Summary
यहाँ हम एक सरल प्रोटोकॉल करने के लिए दिए गए लक्ष्य अनुक्रम के लिए एक यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालय बनाने प्रदर्शित करता है. हम बताते हैं कि इस पद्धति है, जो vivo में Escherichia कोलाई में किया जाता है कार्यात्मक चयन के साथ मिलकर नई enzymatic गतिविधियों को विकसित किया जा सकता है.
Abstract
आनुवंशिक विविधता के कुशल पीढ़ी के एक अमूल्य आणविक उपकरण है कि डीएनए संश्लेषण लेबल के लिए अद्वितीय आणविक हस्ताक्षर बनाने के लिए, या प्रयोगशाला में प्रोटीन विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का प्रतिनिधित्व करता है. यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि किसी दिए गए लक्ष्य अनुक्रम के लिए बड़े (10 11>) उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की पीढ़ी की अनुमति देता है मौजूद हैं. इस विधि ColE1 डीएनए पोलीमरेज़ कम विश्वस्तता संस्करण के द्वारा प्लाज्मिड एन्कोडिंग वांछित अनुक्रम का मैं (मैं वामो पोल) प्रतिकृति पर आधारित है. प्लाज्मिड लक्ष्य ई. के एक mutator तनाव में तब्दील हो जाता है कोलाई और ठोस मीडिया पर चढ़ाया, 0.2 और 1 म्यूटेशनों / केबी, लक्ष्य जीन के स्थान के आधार पर के बीच उपज . उच्च उत्परिवर्तन आवृत्तियों mutagenesis की इस प्रक्रिया की पुनरावृति द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. Mutagenesis के वैकल्पिक तरीकों की तुलना में हमारे प्रोटोकॉल अपनी सादगी के लिए बाहर खड़ा है, के रूप में कोई क्लोनिंग या पीसीआर शामिल हैं. इस प्रकार, हमारे विधि plasmids या अन्य पोल मैं टेम्पलेट्स mutational लेबलिंग या मूल लक्ष्य में मौजूद नहीं है गतिविधियों के विकास के लिए अनुक्रम अंतरिक्ष के बड़े वर्गों का पता लगाने के लिए आदर्श है. तंग स्थानिक नियंत्रण है कि पीसीआर या यादृच्छिक oligonucleotide आधारित विधियों की पेशकश भी लायब्रेरी के विशिष्ट वर्गों के बाद क्लोनिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. यहाँ हम प्रोटोकॉल दिखा कैसे एक यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालय बनाने के लिए प्रदान करते हैं और कैसे स्थापित करने के लिए ई. में दवा आधारित चयन नई जैव रासायनिक गतिविधियों प्रदर्शन म्यूटेंट की पहचान करने के लिए कोलाई.
Protocol
एक रैंडम उत्परिवर्ती लाइब्रेरी की मैं जनरेशन
पोल मैं mediates दीक्षा ColE1 प्लाज्मिड प्रतिकृति (में समीक्षा (1-3) mutagenesis की हमारी विधि ColE1 प्लाज्मिड आसन्न में एक लक्ष्य अनुक्रम रखने के लिए मूल या नकल करने के लिए और यह कम विश्वस्तता डीएनए पोलीमरेज़ मैं व्यक्त कोशिकाओं में प्रचार पर आधारित है. (वामो - पोल मैं) वामो पोल मैं एक उत्परिवर्ती डीएनए पोलीमरेज़ मैं तीन म्यूटेशनों कि प्रतिकृति निष्ठा, अर्थात् I709N (आकृति में एक), A759R (आकृति बी में) और D424A (proofreading निष्क्रिय) 4,5 कमी एन्कोडिंग है . वामो पोल मैं एक ई. कोलाई तनाव, JS200, कि पोल (polA12) मैं (6) के तापमान के प्रति संवेदनशील है एलील में व्यक्त किया है ताकि मैं LF-पोल 37 पर प्रमुख गतिविधि ° के सी. प्रतिकृति बन जाता है एक यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालय की पीढ़ी में प्रतिबंधक शर्तें परिणामों के तहत polA12 कोशिकाओं में लक्ष्य अनुक्रम. mutagenesis संतृप्त 4 संस्कृतियों में अधिक कुशल है कारण है कि अभी भी स्पष्ट नहीं है के लिए, mutagenesis के निरंतर नहीं है. यानी उत्परिवर्तन आवृत्ति रैखिक संख्या के साथ वृद्धि नहीं करता है पीढ़ियों का एक बार संस्कृति संतृप्ति तक पहुँच जाता है, भले ही कोशिकाओं ताजा मीडिया में आगे विस्तार के लिए अनुमति दी जाती है इसलिए, आगे लायब्रेरी के उत्परिवर्तन लोड बढ़ mutagenesis और प्लाज्मिड वसूली का दौर चलने का आवश्यकता है, यहाँ हम LF-पोल मैं mutagenesis के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.. ध्यान दें कि यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल काफी किया गया है हमारे मूल वर्णन 4 रिश्तेदार सरल क्रम में वांछित उत्परिवर्तन लोड (चित्र 1) प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया का चलना की सुविधा.
