Lokalisieren von Protein in 3D Neural Stem Cell Culture: Ein Hybrid Visualisierung Methodology

Summary

Hier beschreiben wir, wie zu produzieren, zu erweitern und immunolabel postnatalen Hippocampus neuronale Vorläuferzellen (NPCs) im dreidimensionalen (3D-) Kultur. Als nächstes mit Hybrid-Visualisierungs-Technologien, demonstrieren wir, wie digitale Bilder von immunolabelled Kryoschnitten verwendet werden, um zu rekonstruieren und Karte der räumlichen Lage der immunpositive Zellen über die gesamte 3D-Neurosphäre werden.

Abstract

Die Bedeutung der 3-dimensional (3D) Topographie beeinflussen neuralen Stamm-und Progenitorzellen (NPC)-Phänotyp ist allgemein anerkannt, aber schwierig zu studieren. Wenn losgelöst von embryonalen oder postnatale Gehirn, werden einzelne NPCs in Suspension vermehren zu Neurosphären bilden. Tochterzellen innerhalb dieser Kulturen spontan annehmen deutliche Entwicklungsstörungen Linien (Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten) im Laufe der Expansion trotz der gleichen extrazellulären Milieu ausgesetzt. Diese Entwicklung rekapituliert viele der Stadien beobachtet im Laufe der Neurogenese und Gliogenese in postnatalen Gehirn und wird häufig verwendet, um grundlegende NPC Biologie in einer kontrollierten Umgebung zu studieren. Die Beurteilung der vollen Auswirkungen der 3D-Topographie und zellulären Positionierung innerhalb dieser Kulturen auf NPC Schicksal ist jedoch schwierig. Zur Lokalisierung von Target-Proteinen und identifizieren NPC Linien Immunzytochemie, muss frei schwebenden Neurosphären auf einem Substrat beschichtet werden oder seriell geschnitten. Diese Verarbeitung ist erforderlich, um gleichwertige Zellpermeabilisierung und Antikörper-Zugang im gesamten Gebiet zu gewährleisten. Als Ergebnis können 2D epifluoreszenten Bilder von Gefrierschnitten oder konfokale 3D-Rekonstruktionen von Z-Stapeln nur stellen räumliche Informationen über Zell-Position innerhalb diskreten physischen oder digitalen 3D-Scheiben und nicht visualisieren zelluläre Position im intakten Bereich. Hier, in der die Topographie des Neurosphäre Kultur bekräftigen und erlauben räumliche Analyse der Proteinexpression in der gesamten Kultur präsentieren wir ein Protokoll für die Isolierung, Expansion und serielle Schnitte von postnatalen Hippocampus Neurosphären für epifluoreszenten oder konfokalen Immundetektion der Zielproteine. Connexin29 (Cx29) wird als Beispiel analysiert. Anschließend mit einem Hybrid aus Grafik-Bearbeitung und 3D-Modellierung Software rigoros angewendet, um biologische Detail zu halten, beschreiben wir, wie der Zusammenbau des 3D strukturelle Positionierung der Bilder und digital map markierten Zellen innerhalb der gesamten Neurosphäre. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung und Analyse der zellulären Position von Target-Proteinen und Zellen über die gesamte 3D-Topographie und Kultur wird eine detailliertere Analyse der räumlichen Beziehungen zwischen den Zellen im Laufe der Neurogenese und Gliogenese in vitro zu erleichtern.

Beide Imbeault und Valenzuela gleichermaßen beigetragen und sollte als gemeinsame Erstautoren werden.

Protocol

1. Isolierung von neuralen Vorläuferzellen

Keep Gewebe und Lösungen Kälte zu jeder Zeit während der Isolierung Protokoll!

