Summary
الكالسيوم هو رسول في كل مكان في الجهاز العصبي ، وضرورية لتحريك الافراج العصبي والتغييرات في قوة متشابك. هنا نظهر تقنية لتحميل كا 2 + - المؤشرات في محطات العصب ذبابة الفاكهة. نظهر أيضا تصنيع أجهزة المطلوبة ، والتأكيد على النقاط الحرجة للنجاح في هذه التقنية.
Abstract
الكالسيوم يلعب أدوارا عدة في الجهاز العصبي ولكن لا شيء أكثر إثارة للإعجاب من حيث الزناد لاطلاق سراح العصبي ، ولا شيء أكثر عمقا من أن رسول ضروري ليونة متشابك التي تدعم التعلم والذاكرة لمزيد من توضيح الأسس الجزيئية للكا 2 + التي تعتمد على آليات متشابك ، لا بد من نموذج النظام على حد سواء ليونة وراثيا ويمكن الوصول إليها من الناحية الفسيولوجية. ذبابة الفاكهة السوداء البطن يوفر مثل هذا النموذج. في هذا النظام ، وراثيا ترميز الفلورسنت المؤشرات المتوفرة لكشف كا 2 + التغيرات في المحطات الطرفية العصبية. ومع ذلك ، فقد تقتصر هذه المؤشرات حساسية للكا 2 + وغالبا ما تظهر استجابة غير خطية. تتلاءم بشكل أفضل المؤشرات لقياس الفلورسنت الاصطناعية كا السريع 2 + التغييرات المرتبطة بالنشاط العصبية. هنا نظهر تقنية لتحميل ديكستران - مترافق الاصطناعية كا 2 + المؤشرات في محطات العصب يرقات ذبابة الفاكهة تعيش في. هناك تركيز خاص على تلك الجوانب من البروتوكول الأكثر أهمية لنجاح هذه التقنية ، مثل كيفية تجنب التصريف الكهرباء الساكنة على طول الأعصاب معزولة ، والحفاظ على الصحة من إعداد أثناء فترات تحميل طويلة ، وضمان بقاء محور عصبي من خلال توفير كا 2 + لتعزيز ختم النهايات محوار مقطوعة. انخفاض تقارب ديكستران - مترافق كا 2 + ، المؤشرات ، مثل fluo - 4 وrhod ، التي تتوفر تظهر إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء في حين تعطيل الحد الأدنى من الكالسيوم قبل المشبكي 2 + الديناميات. ديكستران - اقتران يساعد على منع كا 2 + يجري عزلها المؤشرات في عضيات مثل الميتوكوندريا. ويمكن تطبيق هذه التقنية على حد سواء لتحميل الأجنة واليرقات والبالغين.
Protocol
- حدد طبق تشريح النظيفة التي لم تتعرض إلى أي مثبتات.
- تشريح يتجول 3 يرقة ذبابة الفاكهة الثالثة في طور مرحلي متوسطة ذبابة الفاكهة التي تحتوي على الكالسيوم شنايدر 2 + و L - الجلوتامين ، (لا قطع الأعصاب أو أي ألياف العضلات الضرر رقم 7 ، 6 ، 13 أو 12).
- حدد ملء كوب - ماصة مع طرف ميكرون 12 (القطر الداخلي).
- استخدام حقنة وأنابيب (لتطبيق الضغط السلبي على ماصة) ضمان عدم عرقلة الطرف ماصة.
- حدد غرامة البلاستيك ملء - خيوط التي يمكن إدراجها أسفل طول ماصة الزجاج.
- رسم ~ 1 سم من 5 ملم ، مترافق ديكستران كا 2 + ، مؤشر إلى خيوط البلاستيك.
- قطع كل قطعة الأعصاب.
- دعم ماصة على منحدر من شأنها أن تسمح للطرف ماصة من الاقتراب من خط الوسط البطنية من اليرقة تشريح.
- رسم نهاية القطع من الجرأة في الجزء No.4 ، دون معسر العصب ، في نهاية ماصة (وتشمل كمية صغيرة من متوسطة شنايدر).
- إزالة أنابيب وتضاف خيوط البلاستيك في ماصة حتى نهاية الخيط هو في حدود 50 ميكرون من نهاية قطع العصب (تجنب ملامسة العصب).
- إخراج كافية كا 2 + ، مؤشر على العصب المنتهية لزيادة حجم شنايدر المتوسطة بنحو 33 ٪ (التركيز النهائي ينبغي أن يكون <2mm و). هام -- يجب أن تكتمل في غضون 5 دقائق وهذا من قطع العصب.
- إعداد مكان في الظلام في درجة حرارة الغرفة ، بينما يحمل العصبية.
- بعد 40 دقيقة إزالة كا 2 + ، مؤشر باستخدام خيوط.
- مغادرة ماصة في مكان وملء تماما مع شنايدر المتوسطة الطازجة ، كما سيتم استخدامها لتطبيق هذه النبضات إلى تحفيز الأعصاب.
- السماح للكا 2 + ، مؤشر للتوازن في العصب لا يقل عن 60 دقيقة ، ولكن لا أكثر من 4 ساعات ، قبل أن تبدأ كا 2 + التصوير.
- شطف مع إعداد المتوسطة الطازجة شنايدر كل 30 دقيقة في حين أنه من equilibrating.
- قبل 20 دقيقة من التصوير استبدال شنايدر المتوسطة مع حل NO.6 الدملمف على غرار (HL6 ؛ ماكلويد وآخرون 2002 ، 2003).
- يمكن إضافة L - حمض الغلوتاميك أو الغلوتامات HL6 إلى حل في لتوعي 7mM بعد المشبكي مستقبلات الغلوتامات لمنع العصب أثار تقلص العضلات (ماكلويد وآخرون 2004 ؛. Reiff وآخرون 2002 ، 2005).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma-Aldrich | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | G1626 |
References
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).