माल
- कक्ष: recA718 JS200 (टीएस) polA12 uvrA155 trpE65 लंदन-11 Sula
- JS200 WT-पोल: JS200 जंगली प्रकार (WT) पोल मैं व्यक्त कोशिकाओं
- JS200 वामो पोल मैं: JS200 कम (वामो) निष्ठा व्यक्त पोल मैं
- Readout तनाव: JS200 WT-पोल मैं या complementation () के लिए एक विशिष्ट गतिविधि की कमी तनाव
- प्लाज्मिड टारगेट
- लक्ष्य जीन में क्लोन के साथ प्रतिकृति की एक ColE1 मूल युक्त प्लाज्मिड
1. इससे पहले mutagenesis: विद्युत सक्षम JS200 वामो पोल मैं कोशिकाओं की तैयारी
- लेग 30 डिग्री सेल्सियस (अनुमोदक शर्तों) से बढ़ी थाली से एक एकल JS200 वामो पोल मैं कॉलोनी उठाओ रातोंरात प्लाज्मिड असर वामो पोल मैं (0.03mg / एमएल chloramphenicol) के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक चयन युक्त और एक परीक्षण में कॉलोनी जगह लेग की chloramphenicol के साथ 8 एमएल युक्त ट्यूब. 30 में संस्कृति ग्रो डिग्री सेल्सियस और 250rpm पर रातोंरात मिलाते हुए.
- सुबह में, एक chloramphenicol के साथ 400 एमएल लेग युक्त कुप्पी में JS200 वामो पोल मैं 8 एमएल गिरने से संस्कृति का विस्तार. चलो संस्कृति 30 पर बढ़ने डिग्री सेल्सियस जबकि 250rpm में मिलाते हुए जब तक यह एक एक 0.4-0.7 के 600 (आमतौर पर 3-4) तक पहुँचता है.
- एक बार एक एक 0.4-0.7 के 600, 15 मिनट के लिए गीला बर्फ पर संस्कृति ठंडा .
- Centrifugation के लिए एक उपयुक्त कंटेनर के लिए ठंडा संस्कृति स्थानांतरण. Centrifugation द्वारा 4 में गोली कोशिकाओं ° सी. बंद सतह पर तैरनेवाला डालो, और फिर बाँझ और ठंडा गीला बर्फ पर 10% कंटेनर और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग करने के लिए ग्लिसरॉल के 10 एमएल जोड़ें.
- 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में फिर से निलंबित कर दिया कोशिकाओं का स्थानांतरण. शंक्वाकार ट्यूब 10% ग्लिसरॉल के साथ भरें और 45 एमएल निशान तो 4 बजे 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस और 4000rpm.