1. Vor Beginn Ihrer Kulturen, bereiten Sie das folgende Stammlösungen:
   • Dissoziation Medien (26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,1 mM CaCl ₂ · 2H ₂ O, 3,2 mM MgCl ₂ * 6 H ₂ O, 10 mM D-Glucose, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / mL . Streptomycin Sterilfilter und speichern in 10-15 ml Aliquots bei -20 ° C. Bereiten Lager Konzentrationen von Enzymen für die zelluläre Dissoziation in doppelt destilliertem H ₂ O, Sterilfilter und speichern Aliquots bei -20 ° C verwendet: Neural-Protease (25 mg . / mL), Papain (10 mg / mL), DNAseI (10 mg / mL) Am Tag des Experiments, fügen Enzyme zu 15 ml Dissoziation Medien an der folgenden Endkonzentrationen: 1 mg / mL Protease, 0,1 mg / mL Papain, 0,1 mg / ml DNase I. Dissection Lösung endgültige Enzym-Konzentrationen können auf dem Eis während der Dissektion Prozess gehalten werden.
   • Wartung Media: Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium F12 (DMEM/F12), 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 1X B27 ergänzen. Gehalten werden kann für bis zu 3 Monate bei 4 ° C ohne B27 ergänzen und bis zu einem Monat bei 4 ° C mit B27 ergänzen.
   • Wachstumsfaktoren: Bereiten Lager Aliquots von 0,1 ug / ml humanen rekombinanten epidermal growth factor (hEGF) und 10 pg / mL Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) in DMEM/F12 + 0,1% Rinderserumalbumin (BSA). Lagerung bei -20 ° C.
2. Um tödlich betäuben C57BL / 6 Maus Welpen sind Mäuse intraperitoneal mit Euthansol injiziert am postnatalen Tag 0-3.
3. Entfernen Sie vorsichtig Gehirne von Standard-Dissektion und an einem 60 mm Schale mit künstlicher Liquor (ACSF: 26 mM NaHCO _3, 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl ₂ · 2H ₂ O, 1,3 mM MgCl ₂ * 6 H ₂ O , 10 mM D-Glucose, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / mL Streptomycin). pH auf 7,3, wenn notwendig und Sterilfilter in 50 mL Aliquots bei -20 ° C.
4. Mit einer Rasierklinge, Block Gehirn, indem das Kleinhirn und Leim Gehirn mit Krazy Glue, rostral nach oben, Rücken-Seite nach oben zeigt, auf die Vibratom Futter. Ein Leica Microsystems VT1000S Vibratom ist in diesem Protokoll verwendet.
5. Position Futter in der Vibratom und fügen ACSF und Eis in die richtige Fächer.
6. Cut Scheiben von 500 um Dicke mit einer Geschwindigkeit zwischen 3,5 bis 4,5 und die Frequenz von 8,5.
7. Sammeln Scheiben mit dem Hippokampus in Schalen mit ACSF.
8. Mit einem Stereomikroskop, entfernen hippocampi zwischen Bregma -1,60 mm und -2,40 mm (bis CA3 Region beginnt Kurve ventral) und in eine neue trockene Schale (ohne ACSF). Ein Leica MZ6 Präpariermikroskop ist in diesem Protokoll verwendet.
9. Sobald alle hippocampi erhoben werden, Hackfleisch Gewebe mit dem Skalpell (bis eine homogene und Flüssiggas Erscheinungsbild erreicht wird).
10. Transfer zerkleinerten Gewebes in ein 15 ml Polypropylen-Röhrchen mit 2,5 ml Dissoziation Medien mit neuronalen Protease, Papain und DNAse I (siehe Schritt Nr. 1 zur Herstellung Vorbereitung). Beachten Sie, wenn es eine Menge von Quelle Gewebe (z. B. von 6 Welpen) ist es eine gute Idee, 2 Flaschen von 2,5 mL Dissoziation Medien nutzen, um eine optimale Enzym zu erhalten: Gewebe-Verhältnis. Bei 37 ° C für 45-60 min mit Rotation. Ein Labnet ProBlot 6 Hybridisierungsofen (erworben durch Mandel Scientific) wird in diesem Protokoll festgelegt, um die Drehung Einstellung 4 verwendet.
11. Fügen Sie 10 ml sterile Gewebekulturen Kaliumphosphat Kochsalzlösung (KPBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) und bei 300 g zentrifugiert für 5 min. Ein Eppendorf-Zentrifuge (Modell 5702) ist in diesem Protokoll verwendet.
12. Überstand verwerfen und Pellet in 5 ml KPBS.
13. Distanzieren Gewebe durch Verreiben durch eine Pasteurpipette.
14. Centrifuge Zellsuspension bei 300 xg für 5 min.
15. Die Zellen in 3 ml Medium Wartung, count Zellen mit Trypanblau und Platte-Zellen in 60 mm nicht haftenden Speisen (Corning Ultra-Low Einhaltung verbindlicher Gerichte in diesem Protokoll verwendet werden, siehe auch Material) bei einer Dichte von 2,5 x 10 ⁵ Zellen / Schale in 5 ml Medium Wartung. Petrischalen kann an Stelle von Ultra-Low Einhaltung Speisen verwendet werden, sondern Kulturen benötigen, um in der Früh und am Nachmittag angezapft werden jeden Tag während der Expansion in den ersten 6 Tagen in vitro (DIV), um Beschichtung und spontane Differenzierung zu verhindern.
16. Add hEGF, um eine endgültige Konzentration von 20 ng / mL und FGF-2 in einer Endkonzentration von 10 ng / mL sofort nach der Beschichtung. Fügen Sie zusätzliche Wachstumsfaktoren alle zwei Tage während der Expansionsphase bis zur Abholung Tag DIV 14. (Scale Bars in Video zu erweitern Neurosphären repräsentieren 100 um.)

** Hinweis: Medien können sich gelb rund DIV 10 der Expansionsphase. Wenn dies der Fall, fügen Sie eine weitere 1 mL Maintenance Medien. Wenn Medien wieder gelb am nächsten Tag, fügen Sie eine weitere 1 ml Wartung Medien - Halten Sie tun dies als notwendig, während Ihre Expansionsphase - erinnern Sie sich, um die Lautstärke von Wachstumsfaktoren entsprechend anpassen, um die korrekte Endkonzentration zu erhalten.

