Summary
Bu makalede, 8 kuyu odasına slayt içinde yetişen bir bakteriyel biyofilm oluşumu ve görselleştirme için prosedürü anlatılmaktadır.
Abstract
Birçok hastalığın kronik doğası, geleneksel antibiyotik tedavisi inatçı bakteriyel biyofilm oluşumu atfedilir. Biyofilmler bir yüzeye bağlı bir matris kaplı toplum ilişkili bakteriler. Ekstrasellüler matriks rol besin satın alma kolaylaştırılması da dahil olmak üzere, çok yönlü ve çevresel streslere karşı (örneğin, ana immün yanıtları) önemli bir koruma sağlar. Bir biyofilm içinde bakteri, biz iyi bir 8-odasının slayt oluşan bakteriyel biyofilm görselleştirmek neyin biz bir protokol kullanılır çevresel strese nasıl cevap olarak daha iyi bir anlayış elde etmek için bir çaba içinde. Biyofilm / Canlı leke Ölü BacLight ile boyandı ve göreli biyofilm boyutu ve yapısı değişen kuluçka koşulları altında karakterize etmek için bir konfokal mikroskop kullanılarak incelendi. Z-yığını görüntüler konfokal mikroskopi üzerinden toplanan ve COMSTAT analiz edildi. Bu protokol mekanizması ve kinetiği biyofilm formu yanı sıra, biyofilm yapısı ve istikrarı için önemli olan bileşenleri tanımlamak açıklamaya yardımcı olmak için kullanılabilir.
Protocol
1 Vitro Biyofilm Oluşumu
- Bakteri kolonileri (geceleme uygun agar yetiştirilen olduğunuz), medya askıya alındı ve 490 OD 0.65 'ye kadar ayarlanabilir
- Sonucunda bakteriyel süspansiyon sonra 01:06 (1 ml bakteriyel süspansiyon + 5 ml önceden ısıtılmış orta) seyreltilir ve 37 ° C, yaklaşık 3 saat boyunca% 5 CO 2 ile orta-log fazı ulaşmak için inkübe edildi .
- 8-iyi bir oda slayt her kuyuya, önceden ısıtılmış medya ve yer seyreltme 200 mcL orta-log büyüme süspansiyon 1:2500 sulandırınız.
- 37 ° ° C'de% 5 CO 2 ile inkübe edin.
- Sonra yaklaşık 16 saat, aspirat, her odanın köşesinden orta ve 200 mcL taze, önceden ısıtılmış orta eklemek şekilde oda içinde biyofilm bozabilir kesme kuvvetleri oluşturmak için odasının duvar boyunca dağıtmak.
- 24 saat daha uzun kuluçka, orta, her 12 saatte değiştirmek ya da bakteri canlılığını korumak için gerekli.
2. Biyofilm, görselleştirilmesi
- Yukarıda açıklandığı gibi, her iki meclisin de orta aspire ve yerleşik biyofilm steril serum fizyolojik ile iki kez hafifçe yıkayın.
- Her iyi BacLight Ölü / Canlı leke (3 mcL bileşeni tuzlu mL başına + 3 mcL bileşeni B) 200 mcL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Bu noktadan itibaren ışık kültür koruyun.
- Leke aspire ve daha önce olduğu gibi steril tuzlu su ile hafifçe iki kez yıkayın.
- Her iyi formalin tamponlu nötr 200 mcL ekleyin ve örnek düzeltmek için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
- Fiksatif çıkarın ve kurumsal kurallarına uygun olarak bertaraf edilmelidir.
- Iki kez tuzlu su ile yıkayın ve yukarıdaki gibi formalin içeren yıkama sıvıları atmayın.
- Bir lamel conta yerleştirilir, hiçbir hava kabarcığı mevcut olduğunu, slayt plastik kuyu çıkarın her tuzlu eklemek yeterli.
- Montaj orta lamel lamel ve conta kenarları. Tırnak cilası, ancak slaytlar kalıcı olmayacaktır slaytlar mühür kullanılabilir.
- Mastik mikroskobu aracılığıyla incelenmesi için yaklaşık 1 saat önce kuruması için bekleyin.
3. Sonuçlar
Şekil 1. 8-iyi odasının slayt oluşan bir biyofilm Temsilcisi 3D kompozit görüntüler. Bakteriler Live / Dead leke neyin canlı bakteri ile etiketlenmiş yeşil ve ölü bakteriler kırmızı floresan floresan. Tüm biyofilm kuleleri ve su kanalları ile farklı mimari gösteren (A) Bileşik görüntü. (B) 'de olduğu gibi aynı biyofilm (A), şimdi kesiti görülmektedir.
Discussion
Biyofilm formunda hangi mekanizma ile, hem de matris bileşenleri karakterize, anlamak, yoğun bir ilgi alanıdır. Bu protokol, protein ya da yapısal bütünlüğü, biyofilm yanı sıra, tedavi edici bir uygulama kendilerini borç proteinleri hedef tespit ve yardım için katkıda bulunan diğer bileşenleri tanımlamanıza yardımcı olması için kullanılabilir.
Yukarıda açıklanan protokol kuluçka süreleri ve dilüsyonları tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi) tarafından en iyi biyofilm oluşumu için kurulmuştur . Bazı ön çalışma (örneğin ilk seyreltme ve orta-log fazı büyüme elde etmek için gerekli inkübasyon süresi) diğer bakteri türleri için bu adımları optimize etmek için gerekli olabilir. 1:2500 dilüsyon odaları ilk tohumlama için kullanılabilir besin odasına overgrowing ve / veya yorucu biyofilm olmadan sağlam bir biyofilm bu organizma tarafından uyarılan oda slaytlar ve kuluçka süreleri belirtilen içinde geliştirmek istiyorsunuz sağlamak için kurulmuştur . Buna göre, ilk seyreltme ve inkübasyon sürelerinde diğer bakteri türlerinin ayarlanması gerekebilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Iş LO Bakaletz NIDCD / NIH R01DC003915 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