- सतह पर तैरनेवाला बंद डालो, शंक्वाकार ट्यूब 10% ग्लिसरॉल के एक बार से ज्यादा 10 एमएल जोड़ने के लिए, और एक सीरम वैज्ञानिक या सामान्य विंदुक का उपयोग कोशिकाओं को फिर से निलंबित. फिर, 4 बजे 45 एमएल निशान शंक्वाकार ट्यूब भरने के 10% और 15 मिनट के लिए ग्लिसरॉल अपकेंद्रित्र के साथ डिग्री सेल्सियस और 4000rpm. से अधिक दो बार लवण के सभी निशान हटाने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
- अंतिम स्पिन के बाद, कक्षों की गोली के बराबर 10% हिस्सा ग्लिसरॉल में फिर से निलंबित (यानी 10% ग्लिसरॉल के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं के 2 एमएल फिर निलंबित).
- 100 μL और कई भंडारण ट्यूबों में निलंबित कोशिकाओं के 500 μL के बीच विभाज्य. सूखी बर्फ पर कक्षों त्वरित स्थिर और फिर उन्हें -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस
- विद्युत सक्षम परिवर्तनों के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने से पहले, बर्फ पर धीरे धीरे कोशिकाओं पिघलना.
2. Mutagenesis: प्लाज्मिड लक्ष्य बदलने
- पिपेट विद्युत सक्षम JS200 वामो पोल मैं कोशिकाओं और एक 2mm अंतराल electroporation क्युवेट में लक्ष्य प्लाज्मिड डीएनए के 30-250ng के बीच 40 μL.
# 1 ध्यान दें: एक नियंत्रण के रूप में लक्ष्य जीन के साथ समानांतर में एक ColE1 प्लाज्मिड युक्त GFP mutagenesis के माध्यम से किया जा सकता है है. Readout कदम के पूरा होने के बाद, GFP लेग अगर प्लेटों पर चढ़ाया जा सकता है और mutagenesis के लिए कल्पना. कालोनियों कि अंधेरे या मंद दिखाई निष्क्रिय म्यूटेशन होते हैं. - पल्स electroporator में 1800V पर मिश्रण. समय स्थिरांक (टी सी) की जाँच के लिए प्रत्येक नमूना के लिए एक समान electroporation शर्तों सुनिश्चित; आदर्श टी सी = 5-6 सेकंड .
- लेग शोरबा 1 एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस (Res के 40 मिनट के लिए मिश्रण / सेल डीएनए पुनर्प्राप्तtrictive शर्तों) 250 rpm पर मिलाते हुए.
- प्लेट एक 100mm लेग अगर पेट्री डिश पर 50 μL वसूली संस्कृति के 37 पूर्व गरम डिग्री सेल्सियस दोनों chloramphenicol और एक एंटीबायोटिक प्लाज्मिड लक्ष्य के लिए चयन की एक उपयुक्त एकाग्रता युक्त.
नोट: # 2: "के पास लॉन" एकाग्रता में कोशिकाओं थाली के लिए निशाना लगाओ. ए 'के पास लॉन "एकाग्रता कालोनियों के एक विशिष्ट लेकिन बेशुमार संख्या (> 1000 कालोनियों / 100mm पकवान) के रूप में परिभाषित किया गया है. कमजोर पड़ने, यदि कोई हो, मढ़वाया कैसे विद्युत सक्षम कोशिकाओं रहे हैं पर निर्भर करेगा. यदि कोशिकाओं को बहुत इलेक्ट्रो-सक्षम नहीं हैं और एक "के पास लॉन" वसूली संस्कृति "बधिया", तो 2 मिनट के लिए 4000rpm पर वसूली संस्कृति, अपकेंद्रित्र बंद सतह पर तैरनेवाला डाल, 50 में फिर से निलंबित कोशिकाओं चढ़ाना द्वारा प्राप्त नहीं है लेग शोरबा और संस्कृति की थाली के μL. - पेट्री (ओं) रातोंरात 37 ° dishe सी. सेते
3. Mutagenesis: प्लाज्मिड वसूली
- अगले दिन, कोशिकाओं पर लेग शोरबा के 2 एमएल pipetting द्वारा पेट्री डिश धोने. लेग शोरबा "scrubbing" उन्हें दूर एक निष्फल गिलास त्रिकोण के आकार का छड़ी के साथ थाली लेग अगर पेट्री डिश से बैक्टीरियल कालोनियों के स्थानांतरण. पहले लेग शोरबा के 1 एमएल जोड़ें, धोने को इकट्ठा करने और लेग शोरबा के दूसरे एमएल के साथ प्रक्रिया को दोहराने.