2. Serielle Kryoschneiden

1. Tippen Sie auf Neurosphären sanft vor der Fixierung, um sicherzustellen, Kugeln sind zum Zeitpunkt der Fixierung gut getrennt.
2. Add molekularen grade Formaldehyd direkt an den Kulturen, um eine Endkonzentration von 3,7% und bei Raumtemperatur inkubieren (RT) für 20 min bei langsamen Schütteln. Ein Stovall Belly Dancer ist in diesem Protokoll auf eine Drehzahl von 2,5 verwendet.
3. Sammeln Neurosphären in einem 15 ml Polypropylen-Röhrchen und Spin-down bei 300 xg für 5 min.
4. Überstand verwerfen und Pellet in 10 mL Natrium-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (nPBS: 154 mM NaCl, 10 mM Phosphat-Puffer). Beachten Sie die Änderung in Lösung Nutzung von KPBS zu nPBS.
5. Spin down bei 300 xg für 5 min.
6. Resuspendieren in 5-10 mL 20% Saccharose (w / v) Lösung in nPBS.
7. Keep Neurosphären bei 4 ° C für mindestens 24 h zu den Kulturen cryoprotect.
8. Füllen Sie eine Wegwerf-cryomold mit Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindung.
9. Vorsichtig gießen Sie die Saccharose-Lösung mit Neurosphären in eine Schale.
10. Verwenden Sie ein Stereomikroskop repräsentativ Kugeln in verschiedenen Größen mit den geringsten Beweis für mechanische Störungen zu lokalisieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens zum ersten Mal, können einige Kulturen gebrochen oder gerissen werden. Morphologie wird schön mit der Praxis eingehalten werden.
11. Vorsichtig absaugen jeder Neurosphäre in eine 1 ml Pipettenspitze (halten Sie die Lautstärke von Saccharose enthalten-Lösung entfernt auf ein Minimum) und platziere sie in den OCT-Verbindung. Mark Ihren ungefähren Standort auf der Form, so dass Sie die Kugeln später finden können.
12. Sobald Sie ein paar Kugeln in die cryomold platziert, flash-freeze die Proben unter Verwendung von CO _2, bis OCT ist weiß.
13. Markieren Sie die Position Ihres Kugeln auf den Würfel und Pop der Würfel aus der Form
14. Mit vorgekühlten Pinzette, legen Sie die Würfel auf einem Stück Filterpapier zuvor mit einem Futter mit OCT gesichert.
15. Legen Sie mehr OCT-Verbindung rund um den Würfel und einfrieren, um den Block mit den Kugeln mit CO ₂ zu halten. Alternativ statt des Futters (mit Filterpapier) in den Kryostaten, spritzen OCT-Verbindung auf ein Filterpapier und Ort cube direkt in Oktober Warten Sie, bis OCT ist weiß und hart. Ein Leica CM1900 Kryostaten ist in diesem Protokoll verwendet.
16. Sobald die OCT-Verbindung wird weiß, können Sie das Futter auf den Schneidblock Ort, warten Sie dann mindestens 30 min für die Temperatur ins Gleichgewicht.
17. Cut serielle 10 pm Abschnitte der Suche nach Ihrer Marken und Prüfung oft unter einem Mikroskop für Neurosphäre Abschnitten. Legen Sie so viele Bereiche wie möglich auf eine Folie. Beachten Sie möglicherweise nicht in der Lage, die ersten paar Scheiben Ihres Neurosphäre unter den Anwendungsbereich, so sammeln Sie alle Abschnitte, bis Sie Zellen finden und halten 3-5 Abschnitten vor diesem Anfang und am Ende Ihrer Kugel zu sehen. Diese vorderen und hinteren Abschnitte werden auch für die Immunzytochemie verarbeitet werden. Ein nuklearer Gegenfärbung bei der Durchführung von Immunfärbung ist daher der Schlüssel, wie es Ihnen erlaubt, einzelne Zellen an der Neurosphäre Pole nicht ohne weiteres ersichtlich unter Standard invertiert Phasenmikroskopie erkennen.
18. Shop Abschnitte bei -20 ° C.

