3D तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति में localizing प्रोटीन: एक हाइब्रिड विज़ुअलाइज़ेशन पद्धति

Summary

यहाँ, हम वर्णन कैसे उत्पादन, विस्तार, और तीन आयामी (3 डी) संस्कृति में immunolabel प्रसवोत्तर hippocampal तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs). अगला, संकर दृश्य प्रौद्योगिकियों का उपयोग, हम प्रदर्शन कैसे immunolabelled cryosections के डिजिटल छवियों के लिए पुनर्निर्माण और पूरे 3D neurosphere भर immunopositive कोशिकाओं स्थानिक स्थिति नक्शा इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

The importance of 3-dimensional (3D) topography in influencing neural stem and progenitor cell (NPC) phenotype is widely acknowledged yet challenging to study. When dissociated from embryonic or post-natal brain, single NPCs will proliferate in suspension to form neurospheres. Daughter cells within these cultures spontaneously adopt distinct developmental lineages (neurons, oligodendrocytes, and astrocytes) over the course of expansion despite being exposed to the same extracellular milieu. This progression recapitulates many of the stages observed over the course of neurogenesis and gliogenesis in post-natal brain and is often used to study basic NPC biology within a controlled environment. Assessing the full impact of 3D topography and cellular positioning within these cultures on NPC fate is, however, difficult. To localize target proteins and identify NPC lineages by immunocytochemistry, free-floating neurospheres must be plated on a substrate or serially sectioned. This processing is required to ensure equivalent cell permeabilization and antibody access throughout the sphere. As a result, 2D epifluorescent images of cryosections or confocal reconstructions of 3D Z-stacks can only provide spatial information about cell position within discrete physical or digital 3D slices and do not visualize cellular position in the intact sphere. Here, to reiterate the topography of the neurosphere culture and permit spatial analysis of protein expression throughout the entire culture, we present a protocol for isolation, expansion, and serial sectioning of post-natal hippocampal neurospheres suitable for epifluorescent or confocal immunodetection of target proteins. Connexin29 (Cx29) is analyzed as an example. Next, using a hybrid of graphic editing and 3D modelling softwares rigorously applied to maintain biological detail, we describe how to re-assemble the 3D structural positioning of these images and digitally map labelled cells within the complete neurosphere. This methodology enables visualization and analysis of the cellular position of target proteins and cells throughout the entire 3D culture topography and will facilitate a more detailed analysis of the spatial relationships between cells over the course of neurogenesis and gliogenesis in vitro.

Both Imbeault and Valenzuela contributed equally and should be considered joint first authors.

Protocol

1. तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के अलगाव अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान सभी समय ऊतकों और ठंड समाधान रखें! अपने संस्कृतियों शुरू करने से पहले, निम्न स्टॉक समाधान तैयार: हदबंदी मीडिया (26 मिमी NaHCO 3, 124 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 0.1 मिमी CaCl 2 * 2H 2 हे, 3.2 मिमी MgCl 2 * 6 2 हे, 10 मिमी डी ग्लूकोज, 100 U / एमएल पेनिसिलिन, 100 μg / एमएल तंत्रिका protease (25 मिलीग्राम: स्ट्रेप्टोमाइसिन बाँझ और -20 ° सी. दोहरा आसुत एच 2 हे, बाँझ फिल्टर और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान aliquots में सेलुलर हदबंदी के लिए इस्तेमाल किया एंजाइमों के शेयर सांद्रता तैयार में 10-15 एमएल aliquots में दुकान फिल्टर : 1 मिलीग्राम / एमएल protease, 0.1mg / एमएल /), (10 मिलीग्राम / एमएल) papain, DNAseI (10 मिलीग्राम / एमएल) के प्रयोग के दिन, निम्नलिखित अंतिम सांद्रता में पृथक्करण मीडिया के 15 एमएल एंजाइमों जोड़ने एमएल papain, 0.1 मिलीग्राम / एमएल DNase मैं विच्छेदन अंतिम एंजाइम सांद्रता युक्त समाधान विच्छेदन की प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा जा सकता है. रखरखाव मीडिया Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम F12 (DMEM/F12), 2 मिमी एल glutamine, 100 / यू मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 / μg एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 1X B27 पूरक:. 