- प्लेट धोने से डीएनए प्लाज्मिड पृथक. (यह प्लाज्मिड डीएनए पुस्तकालय का गठन).
# 3 नोट: लेग थाली से एकत्र धो भी अपनी संपूर्णता में मिनी तैयार करने घना हो सकता है है. यदि यह मामला है, मिनी प्रस्तुत करने का अधिकतम अपने मिनी प्रस्तुत करने किट (आमतौर पर, यह अपने धोने = आयुध डिपो 1 गिराए शामिल है और ~ पतला संस्कृति के 3 एमएल prepping) द्वारा आवंटित राशि या एक मैक्सी प्रस्तुत करने के लिए पैमाने
4. चलना
- प्रतिबंध एंजाइम है कि मैं वामो पोल प्लाज्मिड linearizes के साथ पृथक डीएनए प्लाज्मिड के 1μg प्रतिबंधित है, लेकिन करता प्लाज्मिड कटौती नहीं अपने लक्ष्य (पूरक चित्र 1) है.
- प्रतिबंध पचाने में एक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग कर साफ़.
# 4 नोट: यह कदम प्रतिबंध एंजाइम और उसके बफर के सभी निशान को हटा. इस कदम के बाद विद्युत सक्षम परिवर्तनों के लिए कम नमक एकाग्रता रखने के लिए आवश्यक है. - Mutagenesis के बाद के दौर के माध्यम से पुनः परिणत प्रतिबंधित लक्ष्य - प्लाज्मिड ताजा JS200 वामो पोल मैं कोशिकाओं में पुस्तकालय वापस 250ng के 30 पुस्तकालय डाल करने के लिए.
# 5 नोट: मैं प्लाज्मिड पोल प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग Linearizing सुनिश्चित करता है केवल प्लाज्मिड लक्ष्य तब्दील हो जाता है. - वर्गों 2 और 3 दोहराएँ.
5. Readout
- प्रतिबंध एंजाइम (ओं) के साथ अलग प्लाज्मिड डीएनए कि दोनों प्लाज्मिड लक्ष्य और मैं प्लाज्मिड पोल linearizes प्रतिबंधित. एक 1% agarose जेल को पचाने में चलाने के लिए plasmids की मात्रा और गुणवत्ता सुनिश्चित करने के. पृथक डीएनए प्लाज्मिड के 400ng ~ सीमित आम तौर पर विश्लेषण के लिए पर्याप्त है.
- प्रतिबंध एंजाइम है कि मैं वामो पोल प्लाज्मिड linearizes के साथ पृथक डीएनए प्लाज्मिड के 1μg प्रतिबंधित है, लेकिन करता कटौती अपने लक्ष्य प्लाज्मिड नहीं.
- प्रतिबंध पचाने में एक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग कर साफ़.
- एक readout म्यूटेशनों विशेषताएँ तनाव में प्रतिबंधित लक्ष्य प्लाज्मिड पुस्तकालय रूपांतरण.
द्वितीय. उत्परिवर्ती स्क्रीन और विशेषता विश्लेषण ढाल ग्रोथ प्लेट्स का उपयोग करना.