3. Immunzytochemie

1. Die Objektträger aus -20 ° C und auftauen, indem nPBS sanft über alle Bereiche und Inkubation bei RT für 5 min.
2. Flick überschüssige nPBS und sofort anwenden Primärantikörper in Ab-Puffer (0,3% Triton X-100, 0,3% Rinderserumalbumin in nPBS, pH 7,2). Sie benötigen ca. 100 ul pro Folie. In diesem Protokoll, lokalisieren wir Cx29 in diskreten NPC Nachkommen in 3D Neurosphäre Kultur.
3. Deckel mit Parafilm geschnitten, um die Abschnitte behandeln, aber nicht auf die Größe des Objektträgers überschreiten als Antikörper wird ausgeschaltet werden der Schlitten durch Osmose gezogen, wenn die Parafilm erreicht oder überschreitet die Breite der Folie. Der Parafilm verhindert Verdunstung. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C in einer feuchten Kammer. Achten Sie auf die Parafilm über die Sektionen schwimmen und lassen Sie es nicht auf der Folie haften. Jedoch nicht zu entfernen oder zu verändern Parafilm Platzierung einmal angewandt, als darauf zu achten, keine Querkraft auf die Abschnitte, und dadurch stören Morphologie werden.
4. Add ~ 1 mL nPBS direkt zu Abschnitten und Schwimmer aus dem Parafilm. Alternativ statt der Folie vertikal direkt in einem Coplin Glas, bis die Parafilm schwimmt weg. Entfernen Sie nicht die Parafilm, bis er weg schwimmt unabhängig von Manipulation, wie Sie fragile Neurosphäre Struktur stören könnte. Sobald die Parafilm ist aus der Folie, inkubieren 5 min bei RT. Flick off nPBS und fahren Sie mit 3 weitere Wäschen bei RT für 5 min.
5. Bewerben sekundären Antikörper in Ab-Puffer und Inkubation bei RT verdünnt für 1h in einer feuchten Kammer, wie oben beschrieben. Sie werden wieder benötigt ~ 100 ul / gleiten.
6. Wiederholen nPBS wäscht in Schritt 4. Tragen Sie eine nukleare Gegenfärbung in der ^3. waschen (Hoechst 33258 0,5 ug / mL in nPBS) für 5 min und fahren Sie mit dem letzten Waschen für 5 min bei RT.
7. Montieren Sie in Ihrer bevorzugten anti-fade Montage Medien und Deckglas, die Sicherung der Deckgläschen mit Nagellack zuerst in den Ecken dann alle an den Rändern zu verhindern Verlust (bei Verwendung eines Glycerin-basierten Medien).
8. Gehen Sie zur Bild-Sammlung mit einer epifluoreszenten oder konfokalen Mikroskop. In diesem Protokoll, verwenden wir eine Leica DMRA2, ein Hamamatsu Orca ER Kamera und OpenLab v3.56 Software. In diesem Beispiel werden die Bilder auf drei Kanälen erfasst: (1) Phase-Kontrast, (3) Blau UV (Leica A4 cube: Filter-Kombinationen Ex 360/40, Di 400, Sp BP470/40) und Rot (Leica Y3 cube : Filter-Kombinationen Ex BP535/50, Di 565, Sp. 610/75). Schießen Sie jeden seriellen Abschnitt aufmerksam auf die erste und die letzten Abschnitte durch die Verfolgung der Pole mit Hoechst 33258 Kennzeichnung von DNA, wo Phasenerkennung von einzelnen Zellen ist schwierig.

4. Ausrichtung

1. Wenn der Gefrierschnitte auf das Mikroskop Linien Tauwetter montiert sind, werden sie sich bewegen und drehen sehr leicht. Diese Abweichungen müssen korrigiert werden. Außerdem, wenn jeder seriellen Schnitt abgebildet ist, kann das Zentrum eines jeden Bildes nicht in der gleichen Position auf dem Bildschirm sein. Als Ergebnis muss jeder digitalisierten serielle Abschnitt sorgfältig mit dem vorhergehenden Abschnitt, um genaue Morphologie erhalten neu ausgerichtet werden. Diese Ausrichtung erfordert eine sorgfältige und präzise auf Zytoarchitektur und topographische Details.
2. Serielle Bilder der einzelnen Kanäle und Wohnsitz Maßstabsbalken von 10 um und 50 um (gegründet OpenLab v3.56 Software) werden als einzelne TIFF-Dateien gespeichert und importiert in Photoshop CS4 mit einem Standard-Leinwand Größe von 3300 x 2550 Pixel und einer Auflösung von 72 Pixel / Zoll. Sorgfältige Aufmerksamkeit auf Leinwand Größe muss in diesem Import genommen werden, um eine genaue Waage zu halten. Die Leinwand Größe und Auflösung sind der Schlüssel zur späteren Modellierung in Maya. Der Maßstab, als separate Schicht in Photoshop gespeichert, sollten verwendet werden, um sicherzustellen, dass keine Änderungen an der XY-Abmessungen bei der Ausrichtung in Photoshop auftritt.
3. Als nächstes verbinden die drei (oder mehr) Schichten entsprechend dem selben Abschnitt (dh Verknüpfung jeder Phase, UV-und Cy3 Bildserien für jeden Abschnitt). Dadurch wird sichergestellt, dass, wenn eine Schicht ausgerichtet ist, anderen Schichten mit dem betreffenden Abschnitt verknüpft sind auch zur gleichen Zeit ausgerichtet. Alternativ können Sie die Phase Schicht einmal lock in die entsprechende Position (siehe unten) und richten Sie dann die damit verbundenen Schichten des Abschnitts, um die Phase-Schicht.
4. Um zu beginnen, um alle Ebenen unsichtbar, indem Sie das "Auge"-Symbol in der Ebenen-Fenster.
5. Drehen Sie den ersten und zweiten Phase kontrastreiche Bilder der Neurosphäre Schnittserien auf, indem Sie auf das "Auge"-Symbol in der Ebenen-Fenster. Erhöhung der Transparenz des zweiten Abschnitts. Unter der Registerkarte "Bild", öffnen Sie "Bilddrehung" und wählen Sie "willkürlich". Drehen Sie den zweiten Abschnitt, bis Sie in der Lage, Punkte von geometrischen und strukturellen Kontiguität zwischen den Bildern zu identifizieren. Es ist hilfreich, hin und her zu vergleichen mit UV-Kanal (Hoechst 33258-markierte Abschnitte).
6. Wiederholen Sie dies für alle nachfolgenden Schnittserien Vergleich "nächsten Nachbarn" (dh der unmittelbaren vorderen Abschnitt mit den unmittelbaren hinteren Abschnitt), bis alle Teile und alle Kanäle exakt ausgerichtet sind.
7. Erstellen Sie ein Flugzeug in Maya v10, dass der gleichen Proportionen wie die Photoshop-Datei ist.