3 महीने के लिए 4 में रखा जा सकता डिग्री सेल्सियस B27 और 4 में एक महीने के पूरक के बिना ° सी के साथ B27 पूरक. वृद्धि कारकों: 0.1 μg / एमएल पुनः संयोजक मानव epidermal वृद्धि कारक (hEGF) और 10 μg / एमएल के शेयर aliquots तैयार fibroblast कारक 2 (FGF-2) DMEM/F12 में वृद्धि + 0.1% गोजातीय सीरम albumin (BSA). -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए lethally C57BL 6 / माउस पिल्ले anesthetize, चूहों Euthansol के साथ प्रसव के बाद 0-3 दिन पर intraperitoneally अंतःक्षिप्त रहे हैं. 26 मिमी NaHCO 3, 124 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl * 2H 2 हे, 1.3 मिमी MgCl 2 * 6 2 हे: ध्यान मानक विच्छेदन और एक 60 मिमी पकवान युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव में दुकान (ACSF दिमाग को हटाने , 10 मिमी डी – ग्लूकोज, 100 U / एमएल पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 / μg एमएल). 7.3 पीएच अगर 50 एमएल aliquots में आवश्यक और बाँझ फिल्टर, दुकान में -20 डिग्री सेल्सियस Vibratome चक पर सेरिबैलम और Krazy गोंद, व्याख्यान चबूतरे वाला ऊपर की ओर, आप का सामना करना पड़ रहा पृष्ठीय पक्ष, के साथ गोंद मस्तिष्क को हटाने के द्वारा एक रेजर ब्लेड, ब्लॉक मस्तिष्क का उपयोग करना. एक Leica माइक्रोसिस्टम्स VT1000S vibratome इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. Vibratome में स्थिति चक और उचित डिब्बों में ACSF और बर्फ जोड़ें. 500 सुक्ष्ममापी के कट स्लाइसें 3.5-4.5 और 8.5 की आवृत्ति के बीच एक गति का उपयोग thicknesses. ACSF युक्त व्यंजन में hippocampal गठन युक्त स्लाइस ले लीजिए. Stereomicroscope का प्रयोग, bregma -1.60 मिमी और -2.40 मिमी के बीच hippocampi हटाने के लिए (जब तक CA3 क्षेत्र वक्र ventrally करने के लिए शुरू होता है) और एक नया सूखी पकवान में जगह (ACSF बिना). एक Leica MZ6 विदारक माइक्रोस्कोप इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. एक बार सभी hippocampi एकत्र कर रहे हैं, एक स्केलपेल के साथ ऊतक कीमा (जब तक एक सजातीय और तरलीकृत उपस्थिति हासिल की है). 15 एमएल polypropylene 2.5 एमएल हदबंदी तंत्रिका protease, papain और DNase मैं (समाधान तैयार करने के लिए कदम # 1 देखें) से युक्त मीडिया युक्त ट्यूब कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण. नोट: अगर वहाँ स्रोत ऊतक के एक बहुत कुछ है (उदाहरण के लिए, 6 पिल्ले से) यह 2.5 एमएल हदबंदी मीडिया के 2 शीशियों का उपयोग करने के लिए इष्टतम एंजाइम बनाए रखने के लिए एक अच्छा विचार है: ऊतक अनुपात. रोटेशन के साथ डिग्री सेल्सियस 45-60 मिनट के लिए 37 सेते हैं. एक Labnet ProBlot 6 संकरण ओवन (वैज्ञानिक मेंडल के माध्यम से खरीदा) इस रोटेशन 4 स्थापित करने के लिए सेट प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. जोड़ें बाँझ ऊतक संस्कृति पोटेशियम फॉस्फेट के 10 एमएल खारा buffered (Kpbs: 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी फॉस्फेट बफर, 7.4 पीएच) और 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र. एक Eppendorf अपकेंद्रित्र (मॉडल 5702) इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. Kpbs के 5 एमएल में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें. पाश्चर विंदुक के माध्यम से trituration से ऊतक अलग कर देना. 