Summary
Denna artikel beskriver förfarandet för bildandet och visualisering av en bakteriell biofilm odlas inom en 8-brunnars kammare bild
Abstract
Den kroniska natur många sjukdomar beror på bildandet av bakteriella biofilmer som är motsträviga till traditionell antibiotikabehandling. Biofilmer är community-associerade bakterier knutna till en yta och inneslutet i en matris. Den roll som den extracellulära matrisen är mångfacetterad, bland annat underlätta näringsämnen förvärvet, och ger ett betydande skydd mot miljöpåfrestningar (t.ex. värd immunsvar). I ett försök att få en bättre förståelse om hur bakterier i en biofilm svara på miljöpåfrestningar har vi använt ett protokoll där vi visualiserar bakteriella biofilmer som har bildats i en 8-brunnars kammare bild. Den biofilmer färgades med BacLight Live / Dead fläcken och undersöks med hjälp av ett konfokalmikroskop att karaktärisera den relativa biofilmen storlek och struktur under varierande inkubation förhållanden. Z-stack bilder samlades in via konfokalmikroskopi och analyseras av COMSTAT. Detta protokoll kan användas för att hjälpa till att belysa den mekanism och kinetik genom vilka biofilmer form, samt identifiera komponenter som är viktiga för biofilm struktur och stabilitet.
Protocol
1. In vitro biofilm bildning
- Kolonier (som har odlats på lämpliga agar över natten), avbröts i media och OD 490 har justerats till 0,65
- Den resulterande bakteriesuspension var då utspädd 1:06 (1 ml bakteriesuspension + 5 ml förvärms medium) och inkuberas vid 37 ° C med 5% CO 2 i ca 3 timmar för att nå mitten log fas.
- Späd mitten-log 1:2500 tillväxt fjädring med förvärms media och plats 200 mikroliter av utspädning i varje brunn på en 8-brunnars kammare bild.
- Inkubera vid 37 ° C med 5% CO 2.
- Efter ca 16 timmar, aspirera medium från hörnet av varje kammare och tillsätt 200 mikroliter färska, förvärmda medium - avstå längs väggen i kammaren för att inte skapa skjuvkrafter i kammaren som kan störa biofilmen.
- Om inkubationstiden längre än 24 timmar, ändra medelstora var 12 timmar eller som behövs för att upprätthålla bakteriell bärkraft.
2. Visualisering av biofilm
- Aspirera medium från varje kammare, som beskrivits ovan, och tvätta bosatt biofilm två gånger försiktigt med steril koksaltlösning.
- Tillsätt 200 mikroliter av BacLight Live / Dead bets (3 mikroliter komponent A + 3 mikroliter komponent B per ml saltlösning) till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter. Skydda kulturen från ljus från denna punkt och framåt.
- Aspirera fläcken och tvätta två gånger försiktigt med steril koksaltlösning som tidigare.
- Tillsätt 200 mikroliter neutral buffrad formalin till varje brunn och inkubera i 30 minuter i rumstemperatur att fixa exemplar.
- Ta bort fixativ och kasta i enlighet med institutionella riktlinjer.
- Tvätta två gånger med koksaltlösning och avyttra tvätta vätskor som innehåller formalin enligt ovan.
- Ta bort plasten brunnar från bilden, lägger nog saltlösning till varje brunn så att när ett täckglas placeras på packningen, ingen luft bubblor.
- Täckglas och försegla kanterna på täckglas med växande medium. Nagellack kan användas för att försegla bilderna dock bilderna inte blir lika permanenta.
- Låt tätningsmedlet torka i cirka 1 timme före granska via mikroskopi.
3. Resultat
Figur 1. Representant 3D sammansatta bilder av en biofilm som bildas i en 8-brunnars kammare bild. Bakterier var märkta med Live / Dead fläcken där levande bakterier fluorescerar grönt och döda bakterier fluorescerar rött. (A) Sammansatt bild av hela biofilmen visar distinkt arkitektur med torn och kanaler vatten. (B) Samma biofilm som i (A), nu ses i genomskärning.
Discussion
Att förstå den mekanism genom vilken biofilm form, samt karaktäriserar deras matriskomponenterna, är ett område av stort intresse. Detta protokoll kan användas för att identifiera proteiner eller andra beståndsdelar som bidrar till den strukturella integriteten av biofilm, samt att identifiera och målproteiner som kan lämpa sig för ett terapeutiskt program.
Den inkubationstiderna och utspädning i ovan beskrivna protokollet har fastställts för optimal biofilm bildning av nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi). Vissa förarbeten kan behövas för att optimera dessa steg för andra bakteriearter (dvs. första utspädning och inkubationstiden behövs för att uppnå mitten log tillväxtfas). Den 1:2500 utspädning för det första sådd av kamrarna har inrättats för att säkerställa att en robust biofilm skulle utvecklas i kammaren bilderna som orsakas av denna organism och inom inkubationstiderna anges, utan att biofilmen igenväxning kammaren och / eller utmattande tillgängliga näringsämnen . Därför kan den initiala utspädning och eller inkubationstider behöva anpassas för andra bakteriearter.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Arbetet har finansierats av NIDCD / NIH R01DC003915 till LO Bakaletz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate II agar | Fisher Scientific | B21267X | |
| 8-well chamber slides | Fisher Scientific | 12-656-18 | |
| BacLight Live/Dead bacterial viability kit | Fisher Scientific | NC9439023 | |
| BHI | Fisher Scientific | 211059 | |
| Hemin | Sigma-Aldrich | H5533 | |
| β-NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Permaslip mounting media | Fisher Scientific | NC9693613 |
References
- Bakaletz, L. O. Bacterial biofilms in otitis media: evidence and relevance. Pediatr Infect Dis J. 26, Suppl 10. S17-S19 (2007).
- Heydorn, A., Nielsen, A. T., Hentzer, M., Sternberg, C., Givskov, M., Ersboll, B. K., Molin, S. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