5. Zell-Typologie

1. Von der Statuszeile des Maya-Benutzeroberfläche, ändern Sie die Menüleiste von der Standardeinstellung Zeichentrick Einstellung auf Oberflächen.
2. Verwenden Sie eine primitive Unterteilung Kugel zum Zellkörper zu schaffen.
3. Mit dem Neurosphäre ausgewählt, beginnt eine Manipulation ihrer Ecken durch Klicken mit der rechten Maustaste auf das Objekt und wählen Vertex aus dem Marking Menu. Weitere aufwendige der Oberfläche der Kugel, indem Sie die Display Level aus dem Marking Menu.
4. Von der Subdivision Surfaces Register des Hauptmenüs, öffnen Sie die Collapse Hierarchy Optionen-Box und stellen Sie die Anzahl der Ebenen 2. Collapse die Kugel.
5. Ändern Sie in der Menüleiste von Oberflächen, um Polygone.
6. Mit der Kugel ausgewählt, öffnen Sie die Sculpt Geometry Tool aus dem Netz auf der Registerkarte Hauptmenü.
7. Verfeinern der Oberfläche der Zelle zu ihrer endgültigen Form unter Verwendung der Sculpt Geometry-Toolset aus der Werkzeug-Einstellungen.
8. Wiederholen Sie diesen Vorgang für verschiedene Zellkörper zu schaffen, um die Vielfalt der NPCs und NPC Nachkommen in der Neurosphäre simulieren. In dieser Demonstration bilden zehn verschiedenen Zellkörper die Grundlage für die Neurosphäre.
9. Markieren Sie die Zelle Typologie und Freeze-Transformationen.
10. Mit den Zellen der Typologie aufgestellt werden zwei Oberflächen-Shadern entwickelt, um sowohl Zellen, die zu vertretendas Protein von Interesse (in unserem Beispiel Cx29-positive Zellen) und Zellen, in denen das Protein fehlt. Hier ist jede Zelle mit Cx29 Immunreaktivität bezeichnet Cx29-positiv. In diesem Beispiel ist subzelluläre Lokalisation nicht modelliert, obwohl eine solche Analyse ist mit Änderungen an den Shadern möglich.
11. Öffnen Sie die Hypershade Fenster aus dem Windows> Rendering Editors Register des Hauptmenüs.
12. Wählen Sie einen Ramp Shader aus der Oberflächenmaterialien Registerkarte.
13. Öffnen Sie die Attribute Editor und setzen Sie den Shader Color, Incandescence, Ambient Color, Bump Map, und Glanzfarbe Attribute.
14. Weisen Sie eine Brownsche 3D-Texturen, die Ambient Color-Knoten und einem 2D-Fractal Textur auf die Bump Mapping-Knoten.
15. Wählen Sie die resultierende Shader Ein-und Ausgänge und exportieren Sie die ausgewählten Netzwerk.
16. Markieren Sie die Zelle Typologie und öffnen Sie die Export Auswahlmöglichkeiten angezeigt.
17. Wählen Sie den Dateityp mayaAscii und deaktivieren Sie das Include diese Eingänge ein. Export Selection.

6. Zell-Mapping

1. Öffnen Sie die Ausrichtung Schnittserien Datei in Photoshop CS4.
2. Stellen Sie eine Taste der Bleistiftstriche auf die Standorte der einzelnen Progenitorzellen in die serielle Abschnitte zu markieren. In dieser Demonstration, ein Schlüssel mit drei Strichen - ein ausgefülltes Quadrat, ein Quadrat mit einer gestrichelten Linie und ein Quadrat mit einem Kreuz - wird verwendet, um anzuzeigen, ob eine Zelle in ein, zwei oder drei Abschnitte befindet. Dieser Schlüssel von Schlaganfällen wird durch Farbe definiert - in diesem Beispiel stellt roten Zellen, die unsere Protein von Interesse, Cx29 und Weiß stellt nicht exprimieren Cx29.
3. Drehen Sie den Phase-Schicht auf und beginnen Kennzeichnung der Mitte jedes Progenitorzellen mit einem weißen Stift Schlaganfall. Verwenden Sie eine separate Ebene im Bereich Ordner, mit denen Sie Ihre Karten zu bauen.
4. Umschalten zwischen Abschnitten, um die Zellen zu positionieren dafür, dass Zellen, die auf mehr als einen Abschnitt richtig bezeichnet sind zu finden.
5. Mit der Cx29-Schicht eingeschaltet ist, wählen Sie die Zellen, die in den Regionen, in denen Cx29 positiv ausgedrückt wird fallen.
6. Wählen Sie die Fill-Befehl im Bearbeiten-Registerkarte im Hauptmenü Photoshop bar und ändern Sie den weißen Strichen auf rot.
7. Mit den Karten abgeschlossen haben, speichern jeden Abschnitt als separate JPEG-Bild in der sourceimages Ordner des Maya-Projekt. Um dies zu tun, wird ein neues Maya-Projekt erst geschaffen werden.