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र. रखरखाव माध्यम से 3 एमएल में Resuspend कोशिकाओं, गिनती 60 मिमी गैर पक्षपाती व्यंजन में Trypan ब्लू और प्लेट कोशिकाओं का उपयोग कर कक्षों 2.5 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर (Corning अल्ट्रा कम पालन बाध्यकारी व्यंजन इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है, सामग्री देख) रखरखाव के माध्यम से 5 एमएल / पकवान. पेट्री डिश अल्ट्रा कम पालन व्यंजन की जगह में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन संस्कृतियों के लिए हर दिन सुबह और दोपहर में इन विट्रो में पहले 6 दिनों के लिए विस्तार (DIV) चढ़ाना और सहज भेदभाव को रोकने के दौरान उपयोग किया जा आवश्यकता होगी. 20 एनजी / एमएल और FGF-2 के अंतिम 10 एनजी / चढ़ाना के बाद तुरंत एमएल के एक अंतिम एकाग्रता एकाग्रता hEGF जोड़ें. अतिरिक्त वृद्धि कारकों संग्रह दिन तक 14 DIV पर विस्तार चरण के दौरान हर दो दिन जोड़ें. (विस्तार neurospheres के वीडियो में स्केल सलाखों 100 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करते हैं.) ** नोट: मीडिया के विस्तार के चरण की 10 DIV के आसपास पीले बन सकता है. यदि ऐसा होता है, दूसरे एक एमएल माई जोड़नेntenance मीडिया. यदि मीडिया अगले दिन फिर से पीले, रखरखाव मीडिया का एक और 1 एमएल जोड़ – यह अपने विस्तार के चरण के दौरान आवश्यक के रूप में कर रख – वृद्धि कारकों की मात्रा के अनुसार समायोजित करने के लिए सही अंतिम सांद्रता बनाए रखने के लिए याद है. 2. सीरियल Cryosectioning धीरे निर्धारण करने से पहले सुनिश्चित करने के क्षेत्रों के निर्धारण के समय में अच्छी तरह से अलग हैं neurospheres ठोकर. सीधे संस्कृतियों के लिए धीमी झटकों के साथ 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक 3.7% और सेते के अंतिम (आरटी) एकाग्रता आणविक ग्रेड formaldehyde जोड़ें. एक Stovall बेली डांसर इस प्रोटोकॉल 2.5 का एक रोटेशन की गति सेट में प्रयोग किया जाता है. एक 15 एमएल polypropylene ट्यूब में neurospheres लीजिए और 5 मिनट के लिए 300 XG पर नीचे स्पिन. 10 एमएल सोडियम फॉस्फेट में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें buffered खारा (154 मिमी NaCl, 10 मिमी फॉस्फेट बफर nPBS). Kpbs से nPBS के लिए समाधान के उपयोग में परिवर्तन नोट. 5 मिनट के लिए 300 XG पर नीचे स्पिन. 5-10 एमएल 20% (w / v) nPBS में sucrose के समाधान में Resuspend है. 4 ° C पर neurospheres कम से कम 24 घंटे के लिए संस्कृतियों cryoprotect रखें. इष्टतम काटना तापमान यौगिक (अक्टूबर) के साथ एक डिस्पोजेबल cryomold भरें. धीरे sucrose के एक डिश में neurospheres युक्त समाधान डालना. यांत्रिक व्यवधान के कम से कम सबूत के साथ विभिन्न आकार के प्रतिनिधि क्षेत्रों का पता लगाने के लिए एक stereomicroscope का प्रयोग करें. जब पहली बार के लिए इस प्रक्रिया का प्रदर्शन, कुछ संस्कृतियों या टूट किया जा सकता है फटे. आकृति विज्ञान अच्छी तरह से अभ्यास के साथ बनाए रखा जाएगा. धीरे से एक 1 एमएल विंदुक टिप (युक्त समाधान sucrose के एक न्यूनतम करने के लिए हटा दिया की मात्रा रखने) में प्रत्येक neurosphere aspirate और यह अक्टूबर यौगिक में जगह. मोल्ड पर अपने अनुमानित स्थान मार्क ताकि आप क्षेत्रों बाद में पा सकते हैं. एक बार जब आप cryomold में कुछ क्षेत्रों को रखा है, सीओ 2 का उपयोग कर जब तक अक्टूबर सफेद है नमूने फ्लैश फ्रीज. घन पर अपने क्षेत्रों के स्थान को मार्क और घन मोल्ड के बाहर पॉप पूर्व ठंडा संदंश का प्रयोग, पहले अक्टूबर के साथ एक चक करने के लिए सुरक्षित फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर घन जगह है. घन के आसपास अक्टूबर यौगिक प्लेस और सीओ 2 का उपयोग क्षेत्रों युक्त ब्लॉक पालन करने के लिए स्थिर. वैकल्पिक रूप से (फिल्टर पेपर के साथ) cryostat में चक, फिल्टर पेपर पर धार अक्टूबर यौगिक, और अक्तूबर में जगह सीधे घन जगह है. रुको जब तक अक्टूबर सफेद और कठिन है. एक Leica CM1900 cryostat इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. एक बार अक्टूबर यौगिक सफेद हो जाता है, तो आप काटने ब्लॉक पर चक जगह है, तो हो सकता है संतुलित तापमान के लिए कम से कम 30 मिनट रुको. धारावाहिक 10 सुक्ष्ममापी वर्गों अपने निशान के लिए बाहर देख रहे हैं और अक्सर neurosphere वर्गों के लिए एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच कट. आप कर सकते हैं एक स्लाइड पर के रूप में कई वर्गों के रूप में रखें. नोट: आप अपने neurosphere के पहले कुछ स्लाइसें गुंजाइश के तहत, इसलिए सभी वर्गों इकट्ठा जब तक आप कक्षों देख और इस शुरू होने से पहले और अपने क्षेत्र के अंत में 3-5 वर्गों रखने को देखने के लिए सक्षम नहीं किया जा सकता है. ये पूर्वकाल और कूल्हों वर्गों immunocytochemistry के लिए भी संसाधित किया जाएगा. एक परमाणु counterstain जब immunostaining प्रदर्शन इसलिए कुंजी है के रूप में यह आप neurosphere मानक औंधा चरण माइक्रोस्कोपी के तहत आसानी से स्पष्ट नहीं खंभे पर एकल कक्षों का पता लगाने के लिए अनुमति देगा. