью края покровного стекла с монтажной средой. Лак для ногтей может быть использована для уплотнения слайды однако слайды не будут постоянными.
- Разрешить герметик высохнуть в течение примерно 1 час до рассмотрения по микроскопии.
3. Результаты
Рисунок 1. Представителю 3D композитные изображения биопленки образуются в 8-и камер слайда. Бактерии были помечены Live / Мертвое пятно которой живые бактерии светиться зеленым и мертвые бактерии светиться красным цветом. () Композитный образы всего биопленки показывающие различные архитектуры с башнями и водных каналов. (Б) То же, биопленки, как в (А), в настоящее время рассматривается в поперечном сечении.
Discussion
Понимание механизма, посредством которого биопленки форме, а также характеризующие их компонентов матрицы, в районе интенсивных интерес. Этот протокол может быть использован для выявления белков или других компонентов, которые способствуют структурной целостности биопленки, а также помогает выявлять и целевых белков, которые могут поддаются терапевтического применения.
Времени инкубации и разведения в описанных выше протоколов были созданы для оптимального образование биопленки на nontypeable гемофильной инфекции (NTHI). Некоторые предварительные работы могут быть необходимы для оптимизации эти действия для других видов бактерий (то есть начального разбавления и времени инкубации, необходимых для достижения середины логарифмической фазы роста). 1:2500 разбавления для первоначального посева камеры была создана с целью обеспечить надежную биопленки будет развиваться в камере слайдов, индуцированные этим организмом и в течение инкубационного раз заявлял, без биопленки зарастания камеры и / или истощения доступных питательных веществ . Соответственно, начального разбавления и времени инкубации или, возможно, должны быть скорректированы для других видов бактерий.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа финансировалась NIDCD / NIH R01DC003915 к LO Bakaletz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