7. Importieren und Assembling Karten in 3D

1. Von der Statuszeile des Maya-Benutzeroberfläche, ändern Sie die Menüleiste von der Standardeinstellung Zeichentrick Einstellung Polygone.
2. Importieren Sie die planes.mb und scaleBar.mb Dateien aus dem Ordner Projekte Szenen.
3. Mit dem Flugzeug ausgewählt, weisen Sie einen Lambert-Shader, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Objekt und die Öffnung der Weisen New Reiter Material.
4. In den Attribute Editor klicken Sie auf das karierte Feld rechts der Materialien Farbe Attribut.
5. Aus dem Pop-up-Menü wählen Sie Datei aus dem 2D-Texturen Abschnitt.
6. Unter dem File Attributes Abschnitt in der Attribut-Editor, klicken Sie auf das Datei-Icon auf der rechten Seite des Bildes Name-Attribut.
7. Wählen Sie im ersten Abschnitt aus dem sourceimages Ordner.
8. Schalten Sie die Kamera des Workspace-Fenster aus der Perspektive im Hinblick auf die Standard-orthographische Ansicht von oben durch das Öffnen des Panels Registerkarte.
9. Wählen Sie das Polygon-Werkzeug aus dem Register Mesh des Hauptmenüs und die Umrisse des Abschnitts.
10. Wählen Sie die erste Karte aus dem sourceimages Ordner und weisen Sie auf das neu erstellte Polygon Flugzeug folgenden Schritten eingerichtet, um das Polygon Flugzeug zu schaffen.
11. Mit dem Ziel ausgewählt haben, wählen UV aus dem Marking Menu, indem Sie mit der rechten Maustaste über der Ebene.
12. Wählen Sie alle Ebenen UV Punkte und öffnen Sie die UV Texture Editor aus dem Windows-Register des Hauptmenüs.
13. Skalieren Sie die proportional der UV-bis in die Schnittebene zu passen.
14. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abschnitt des Neurosphäre sicherzustellen, dass die Räume zwischen jedem Abschnitt, um die Höhe der Skala bar entsprechen.