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर वर्गों 3. Immunocytochemistry -20 डिग्री सेल्सियस और पिघलना से nPBS धीरे सभी वर्गों से अधिक और 5 मिनट के लिए आवेदन आरटी पर incubating स्लाइड्स निकालें. बंद झाड़ अतिरिक्त nPBS और तुरंत प्राथमिक अब बफर में पतला एंटीबॉडी (0.3% Triton एक्स-100, 0.3% गोजातीय nPBS में albumin सीरम, 7.2 पीएच) लागू. आप ~ स्लाइड प्रति 100 μL की आवश्यकता होगी. इस प्रोटोकॉल में, हम असतत एनपीसी 3 डी neurosphere संस्कृति में मौजूद संतान में Cx29 स्थानीयकरण. Parafilm साथ कवर वर्गों को कवर लेकिन खुर्दबीन स्लाइड के आकार से अधिक नहीं के रूप में एंटीबॉडी बंद खींचा जा असमस द्वारा स्लाइड अगर parafilm तक पहुँचता है या अधिक स्लाइड की चौड़ाई में कटौती. parafilm वाष्पीकरण रोकने जाएगा. 4 ° C में रात में एक उमस भरे कक्ष में सेते हैं. ख्याल रखना वर्गों से अधिक parafilm नाव और यह स्लाइड करने के लिए पालन करने के लिए अनुमति नहीं है. हालांकि निकालने के लिए, या नहीं parafilm एक बार लागू है के रूप में देखभाल के वर्गों पर किसी भी कतरनी बल लागू नहीं है और इस तरह आकारिकी बाधित लिया जाना चाहिए प्लेसमेंट बदल कर. ~ 1 एमएल nPBS सीधे वर्गों के लिए बंद जोड़ें parafilm नाव. वैकल्पिक रूप से, स्लाइड खड़ी सीधे एक coplin जार में जब तक parafilm दूर तैरता जगह. दूर जब तक यह दूर स्वतंत्र हेरफेर के रूप में आप नाजुक neurosphere संरचना को बाधित कर सकते हैं तैरता नहीं parafilm. एक बार parafilm बंद स्लाइड है, आरटी में 5 मिनट सेते हैं. बंद झाड़ nPBS और 5 मिनट के लिए 3 आरटी पर washes के साथ जारी है. माध्यमिक एंटीबॉडी आरटी पर अब बफर और सेते में 1 के लिए पतला लागू करेंऊपर वर्णित के रूप में एक उमस भरे कक्ष में घंटे. तुम फिर से ~ 100 μL / स्लाइड की आवश्यकता होगी. चरण 4 में nPBS washes दोहराएँ. 5 मिनट के लिए 3 Rd धोने (Hoechst ३३२५८ 0.5 nPBS में μg / एमएल) में एक परमाणु counterstain लागू करें और आरटी से कम 5 मिनट के लिए अंतिम धोने के साथ आगे बढ़ना. अपना पसंदीदा विरोधी फीका बढ़ते मीडिया और coverslip में पर्वत, कोनों में nailpolish पहले से coverslip हासिल तो किनारों के आसपास सभी नुकसान को रोकने के लिए (अगर एक ग्लिसरॉल आधारित मीडिया का उपयोग). एक epifluorescent या confocal खुर्दबीन का उपयोग कर छवि संग्रह करने के लिए आगे बढ़ें. इस प्रोटोकॉल में, हम एक Leica DMRA2, एक हमामात्सू Orca ईआर कैमरा, और OpenLab v3.56 सॉफ्टवेयर का उपयोग करें. इस उदाहरण में, छवियों के तीन चैनलों पर कब्जा कर रहे हैं: (1) चरण विपरीत, (3) ब्लू यूवी (Leica A4 क्यूब: संयोजन फ़िल्टर पूर्व 360/40, 400 डि, BP470/40 सपा) और लाल (Leica Y3 क्यूब फ़िल्टर संयोजन पूर्व BP535/50, डि 565, 610/75 सपा). प्रत्येक धारावाहिक पहली और Hoechst डीएनए जहां एकल कक्षों के चरण का पता लगाने मुश्किल है के 33258 लेबलिंग का उपयोग डंडों ट्रैकिंग द्वारा पिछले वर्गों के करीब ध्यान दे अनुभाग को गोली मारो. 4. संरेखण जब cryosections खुर्दबीन लाइनों पर पिघलना घुड़सवार हैं, वे कदम है और बहुत थोड़ा घुमाएगी जाएगा. इन विचलन सही होना चाहिए. इसके अलावा, जब प्रत्येक धारावाहिक अनुभाग imaged है, प्रत्येक छवि के केंद्र स्क्रीन पर एक ही स्थान में नहीं किया जा सकता है. एक परिणाम के रूप में, प्रत्येक डिजीटल धारावाहिक अनुभाग ध्यान पूर्ववर्ती सटीक आकारिकी संरक्षित अनुभाग के साथ realigned होना चाहिए. यह संरेखण एक सावधान और सटीक cytoarchitecture और स्थलाकृतिक विस्तार करने के लिए ध्यान देने की आवश्यकता है. प्रत्येक चैनल और 10 सुक्ष्ममापी और 50 सुक्ष्ममापी (OpenLab सॉफ्टवेयर v3.56 में स्थापित) के निवासी पैमाने सलाखों के सीरियल छवियों व्यक्तिगत झगड़ा फ़ाइलों के रूप में सहेजे जाते हैं और 3300 x 2550 पिक्सल के एक मानक कैनवास आकार और 72 के एक संकल्प का उपयोग कर Photoshop CS4 में आयात पिक्सल / इंच. कैनवास आकार करने के लिए सावधान ध्यान इस आयात में लिया जाना चाहिए एक सही पैमाने पर बनाए रखने के लिए. कैनवास आकार और संकल्प में MAYA बाद मॉडलिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं. पैमाने पर पट्टी, फ़ोटोशॉप में एक अलग परत के रूप में सहेजा है, सत्यापित करें कि XY आयाम के लिए कोई परिवर्तन नहीं फ़ोटोशॉप में संरेखण के दौरान होता है के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अगले, तीन (या अधिक) एक ही अनुभाग (यानी, प्रत्येक अनुभाग के लिए प्रत्येक चरण, यूवी, और Cy3 छवि श्रृंखला लिंक) करने के लिए इसी परतों लिंक. यह भरोसा दिलाते हैं कि जब एक परत गठबंधन है, उस अनुभाग के साथ जुड़े अन्य परतों को भी एक ही समय में जुड़ रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, आप चरण परत एक बार कर सकते हैं उपयुक्त स्थान (नीचे देखें) में ताला और तब चरण परत करने के लिए उस अनुभाग के जुड़े परतों पंक्ति. शुरू करने के लिए, सभी परतों परतों खिड़की में "आंख" आइकॉन पर क्लिक करके अदृश्य बनाना. परतों खिड़की में "आंख" आइकॉन पर क्लिक करके पर neurosphere धारावाहिक वर्गों के पहले और दूसरे चरण विपरीत छवियों को बंद करें. दूसरे खंड की पारदर्शिता बढ़ाएँ. "छवि" टैब के तहत, "छवि रोटेशन" और खुले चुनें "मनमाना है." दूसरे खंड घुमाएँ जब तक आप छवियों के बीच ज्यामितीय और संरचनात्मक समीपता के अंक की पहचान करने में सक्षम हैं. यह यूवी चैनल (Hoechst 33,258 – लेबल वर्गों) के साथ आगे और पीछे की तुलना करने के लिए उपयोगी है. बाद के सभी सीरियल "निकटतम पड़ोसियों" (यानी, तत्काल पीछे अनुभाग के साथ तत्काल पूर्वकाल खंड) की तुलना जब तक सभी वर्गों और सभी चैनलों सही गठबंधन कर रहे हैं वर्गों के लिए दोहराएँ. माया v10 में एक विमान है कि Photoshop फ़ाइल के रूप में उसी अनुपात के है बनाएँ. 5. सेल typology माया के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस की स्थिति रेखा से, मेनू बार अपने डिफ़ॉल्ट ऐनिमेशन सेटिंग से सतहों के लिए बदल जाते हैं. सेल शरीर बनाने के एक आदिम उपखंड क्षेत्र का प्रयोग करें. Neurosphere चयनित, वस्तु पर सही माउस बटन क्लिक करके और चिह्नित मेनू से उपगम्यता चयन करके अपने कोने से छेड़छाड़ शुरू करते हैं. इसके अलावा चिह्नित मेनू से प्रदर्शन के स्तर को बदलने के द्वारा क्षेत्र की सतह के विस्तृत. मुख्य मेनू के उपखंड सतहों टैब से, संकुचित करें पदानुक्रम विकल्प बॉक्स खोलने के लिए और दो स्तरों की संख्या सेट. क्षेत्र संकुचित करें. मेनू बार सतहों से बहुभुज के लिए बदलें. क्षेत्र चयनित के साथ, मुख्य मेनू के मेष टैब से नकाशी ज्यामिति उपकरण खोलने. अपनी अंतिम प्रपत्र उपकरण सेटिंग्स टैब से नकाशी ज्यामिति toolset रोजगार के लिए सेल की सतह को परिष्कृत. इस प्रक्रिया को दोहराएं अलग सेल शरीर को बनाने के लिए NPCs और एनपीसी neurosphere में संतान वर्तमान की विविधता अनुकरण. इस प्रदर्शन में दस अलग अलग सेल निकायों neurosphere के लिए आधार के रूप में. सेल typology और रुक रूपांतरण का चयन करें. के साथ अपने typology की कोशिकाओं की स्थापना, दो सतह shaders दोनों व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए डिजाइन किया जाएगाब्याज की प्रोटीन (हमारे उदाहरण में Cx29 पॉजिटिव कोशिकाओं) और कोशिकाओं जहां प्रोटीन अनुपस्थित है. यहाँ, Cx29 immunoreactivity के साथ किसी भी सेल Cx29 पॉजिटिव नामित है. इस उदाहरण में, subcellular स्थानीयकरण हालांकि इस तरह के एक विश्लेषण shaders करने के लिए संशोधन के साथ संभव नहीं है modeled है. Windows मुख्य मेनू> प्रतिपादन संपादकों टैब से Hypershade विंडो खोलें. भूतल सामग्री टैब से एक रैंप छायांकर्ता चुनें. ऐट्रिब्यूट संपादक खोलें और shaders का रंग, जोश, परिवेश रंग, टक्कर नक्शा, और स्पेक्युलर रंग विशेषताओं सेट. ब्राउनियन परिवेश रंग नोड और एक 2d टक्कर मानचित्रण नोड करने के लिए भग्न बनावट के लिए 3 डी बनावट निरुपित. परिणामी shaders इनपुट और आउटपुट कनेक्शन का चयन करें और चयनित नेटवर्क निर्यात. सेल typology का चयन करें और निर्यात चयन विकल्प बॉक्स खोलने के लिए. चुनें फ़ाइल प्रकार mayaAscii और अचयनित इन आदानों बॉक्स शामिल करें. निर्यात चयन. 6. सेल मानचित्रण Photoshop CS4 में गठबंधन धारावाहिक वर्गों फ़ाइल खोलें. पेंसिल स्ट्रोक का एक प्रमुख स्थापित धारावाहिक