आदेश में वर्णन करने के लिए कैसे विशाल आनुवंशिक हमारे पुस्तकालयों में मौजूद विविधता एक कार्यात्मक चयन करने के लिए युग्मित किया जा सकता है, यहाँ हम ई. में vivo में दवा आधारित कार्यात्मक चयन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान कोलाई. इस विधि ठोस अगर पर एक दवा ढाल के साथ विकास पर आधारित है. यह सांद्रता का एक सीमा से अधिक एकाधिक (12) नमूने के साथ - साथ विशेषताओं की अनुमति देता है, एक ही दवा उपचार की तुलना में एक व्यापक गतिशील रेंज प्रदान. एक और लाभ यह है कि इस परख की गैर रेखीय readout व्यवहार्यता में एक 2 गुना रेंज के भीतर मध्यम मतभेद, बफ़र्स. इस प्रकार, इस cytotoxicity प्रतिरोध परख साधन प्रदान करता है एक मजबूत और तेजी से उत्परिवर्ती पुस्तकालयों का चयन करें और व्यक्तिगत म्यूटेंट के प्ररूपी प्रोफ़ाइल निर्धारित है. चित्र 2 इन उपयोगों में से प्रत्येक का एक उदाहरण दिखाता है: व्यक्तिगत म्यूटेंट के एक मानव oxidative demethylase ABH2 पुस्तकालय से पता चलता चयन समिति. WT सीमा से ऊपर बढ़ रही कालोनियों cytotoxicity methylating एजेंट मिथाइल मीथेन sulfonate (एमएमएस) 7 की वजह से वृद्धि की सुरक्षा के लिए चयन कर रहे हैं . पैनल बी व्यक्तिगत क्लोन लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया gradients के एक उदाहरण से पता चलता है. तीसरी पीढ़ी cephalosporin एंटीबायोटिक cefotaxime करने के लिए प्रतिरोध का स्तर WT β-lactamase के लिए अगर ढाल पर और दो बढ़ाया स्पेक्ट्रम म्यूटेंट, R164H और E104K R164S G267R 4 के लिए दिखाया गया है. ध्यान दें कि मनाया प्रभाव के बल पर निर्भर करता है, एक एकल थाली से अधिक पर्याप्त quantitation के लिए आवश्यक हो सकता है: जबकि 0.4mg/ml ढाल नियंत्रण के क्लोन करने के लिए प्रत्यक्ष तुलना में, सबसे शक्तिशाली उत्परिवर्ती के प्रतिरोध के स्तर के लिए अनुमति देता है कर सकते हैं केवल एक उच्च ध्यान केंद्रित का उपयोग कर स्थापितcefotaxime (4mg/mL) की tration.
माल
- उपकरण
- 100x100x15mm वर्ग पेट्री डिश (फिशर विज्ञान # 0875711A)
- 100mm दौर पेट्री डिश
- 25x75x1mm गिलास खुर्दबीन स्लाइड (फिशर विज्ञान 1,255,015 #)
- 50 एमएल ट्यूब स्नातक की उपाधि प्राप्त की
- मीडिया
- लेग अगर पिघल गए और 56 पर एक पानी के स्नान में equilibrated डिग्री सेल्सियस
# 6 नोट: मीडिया के तापमान स्थिरता और इस तरह जांच की जा रही दवा या मिश्रित की गतिविधि को प्रभावित कर सकता है. - शीतल अग्रवाल: पिघला और 42 के लिए एक पानी के स्नान में equilibrated डिग्री सेल्सियस
- लेग अगर पिघल गए और 56 पर एक पानी के स्नान में equilibrated डिग्री सेल्सियस
1. ढाल के निर्माण
- मार्क दस गलियों, वर्ग पेट्री डिश के नीचे के एक किनारे भर में समान रूप से स्थान.
- एक ऐसी इच्छा है कि नीचे के रूप में चिह्नित किनारे 7mm ऊंचा है पर पकवान प्लेस;
एक मोटी घास या अन्य फ्लैट वस्तु का समर्थन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है पकवान तरक्की. 25 के एमएल डालो गर्म (56 ~ डिग्री सेल्सियस) लेग अगर इच्छुक डिश में एजेंट का चयन एक उपयुक्त एकाग्रता के साथ अच्छी तरह से मिश्रित. यह ढाल के नीचे की परत है. यकीन है कि समान रूप से लेग अगर पेट्री ऐसी है कि ऊंचा, पकवान के रूप में चिह्नित के अंत के ~ 1mm लेग अगर होता है और कम हिस्सा ~ लेग अगर 8mm शामिल पकवान कोट. तो अगर 10-15 मिनट के लिए सेट करने के लिए अनुमति देते हैं.