8. Locating Progenitorzellen Typologien in 3D

1. Von der Statuszeile des Maya-Benutzeroberfläche, ändern Sie die Menüleiste von der Standardeinstellung Zeichentrick Einstellung Dynamics.
2. So dass nur der erste Abschnitt des Neurosphäre sichtbar, verstecken alle anderen Abschnitte, indem Sie die Display-Einstellungen von der Registerkarte Anzeige des Hauptmenüs.
3. Mit dem CV Curve-Tool die Optionen zu öffnen, wählen Sie 1 Linear aus dem CV Curve Settings.
4. Anzeigen der Szene aus dem Top Rückfahrkamera, beginnen die Zuordnung verweist auf die Zelle Karten schaffen eine Kurve für die Cx29-negativen Zellen und eine für die Cx29-positiven Zellen.
5. Die resultierenden Kurven sind flach, wenn aus einer Seitenansicht Kamera betrachtet. Richten Sie die Dicke der Schnitte durch eine Verschiebung der Punkte der Kurve in der y-Achse mit dem Maßstab von der Mikroskopie-Aufnahmen als Leitfaden importiert.
6. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abschnitt des Neurosphäre.
7. Importieren Sie die cellTyoplogy.ma Datei aus dem Ordner Szenen des Projekts und duplizieren die Zelle Typologie sowohl für die Cx29-negative und Cx29-positiven Zellen innerhalb der Neurosphäre.
8. Öffnen Sie die Hypershade Fenster aus dem Windows> Rendering Editors Register des Hauptmenüs.
9. Importieren Sie die zuvor erstellten Shader Zuordnung zu den Zellen der Typologie.
10. Von der Outliner-Fenster, entfernen Sie den Dateinamen aus Anfang der importierten Objekte. Dies wird in späteren Phasen der Modellierung wichtig.
11. Wählen Sie die Registerkarte Partikel aus dem Hauptmenü und ein Partikelemitter zum ersten CV Curve.
12. Öffnen Sie die Registerkarte particleShape1 und unter Emission Attribute ändern Max Graf von -1 bis die Anzahl der Punkte auf die erste Kurve.
13. In den Render Registerkarte Attribute ändern Particle Render Type zu Blobby Surface (s / w). Klicken Sie auf die aktuelle Render Type Feld unten ein und ändern Sie den Radius der Teilchen 0,010.
14. Befestigen Sie die Teilchen auf die Eckpunkte der Kurve, indem Sie zuerst die Partikel dann verschieben Sie die Kurve. Öffnen Sie das Tor Optionen innerhalb der Partikel auf der Registerkarte Hauptmenü und das Ziel gesetzt, Gewicht bis 1. Klicken Sie auf Erstellen.
15. Wählen Sie die Zellen aus Reihe 1 bis 10, um in den Outliner-Fenster und öffnen Sie die Instancer (Ersatz) Optionenbox aus der Partikel auf der Registerkarte Hauptmenü. In der Instanz Objects-Box, sollten alle zehn Zellen in Reihenfolge aufgeführt werden.
16. Wählen Sie die richtige particleShape Namen aus der Dropdown-Liste der Partikel-Objekt zu Registerkarte Instanz. Klicken Sie auf Erstellen.
17. Standardmäßig wird nur die erste Zelle, die ausgewählt wurde ersetzt die Teilchen entlang der Kurve. Um sich alle zehn Typen zu erscheinen und radeln nach dem Zufallsprinzip zwischen den Teilchen, ist ein Ausdruck benötigt. Eine zweite Ausdruck wird sichergestellt, dass die Zellen nach dem Zufallsprinzip emittieren in der gleichen Weise jedes Mal, wenn die Range Slider wird neu positioniert.
18. Mit dem Emitter gewählt, öffnen Sie die Attribute Editor. In der particleShape Registerkarte unter Add Dynamic Attribute auf der Registerkarte Allgemein Feld klicken. Unter Long Name schreiben random_index. In Attribut Type Wechsel von Scalar, um pro Partikel (array) und drücken Sie auf Hinzufügen.
19. In der Per Particle (Array) Registerkarte Attribute hat ein random_index hinzugefügt worden. Klicken mit der rechten Maustaste auf den leeren Raum, wählen Sie Expression ... aus dem Dropdown-Feld.
20. Geben Sie den Text in der Expression: box - particleShape1.random_index = rand (10); if (particleShape1.particleId == 1) Saatgut (1);
21. Zur Vervollständigung der Ausdruck öffnen Sie die Instancer (Geometry Replacement) Registerkarte in den Attribute Editor und in den allgemeinen Optionen> Objekt Index wählen random_index aus der Dropdown-Liste. Bringen Sie den Schieberegler auf den ersten Frame und klicken Sie spielen, sind die Zelltypen nun zufällig unter den Teilchen verteilt.
22. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abschnitt des Neurosphäre. Stellen Sie sicher, dass jeder neue Sender, instancer und zufälligen Index Name ist differenziert und entsprechend in den Outliner Fenster organisiert.