वर्गों में प्रत्येक पूर्वपुस्र्ष सेल के स्थानों को चिह्नित. इस प्रदर्शन में, तीन स्ट्रोक की कुंजी – एक ठोस वर्ग एक डैश्ड लाइन के साथ एक वर्ग है, और एक क्रॉस के साथ एक वर्ग के लिए संकेत मिलता है कि क्या किसी कक्ष एक, दो, या तीन वर्गों में स्थित है उपयोग किया जाएगा. स्ट्रोक की इस कुंजी और रंग द्वारा परिभाषित किया गया है – इस उदाहरण में, लाल कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है ब्याज, Cx29 के हमारे प्रोटीन व्यक्त, और सफेद व्यक्त Cx29 नहीं कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है. चरण परत पर मुड़ें और एक सफेद पेंसिल स्ट्रोक के साथ प्रत्येक पूर्वपुस्र्ष सेल के केंद्र अंकन शुरू करते हैं. अनुभाग फ़ोल्डर के भीतर एक अलग परत के साथ जो अपने नक्शे बनाने के लिए प्रयोग करें. वर्गों के बीच टॉगल करने के लिए कोशिकाओं स्थिति सुनिश्चित करना है कि एक से अधिक अनुभाग पर कोशिकाओं को ठीक तरह से चिह्नित हैं का पता लगाने के लिए. साथ Cx29 परत पर दिया है, कोशिकाओं है कि जहां Cx29 सकारात्मक व्यक्त किया है क्षेत्रों में गिरावट का चयन करें. फ़ोटोशॉप के मुख्य मेनू पट्टी के संपादन टैब से भरण आदेश चुनें और लाल सफेद स्ट्रोक को बदलने. साथ नक्शे पूरा माया परियोजना के sourceimages फ़ोल्डर में एक अलग jpeg छवि के रूप में प्रत्येक अनुभाग को बचाने के. ऐसा करने के लिए, एक नई माया परियोजना पहली बार बनाया जा करना होगा. 7. आयात और कोडांतरण में 3 डी मानचित्र माया के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस की स्थिति रेखा से, अपनी डिफ़ॉल्ट ऐनिमेशन सेटिंग से बहुभुज करने के लिए पट्टी मेनू बदल जाते हैं. परियोजनाओं दृश्यों फ़ोल्डर से planes.mb और scaleBar.mb फ़ाइलें आयात. विमान चयनित के साथ, वस्तु पर सही माउस बटन क्लिक करके और असाइन नई सामग्री टैब खोलने के द्वारा एक लैम्बर्ट shader असाइन. गुण संपादक में सामग्री का रंग विशेषता की सही चेकर बॉक्स क्लिक करें. पॉप अप मेनू से, 2 डी बनावट अनुभाग से फ़ाइल का चयन करें. इस गुण संपादक में फ़ाइल विशेषताएँ खंड के तहत, छवि नाम विशेषता के अधिकार के लिए फ़ाइल आइकन पर क्लिक करें. Sourceimages फ़ोल्डर से पहला खंड चुनें. पैनलों टैब खोलने के द्वारा कार्यस्थान विंडो के परिप्रेक्ष्य दृश्य से डिफ़ॉल्ट लिखने शीर्ष देखने के लिए कैमरा स्विच. मुख्य मेनू के मेष टैब से बनाएँ बहुभुज उपकरण का चयन करें और अनुभाग की रूपरेखा का पता लगाने. Sourceimages फ़ोल्डर से पहले नक्शा चुनें और नव निर्मित बहुभुज विमान को यह बहुभुज विमान बनाने की स्थापना चरणों का पालन असाइन. चयनित ऑब्जेक्ट, चिह्नित मेनू से विमान पर सही माउस बटन क्लिक करके यूवी चुन. सभी विमानों यूवी अंक का चयन करें और मुख्य मेनू Windows टैब से यूवी बुनावट संपादक खुला. यूवी के आनुपातिक स्केल अनुभाग विमान फिट. सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक अनुभाग के बीच रिक्त स्थान पैमाने पट्टी की ऊंचाई के अनुरूप neurosphere के प्रत्येक अनुभाग के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. 8. 3 डी में पता लगाने पूर्वपुस्र्ष सेल typologies माया के उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस की स्थिति रेखा से, अपने डिफ़ॉल्ट एनिमेशन गतिशीलता के लिए सेटिंग मेनू पट्टी से बदल जाते हैं. केवल दिखाई neurosphere का पहला खंड को छोड़कर, मुख्य मेनू के प्रदर्शन टैब से प्रदर्शन सेटिंग्स बदलकर अन्य सभी वर्गों को छिपाने. CV वक्र उपकरण विकल्प बॉक्स खोलने के लिए, 1 का चयन CV वक्र सेटिंग्स से रैखिक. शीर्ष दृश्य कैमरे से दृश्य देखना, Cx29 नकारात्मक कोशिकाओं के लिए एक वक्र और Cx29 पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए सेल बनाने के नक्शे के लिए अंक बताए शुरू करते हैं. परिणामी घटता फ्लैट कर रहे हैं जब एक साइड दृश्य कैमरे से देखा. Y-अक्ष में वक्र के अंक जा पैमाने पर एक गाइड के रूप में माइक्रोस्कोपी छवियों से आयातित पट्टी का उपयोग करके वर्गों की मोटाई स्थापित करना. Neurosphere के प्रत्येक अनुभाग के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. परियोजना के दृश्यों फ़ोल्डर से cellTyoplogy.ma फ़ाइल आयात और दोनों neurosphere के भीतर Cx29 नकारात्मक और Cx29 पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए सेल typology डुप्लिकेट. Windows मुख्य