在这里,我们描述了如何产生,扩大,并在三维(3D)培养的immunolabel产后海马神经祖细胞(筹备)。接下来,使用混合可视化技术,我们将演示如何immunolabelled冰冻切片的数字图像,可用于重建和地图的整个3D神经球免疫阳性细胞的空间位置。
3维(3D)影响神经干细胞和祖细胞的地形的重要性(人大)的表型是广泛承认具有挑战性的研究。当从胚胎或产后脑分离,单一的NPC将悬浮液中扩散,形成神经球。这些文化内的子细胞自发地在扩张的过程中,尽管被暴露在相同的外环境采取不同的发展谱系(神经细胞,少突胶质细胞和星形胶质细胞)。本阶段的进展概括许多观察到的神经发生在产后脑gliogenesis的过程,往往是用于在受控环境中的基本全国人大生物学研究。然而,评估的3D地形和蜂窝定位在全国人大命运这些文化的影响是困难的。要本地化靶蛋白和免疫细胞化学法确定的全国人民代表大会的谱系,自由浮动的神经球必须在基板上镀,或连续切片。这种处理是必需的,以确保整个球体相当于细胞通透性和抗体访问。因此,冰冻切片或三维的Z -堆叠共聚焦重建的二维啶图像,只能提供关于细胞位置的空间信息在离散的物理或数字化三维切片和不完整的领域可视化的细胞位置。在这里重申的神经球文化的地形,并允许在整个文化蛋白表达的空间分析,我们提出一个孤立的协议,扩展,和产后适合啶或焦靶蛋白的免疫检测海马神经球连续切片。 Connexin29(Cx29)为例分析。接下来,使用混合图形编辑和三维建模软件严格的应用,以保持生物的细节,我们介绍了如何重新组装这些图像的三维结构定位和数字地图内标示完整的神经干细胞。这种方法使整个3D的文化地形的靶蛋白和细胞的细胞位置的可视化和分析,将有助于一个更详细的分析,对在体外的神经发生和gliogenesis过程中细胞之间的空间关系。
Imbeault和巴伦苏埃拉同等贡献,并应考虑共同第一作者。
该协议描述了一个程序,以文化和串行cryosection产后海马的NPC,本地化免疫检测蛋白的表达,并最终重建和分析免疫阳性细胞在整个三维神经球的地形位置。通过结合细胞生物学文化和加工技术,显微成像(的OpenLAB,即兴创作和其他图像分析软件),图形编辑软件的能力(Adobe Photoshop的),三维动画和合成软件能力(Autodesk Maya中),我们提出了一个方法,重建整个细胞成分允许蜂窝整个神经球文化的地位和蛋白表达的忠实重建序列的二维图像的三维文化。此协议可结合登记和重建啶薄连续切片或通过较厚的连续切片,共聚焦ž栈具有同等的效力。因为单一的NPC在神经球以上的神经发生在产后脑gliogenesis过程中所观察到的许多阶段的文化概括克隆扩增,其三维结构的影响的重要全国人大代表在后代的命运的决定因素, 暴露在相同的实验环境1。血统和蛋白表达的核心和外围串行神经干节的分歧表明,多个物理因素,包括单元格的位置,机械应力和剪切力,发挥重要的作用,在调节全国人大生物学2。此外,缝隙连接蛋白的表达,分析在这里,已经显示出更改后,当NPC的3D神经球悬挂或层粘连蛋白与功能连接蛋白介导的通信的改变是否在塑料基板或3D免费培养细胞的基板上镀培养浮动文化3。蜂窝位置全国人大命运的影响仍不清楚。这在技术上是具有挑战性的,在3D的文化血统和信号蛋白的抗原性评估需要破坏的3D架构,使所有细胞的细胞通透性和抗体访问的全国生物学分析空间位置的影响。在这里,我们显示,混合的可视化方法提供了一个确定的某些蛋白质是否表现出3D的文化独特的位置本地化的手段,可用于推断和蛋白质的功能和调节神经球内区域本地化测试,以及,也许是最重要,提供了需要研究的三维地形和蜂窝定位在三维培养全国人大命运的影响定位数据。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢专家在视频制作和编辑,马特库克协助数据收集技术援助埃文Dysart和马克莱昂纳尔和萨拉专家社论援助格尔巴德。这项工作是由从加拿大健康研究研究所(CIHR,澳门币62626)SALB,在卫生研究项目资助战略培训计划SALB和SF(CIHR在神经退行性Lipidomics培训计划,TGF 9121),和基础设施运营赠款从加拿大创新基金会和安大略省创新信托到SF的支持。司收到在安大略省科学技术研究生奖学金帕金森研究协会的贡献。 NV接收到一个老龄化研究所和专业奖学金的神经退行性Lipidomics CIHR培训计划。我们非常感谢由AutoDesk公司研究提供的教育软件和技术支持。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Euthansol | Reagent | Schering-Plough Canada Inc. | ||
Krazy Glue | Reagent | Home Hardware | ||
VT1000S vibratome | Equipment | Leica Microsystems | ||
Neural protease | Reagent | Sigma | P6141 | Stock solutions stored at -20°C |
Papain | Reagent | Sigma | P4762 | Stock solutions stored at -20°C |
DNAse I | Reagent | Roche | 11 284 932 001 | Stock solutions stored at -20°C |
MZ6 Dissecting Microscope | Equipment | Leica Microsytems | ||
ProBlot 6 Hybridization Oven | Equipment | Labnet via Mandel Scientific | ||
Centrifuge 5702 | Equipment | Eppendorf | ||
kPBS | Reagent | BioShop | PBS404 | |
B27 Supplement | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | |
Ultra Low Binding Tissue Culture Dishes | Disposable | Corning | 3261 | |
Human Epidermal growth Factor | Reagent | Invitrogen | 13247-051 | Stock solutions stored at -20°C |
Fibroblast growth factor-2 | Reagent | Invitrogen | 13256-029 | Also known as basic fibroblast growth factor (bFGF) Stock solutions stored at -20°C |
37% formaldehyde (molecular grade) | Reagent | Sigma | F8775 | |
Belly Dancer Shaker | Equipment | Stovall | ||
Tissue- Tek Cryomold | Disposable | Sakura | 4566 | |
Tissue-Tek OCT compound | Reagent | Sakura | 4583 | |
Whatman Grade 703 Blotting Paper | Disposable | VWR | 28298-020 | |
CM1900 Cryostat | Equipment | Leica | ||
Polyclonal Anti-Cx29 Primary Antibody | Reagent | Kindly provided by Dr David Paul, Harvard Medical School | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
Cy3-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | Stored 1:1 in glycerol at -20°C | |
Hoechst 33258 | Reagent | Sigma | 861405 | |
DMRA2 epiflourescent microscope, Orca ER camera, OpenLab v3.56 | Equipment/ Software | Leica Hamamatsu Improvision/Perkin Elmer | This protocol can be performed with any epifluorescent or confocal microscope. | |
Photoshop CS4 | Software | Adobe | Graphic software | |
Maya v10 | Software | Autodesk | Modeling software | |
Computer | Equipment | Processor: Intel Corei7 920 Memory: 12GB DDR3 Video card: Nvidia GTX 285 (1GB RAM) |
Modeling hardware |
* All other standard chemical reagents listed in the protocol are from Sigma-Aldrich. All other standard tissue culture reagents are from Invitrogen.