9. Rendering / Compositing

1. In den Render Mit Abschnitt des Render-Einstellungen-Fenster, ändern Sie den Renderer von Maya Software mental ray.
2. Öffnen Sie die Registerkarte Qualität und unter Raytracing ändern Reflections Einstellung auf Null. Öffnen Sie die Registerkarte Framebuffer und ändern Sie die Colorclip von Raw zu Alpha und deaktivieren premultiply.
3. Öffnen Sie das Channel-Box / Layer Editor und ändern Sie die Layer-Editor Einstellung von Anzeige zu machen.
4. Wählen Sie die importierten Zellen der Typologie und klicken Sie auf das Erstellen neuer Layer und weisen ausgewählte Objekte Symbol.
5. Benennen Sie die Ebene Ambient Occlusion.
6. Klicken mit der rechten Maustaste auf das neu erzeugte Ebene, wählen Sie Eigenschaften aus dem Menü.
7. Auf der rechten Seite des renderLayer Feld auf der Presets-Schaltfläche und wählen Occlusion aus der Dropdown-Liste.
8. Wählen Sie die Registerkarte mib_amb_occlusion1 und ändern Sie die Proben von 16 bis 256.
9. Öffnen Sie das Channel-Box / Layer Editor und unter der Registerkarte Optionen, öffnen Sie die Render Alle Ebenen-Optionen-Box.
10. Wählen Sie Composite-und halten Schichten.
11. Mit dem ambientOcclusion Ebene ausgewählt, ändern Sie es von Normal aus dem Dropdown-Feld direkt über der Layer-Liste Multiplizieren.
12. Render zwei Durchgängen der Neurosphäre, einmal mit dem ambientOcclusion Schicht eingeschaltet und einmal mit dem masterLayer eingeschaltet. Speichern Sie die Bilder als IFF-Dateien in den Projekten für Bilder.
13. Öffnen Sie beide Bilder in Photoshop CS4. Legen Sie die ambientOcclusion Schicht auf der Oberseite des masterLayer und setzen Sie ihn auf Multiplizieren. Erstellen Sie einen Hintergrund und glätten das Bild.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Kultur und seriell Gefrier postnatalen Hippocampus NPCs, lokalisieren Proteinexpression durch Immunodetektion und schließlich zu rekonstruieren und zu analysieren, die topographische Lage der immunpositive Zellen innerhalb des gesamten 3D-Neurosphäre. Durch die Kombination zellbiologischer Kultur-und Verarbeitungstechniken, Mikroskopie (OpenLab, Improvisation und andere Bildanalyse Software), Grafik-Editing-Software-Kapazitäten (Adobe Photoshop) und 3D-Animation und Compositing-Software-Kapazitäten (Autodesk Maya), präsentieren wir eine Methode zur Rekonstruktion gesamte zelluläre Zusammensetzung von 3D-Kulturen aus serielles 2D-Bilder ermöglicht die originalgetreue Rekonstruktion der zellulären Position und Protein-Expression während einer Neurosphäre Kultur. Dieses Protokoll kann mit der gleichen Effektivität, um die Registrierung und die Rekonstruktion der epifluoreszenten dünne Schnittserien oder konfokalen Z-Stapel durch dickere Schnittserien kombiniert werden. Da klonale Expansion einzelner NPCs in Neurosphäre Kultur rekapituliert viele der Stufen im Laufe der Neurogenese und Gliogenese in postnatalen Gehirn beobachtet, stellt die Auswirkungen seiner 3D-Struktur ein wichtiger NPC Schicksal bestimmend in Nachkommen ausgesetzt, um die gleichen experimentellen Milieu ^1. Divergenz in Linie und Protein-Expression im Kern und Peripherie von seriellen Neurosphäre Abschnitte darauf hin, dass mehrere physische Faktoren wie Zell Lage, mechanische Belastung und Querkraft spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der NPC Biologie ^2. Darüber hinaus hat Connexin-Protein-Expression, hier analysierten, wurde gezeigt, dass sich je nachdem, wann NPCs sind als 3D-Neurosphären in Suspension oder vergoldet auf Laminin Substrat mit funktionellen Connexin-vermittelter Kommunikation verändert, ob die Zellen auf Kunststoff-und Substrat oder in 3D-frei sind kultivierte kultivierten -schwimmende Kulturen ^3. Die Auswirkungen der zellulären Position auf NPC Schicksal bleibt unklar. Es ist technisch anspruchsvoll, um Auswirkungen der räumlichen Lage innerhalb 3D-Kultur zu analysieren auf NPC Biologie gegeben, dass antigenen Beurteilung der Abstammung und Signalproteine ​​Störung der 3D-Architektur zu Zellpermeabilisierung und Antikörper-Zugriff auf alle Zellen zu aktivieren muss. Hier zeigen wir, dass ein Hybrid-Visualisierung Methodik ein Mittel zur Bestimmung, ob bestimmte Proteine ​​einzigartigen Positions-Lokalisierungen Ausstellung in 3D-Kultur bietet, kann man folgern, und testen Protein Funktion und Regulation im Hinblick auf regionale Lokalisation innerhalb der Neurosphäre werden, und, was vielleicht am wichtigsten , bietet die Positionsdaten benötigt, um die Auswirkungen der 3D-Topographie und zellulären Positionierung auf NPC Schicksal in 3D-Kultur zu studieren.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Euthansol	Reagent	Merck & Co.
Krazy Glue	Reagent	Home Hardware
VT1000S vibratome	Equipment	Leica Microsystems
Neural protease	Reagent	Sigma-Aldrich	P6141	Stock solutions stored at -20°C
Papain	Reagent	Sigma-Aldrich	P4762	Stock solutions stored at -20°C
DNAse I	Reagent	Roche Group	11 284 932 001	Stock solutions stored at -20°C
MZ6 Dissecting Microscope	Equipment	Leica Microsystems
ProBlot 6 Hybridization Oven	Equipment	Labnet International
Centrifuge 5702	Equipment	Eppendorf
kPBS	Reagent	BioShop Canada	PBS404
B27 Supplement	Reagent	Invitrogen	17504-044
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes	Disposable	Corning	3261
Human Epidermal growth Factor	Reagent	Invitrogen	13247-051	Stock solutions stored at -20°C
Fibroblast growth factor-2	Reagent	Invitrogen	13256-029	Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C
37% formaldehyde (molecular grade)	Reagent	Sigma-Aldrich	F8775
Belly Dancer Shaker	Equipment	Stovall Life Sciences, IBI Sciences
Tissue- Tek Cryomold	Disposable	Sakura Finetek	4566
Tissue-Tek OCT compound	Reagent	Sakura Finetek	4583
Whatman Grade 703 Blotting Paper	Disposable	VWR international	28298-020
CM1900 Cryostat	Equipment	Leica Microsystems
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody	Reagent	Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch		Stored 1:1 in glycerol at -20°C
H–chst 33258	Reagent	Sigma-Aldrich	861405
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56	Equipment/ Software	Leica Microsystems		This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope.
Photoshop CS4	Software	Adobe		Graphic software
Maya v10	Software	Autodesk		Modeling software
Computer	Equipment	Intel		Processor: Intel Corei7 920, Memory:12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM)
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.