मेनू> प्रतिपादन संपादकों टैब से Hypershade विंडो खोलें. आयात पहले बनाया उन्हें typology की कोशिकाओं को बताए shaders. Outliner खिड़की से, आयातित वस्तुओं की शुरुआत से फ़ाइल नाम को हटा दें. इस मॉडलिंग की प्रक्रिया के बाद के चरणों में महत्वपूर्ण हो जाएगा. मुख्य मेनू से कण टैब का चयन करें और पहली CV वक्र के लिए एक कण emitter बनाने. ParticleShape1 टैब खोलें और उत्सर्जन गुण के तहत अधिकतम -1 से अपनी पहली वक्र पर अंकों की संख्या गणना बदलने. सौंपनेवाला में गुण टैब भद्दी भूतल (एस / डब्ल्यू) के लिए कण सौंपनेवाला का प्रकार बदल. नीचे वर्तमान सौंपनेवाला प्रकार बॉक्स पर क्लिक करें और 0.010 कणों की त्रिज्या बदलें. वक्र के कोने पहले कणों का चयन तो वक्र का चयन बदलाव कणों संलग्न. मुख्य मेनू के कण टैब के भीतर से लक्ष्य विकल्प खोलें और 1 के लिए लक्ष्य वजन सेट. बनाएँ क्लिक करें. Outliner विंडो में क्रम संख्या 1 से 10 तक कोशिकाओं का चयन करें और मुख्य मेनू के कण टैब से (रिप्लेसमेंट) विकल्प बॉक्स Instancer खुला. इंस्टांस ऑब्जेक्ट्स बॉक्स में, सभी दस कोशिकाओं क्रम में सूचीबद्ध किया जाना चाहिए. कण इंस्टांस टैब ऑब्जेक्ट की सूची ड्रॉप डाउन से सही particleShape नाम चुनें. बनाएँ क्लिक करें. डिफ़ॉल्ट रूप से चुना गया था कि केवल प्रथम कक्ष वक्र साथ कण बदल देगा. आदेश में सभी दस प्रकार दिखाई देते हैं और चक्र कणों के बीच बेतरतीब ढंग से प्राप्त करने के लिए, एक अभिव्यक्ति की जरूरत है. एक दूसरे अभिव्यक्ति सुनिश्चित करेगा कि कोशिकाओं को एक ही रास्ते में बेतरतीब ढंग से हर समय रेंज फ़िसलपट्टी repositioned है फेंकना. Emitter चयनित के साथ, गुण संपादक खुला. ParticleShape टैब में जोड़ें गतिशील गुण के तहत जनरल बॉक्स पर क्लिक करें. लांग नाम के तहत random_index लिखें. ऐट्रिब्यूट प्रकार अदिश से प्रति कण (सरणी) और हिट करने के लिए स्विच में जोड़ें. प्रति कण (ऐरे) टैब गुण, एक random_index बॉक्स जोड़ दिया गया है. खाली जगह पर सही माउस बटन क्लिक करना, अभिव्यक्ति बनाएँ का चयन करें … ड्रॉप डाउन बॉक्स से. अभिव्यक्ति में पाठ लिखें: बॉक्स – particleShape1.random_index = रैंड (10), अगर (particleShape1.particleId == 1) बीज (1); पूरा अभिव्यक्ति गुण संपादक में और सामान्य विकल्प> ड्रॉप डाउन सूची से वस्तु सूचकांक का चयन करें random_index में (ज्यामिति रिप्लेसमेंट) Instancer टैब खोलने के लिए. पहला फ्रेम करने के लिए समय स्लाइडर ले आओ और खेलने मारा, सेल प्रकार अब बेतरतीब ढंग से कर रहे हैं कणों के बीच वितरित किया. Neurosphere के प्रत्येक अनुभाग के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नए emitter, instancer, और यादृच्छिक सूचकांक नाम से विभेदित है और उचित outliner विंडो में संगठित है. 9. प्रतिपादन Compositing / सौंपनेवाला सौंपनेवाला सेटिंग्स विंडो के अनुभाग का प्रयोग, माया सॉफ्टवेयर से मानसिक रे रेंडरर बदल जाते हैं. गुणवत्ता टैब खोलें और Raytracing के अंतर्गत सेटिंग में शून्य करने के लिए कुछ विचार बदलने के. फ्रेमबफर टैब खोलें और अल्फा के लिए कच्चे और अचयनित Premultiply से Colorclip बदल. चैनल संपादक / बॉक्स परत खोलें और सौंपनेवाला प्रदर्शन से परत संपादक सेटिंग बदलने. Typology की आयातित कोशिकाओं का चयन करें और नई परत बनाएँ और असाइन चयनित वस्तुओं आइकन क्लिक करें. परत परिवेश रोड़ा नाम बदलें. नव निर्मित परत पर सही माउस बटन पर क्लिक मेनू से गुण का चयन करें. RenderLayer बॉक्स का सही करने के लिए, प्रीसेट बटन पर क्लिक करें और ड्रॉप डाउन सूची से आड़ का चयन करें. Mib_amb_occlusion1 टैब का चयन करें और 16 से 256 नमूनों को बदलने. चैनल संपादक / बॉक्स परत को पुन: खोलें और विकल्प टैब के अंतर्गत, सभी परतें विकल्प बॉक्स सौंपनेवाला खोलने के. समग्र का चयन करें और परतों रखने. AmbientOcclusion चयनित परत के साथ, यह सामान्य से बदलने के लिए बस के ऊपर परत सूची ड्रॉप डाउन बॉक्स से गुणा. Neurosphere के दो गुजरता है, पर बदल गया और एक बार के साथ masterLayer पर दिया ambientOcclusion परत के साथ एक बार प्रस्तुत करना. परियोजनाओं छवियों फ़ोल्डर में iff फ़ाइलें के रूप में छवियों को बचाओ. Photoshop CS4 में दोनों छवियों को खोलें. MasterLayer के शीर्ष पर ambientOcclusion परत प्लेस और यह सेट करने के लिए गुणा. एक पृष्ठभूमि बनाएँ और छवि समतल.