# 7 नोट: हाइड्रोफोबिक चयन एजेंटों के लिए, 0.1% (antifoam बी पायस) surfactant लेग अगर करने के लिए जोड़ा जा सकता है के लिए निलंबन और दवा के समान वितरण की सुविधा. गर्म बाँझ लेग अगर एजेंट के चयन के अलावा जोरदार पहले मिलाते साथ surfactant जोड़ें. surfactant निलंबित चाहिए छोटी बूंदों की एक ठीक धुंध के रूप में, बड़े बूंदों से संकेत मिलता है मीडिया बहुत गर्म है और परीक्षण दवा के समान वितरण को बाधित कर सकते हैं. - बाद लेग अगर पहले 25 एमएल कठोर है, पकवान एक फ्लैट सतह के लिए ले जाया जाता है. अगला, चयन एजेंट के बिना 25 एमएल लेग अगर पहली लेग अगर सतह उपरिशायी डाला है. यह ढाल के ऊपर परत है. सुनिश्चित करें कि लेग अगर नीचे की परत के पूरी सतह शामिल हैं. वेंटिलेशन के लिए ढक्कन तिरछा के साथ कवर, और अगर 10-15 मिनट के लिए सेट करने के लिए अनुमति देते हैं.
# 8 नोट: एयरोसोल परीक्षण परिसर के खतरों और संभावित वाष्पीकरण के बारे में पता है, एक रासायनिक या जैविक सुरक्षा हुड में gradients डाल अगर रासायनिक सुरक्षा आवश्यकताओं के द्वारा निर्धारित है.
# 9 नोट: दवा या परीक्षण यौगिक एकाग्रता की ढाल की रक्षा ढाल व्यंजन 4 के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
2. बैक्टीरिया के हस्तांतरण स्टाम्प
- शीतल अगर 42 डिग्री सेल्सियस तक equilibrated होना चाहिए ढक्कन या एक 100mm दौर पेट्री डिश के तल में तरल नरम अगर की 2 एमएल स्थानांतरण. पिपेट नरम अगर में जीवाणु संस्कृति के 40 μL और फिर थाली कमाल मिश्रण.
नोट: # 10: एक जीवाणु संस्कृति के विकास के चरण एक दवा या परीक्षण यौगिक प्रतिक्रिया प्रभाव हो सकता है. लॉग चरण या स्थिर चरण में रातोंरात संस्कृतियों में संस्कृतियों समान परिणामों के लिए निरंतरता के साथ किया जाना चाहिए. सेल घनत्व भी तिरछा रिश्तेदार परिणाम कर सकते हैं, इस प्रकार सभी संस्कृतियों के लिए एक 600 घनत्व मूल्यों मिलान है पतला होना चाहिए. ओवरनाइट संस्कृतियों के लिए एक एक 600 घनत्व 1.0 से कम है पतला होना चाहिए - कोट नरम अगर मिश्रण के साथ कांच खुर्दबीन स्लाइड की लंबी बढ़त मिली है. फिर, ढाल पकवान पर स्लाइड के नीचे निशान के साथ लेपित बढ़त (उच्च एकाग्रता के लिए कम) aligning, अगर की सतह के लिए स्लाइड स्पर्श. एक मुलायम स्पर्श ढाल सतह के लिए मुलायम अगर एक रिबन हस्तांतरण करने के लिए पर्याप्त है. स्लाइड तो सफाई और पुन: उपयोग करने के लिए अलग सेट है.
- बैक्टीरिया के नमूने के शेष के लिए, इस प्रक्रिया को दोहराएँ. संदर्भ नमूने प्रत्येक ढाल पकवान पर शामिल किया जाना चाहिए अगर कई gradients चलाया जा रहा है.
- ढाल पकवान शीर्ष 37 पर रातोंरात नीचे सेते डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन टाइम्स और तापमान अलग readout जीवाणु उपभेदों लेकिन रात के लिए 37 अलग ° सी आमतौर पर दिखाई विकास के लिए पर्याप्त हो सकता है.
3. इमेजिंग और विकास का विश्लेषण
- इमेजिंग: रातोंरात वृद्धि के बाद, gradients सीधे हो सकता है या imaged कर सकते हैं तय की और 95% EtOH में 0.2mg / एमएल acridine ऑरेंज के एक समाधान है, के विपरीत बढ़ाने के साथ दाग. थाली कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए incubated धुंधला समाधान में है, तो 95% EtOH से धोया और फिर एक यूवी प्रकाश बॉक्स पर imaged.
# 11 नोट: थाली से कालोनियों फ्लश नहीं है लेकिन बजाय थाली पर धुंधला समाधान और washes रॉक और कोनों से समाधान निकालने के लिए ध्यान रखना. - व्यक्तिगत उत्परिवर्ती plasmids के phenotype के विश्लेषण के लिए, प्रत्येक ढाल एकाग्रता ढाल के खिलाफ विकास की दूरी पर एक मानक सामान्यीकृत है. ये रिश्तेदार मूल्यों तो gradients भर में तुलना की जा सकती है.
# 12 नोट: साइटोटोक्सिक प्रभाव की प्रकृति पर निर्भर करता है, एक तेज धार या एक अधिक फैलाना बढ़त मनाया (उदाहरण के ए और बी 2 अंजीर में पैनलों के लिए तुलना कर सकते हैं). फैलाना किनारों के मामले में, यह सलाह दी जाती है बढ़त ओ को मापनेच सतत विकास, व्यक्तिगत कालोनियों के रूप में वृद्धि की परिवर्तनशीलता दिखाने करते हैं. - पुस्तकालय के चयन के लिए, अलग - अलग कालोनियों कि माता पिता के जंगली प्रकार नियंत्रण से उच्च सांद्रता पर बढ़ने अलग कर रहे हैं और बढ़ा संरक्षण के लिए योगदान परिवर्तन की पहचान करने के लिए अनुक्रम.
III. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. तरल और प्रत्यक्ष चढ़ाना mutagenesis प्रोटोकॉल के बीच तुलना करें. प्रत्यक्ष चढ़ाना mutagenesis यहाँ प्रस्तुत (नीचे) प्रोटोकॉल तेजी से है और हमारे मूल तरल mutagenesis प्रोटोकॉल (ऊपर) से कम चरणों की आवश्यकता है. जब GFP एक पत्रकार के रूप में प्रयोग किया जाता है, प्रतिदीप्ति में बदलाव पुस्तकालय में आनुवंशिक विविधता वर्तमान के संकेत हैं. आमतौर पर, प्रतिदीप्ति appreciably कम स्तर के साथ 12-18% कालोनियों में mutagenesis के परिणामों के एक चक्र है.
चित्रा 2. ढाल प्रतिरोध assays. मिथाइल - Methanesulfonate बढ़ा प्रतिरोध (एमएमएस) के लिए एक चयन पैनल मानव oxidative demethylase ABH2 प्लाज्मिड पुस्तकालयों एमएमएस को बढ़ा प्रतिरोध के लिए चयन किया गया था . ऐसे दो पुस्तकालयों mutagenesis के प्रोटोकॉल के दो और चार पुनरावृत्तियों का प्रतिनिधित्व पैतृक जंगली प्रकार (WT) और खाली सदिश (Δ) की तुलना में दिखाए जाते हैं. सफेद लाइन दहलीज पर जो ऊपर व्यक्तिगत उत्परिवर्ती कालोनियों आगे प्ररूपी विश्लेषण के लिए अलग थे पैनल बी Cefotaxime संरक्षण, विस्तारित स्पेक्ट्रम β-lactamase गतिविधि का संकेत अर्थ. R164H और E104K R164H G267R, पहले से पहचान की बीटा lactamase के दो म्यूटेंट वामो निम्नलिखित पोल मैं mutagenesis aztreonam 4 चयन के लिए युग्मित, एक 0.4μg/mL और एक 4μg/mL cefotaxime ढाल पर दिखाए जाते हैं. ध्यान दें कि जंगली प्रकार के β-lactamase एंजाइम नहीं एक खाली वेक्टर, Δ व्यक्त कोशिकाओं के सापेक्ष संरक्षण प्रदान. इसलिए, इन म्यूटेंट एक नया जैव रासायनिक गतिविधि 8,9 के विकास का प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 3. मूल (घ) से दूरी के एक समारोह के रूप में उत्परिवर्तन आवृत्ति. उत्परिवर्तन प्रत्यक्ष चढ़ाना mutagenesis के एक एकल चक्र निम्नलिखित आवृत्ति 100 बीपी / शाही सेना डीएनए प्रतिकृति के ColE1 मूल के स्विच करने के लिए सापेक्ष अंतराल के लिए दिखाया गया है. 1600 और 2400 के बीच क्षेत्र क्योंकि β-lactamase एक तटस्थ लक्ष्य का प्रतिनिधित्व नहीं करता है प्रतिनिधित्व नहीं है. β-lactamase परे अंक 200 बीपी इस क्षेत्र में उत्परिवर्तन के समग्र कम आवृत्ति दिया अंतराल का प्रतिनिधित्व करते हैं. प्रवृत्ति (द्विपद समीकरण के साथ एक आर 2 = 0.41) एक पंक्ति के रूप में दिखाया गया है .