Discussion

इस प्रोटोकॉल संस्कृति और serially cryosection प्रसवोत्तर hippocampal NPCs, करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन immunodetection द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति स्थानीयकरण, और अंत में पुनर्निर्माण और पूरे 3D neurosphere भीतर immunopositive कोशिकाओं के स्थलाकृतिक स्थिति का विश्लेषण. कोशिका जीव विज्ञान संस्कृति और प्रसंस्करण की तकनीक, माइक्रोस्कोपी इमेजिंग (OpenLab, कामचलाऊ व्यवस्था और अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर) के संयोजन से, ग्राफिक संपादन सॉफ्टवेयर (Adobe Photoshop) क्षमता, और 3 डी एनीमेशन और compositing सॉफ्टवेयर क्षमता (Autodesk माया), हम पुनर्निर्माण के लिए एक पद्धति मौजूद धारावाहिक 2D सेलुलर और एक neurosphere संस्कृति भर में प्रोटीन अभिव्यक्ति की स्थिति के वफादार पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है छवियों से 3 डी संस्कृतियों के पूरे सेलुलर संरचना. इस प्रोटोकॉल पंजीकरण और epifluorescent पतली धारावाहिक मोटा धारावाहिक वर्गों के माध्यम से या वर्गों confocal जेड – ढेर के पुनर्निर्माण के बराबर प्रभावशीलता के साथ संयुक्त किया जा सकता है है. Neurosphere संस्कृति और प्रसवोत्तर मस्तिष्क में neurogenesis gliogenesis के पाठ्यक्रम पर मनाया चरणों के कई recapitulates में एकल NPCs के क्लोनल विस्तार के कारण, अपने 3D संरचना के प्रभाव संतान में एक महत्वपूर्ण एनपीसी भाग्य निर्धारक वही ^{प्रयोगात्मक} 1 परिवेश उजागर करने के लिए प्रतिनिधित्व करता है . वंश और कोर और धारावाहिक neurosphere वर्गों की परिधि में प्रोटीन अभिव्यक्ति में विचलन यह पता चलता है कि सेल की स्थिति, यांत्रिक तनाव और कतरनी बल सहित कई शारीरिक ^{कारकों} एनपीसी जीव विज्ञान 2 विनियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने कि. इसके अलावा, connexin प्रोटीन अभिव्यक्ति, यहाँ का विश्लेषण किया, जब NPCs निलंबन में 3 डी neurospheres या कार्यात्मक connexin की मध्यस्थता संचार के साथ एक laminin सब्सट्रेट बदल चाहे कोशिकाओं प्लास्टिक और सब्सट्रेट पर 3D मुफ्त या सभ्य हैं पर चढ़ाया के रूप में संवर्धित कर रहे हैं पर निर्भर करता है बदल दिखाया गया है अस्थायी ³ संस्कृतियों. एनपीसी भाग्य पर सेलुलर स्थिति के प्रभाव अस्पष्ट बनी हुई है. यह तकनीकी 3D संस्कृति के भीतर दिया है कि वंश और संकेत प्रोटीन प्रतिजनी मूल्यांकन 3D वास्तुकला का विघटन सेल permeabilization और सभी कक्षों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग को सक्षम करने की आवश्यकता है है एनपीसी जीव विज्ञान पर स्थानिक स्थान के प्रभाव का विश्लेषण करने की चुनौती दे रहा है. यहाँ, हम बताते हैं कि एक संकर दृश्य पद्धति निर्धारित है कि कुछ प्रोटीन 3D संस्कृति में अद्वितीय स्थितीय localizations प्रदर्शन के एक साधन प्रदान करता है, अनुमान और neurosphere भीतर क्षेत्रीय स्थानीयकरण करने के लिए सम्मान के साथ प्रोटीन समारोह और विनियमन का परीक्षण किया जा सकता है, और, शायद सबसे महत्वपूर्ण बात स्थितीय 3D संस्कृति में एनपीसी भाग्य पर 3 डी स्थलाकृति और सेलुलर स्थिति के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए आवश्यक डेटा प्रदान करता है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Euthansol	Reagent	Schering-Plough Canada Inc.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsytems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet via Mandel Scientific
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Hoechst 33258	Reagent	Sigma	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Hamamatsu Improvision/Perkin Elmer		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Processor: Intel Corei7 920 Memory: 12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)		Modeling hardware

* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.