पूरक चित्रा 1. वामो पोल मैं युक्त मैं प्लाज्मिड पोल. एक अनुक्रम (FastA प्रारूप). उचित प्रतिबंध एंजाइम (ओं) का निर्धारण का उपयोग करने के लिए जब पोल मैं प्लाज्मिड या तो चलना के लिए (एक यादृच्छिक उत्परिवर्तन पुस्तकालय चरण 4 पीढ़ी के) linearizing या readout (कदम 5) के लिए अनुक्रम जानकारी बी सामान्य सुविधाओं और प्लाज्मिड के प्रतिबंध नक्शा.. प्रतिकृति का pSC101 मूल, chloramphenicol प्रतिरोध मार्कर (कैट) और LF-पोल मैं जीन के स्थान प्रस्तुत कर रहे हैं. एकल प्रतिबंध साइटों के स्थान के रूप में अच्छी तरह से संकेत दिया है.
| पुस्तकालय | प्रत्यक्ष चढ़ाना | तरल (1 दिन) | तरल (3 दिन) | |
| उत्परिवर्तनों (#) | 95 | 40 | 142 | |
| क्लोन अनुक्रम | 288 | 96 | 190 | |
| कुल कवरेज (बीपी) | 182.000 | 102.000 | 213.000 | |
| उत्परिवर्तन freq (x10 बीपी 3) | 0.52 | 0.39 | 0.67 | |
| Freq घ <1000 (x10 3 बीपी) | 0.92 | 0.41 | 0.70 |
तालिका 1. उत्परिवर्तन आवृत्तियों घ <1000 यानी, के लिए 1000 स्विच / शाही सेना डीएनए के निकट तीन mutagenesis के प्रोटोकॉल के लिए बीपी, के भीतर (के रूप में व्यक्त / म्यूटेशनों बीपी #) आवृत्तियों: प्रत्यक्ष चढ़ाना, तरल संतृप्ति (1 दिन), और तरल hypersaturation ( 3) दिन है.
| प्रत्यक्ष चढ़ाना | तरल | ||
| उत्परिवर्तनों (#) | 95 | 182 | |
| स्पेक्ट्रम (%) | |||
| जी | जी | 6.3 | 19.2 |
| सी टी | 4.2 | 3.8 | |
| टी सी | जी एक | 27.4 | 13.7 |
| टी सी | 35.8 | 35.2 | |
| टी करने के लिए | टी करने के लिए | 5.3 | 8.2 |
| एक टी | 5.3 | 7.1 | |
| जी टी | जी टी | 1.1 | 1.1 |
| सी करने के लिए | 0.0 | 2.2 | |
| टी जी | टी जी | 1.1 | 2.7 |
| A सी | 2.1 | 2.7 | |
| जी सी | जी सी | 2.1 | 1.1 |
| सी जी | 5.3 | 2.7 | |
| Indels | भारतीय नौसेना पोत | 3.2 | 0.0 |
| डेल | 1.1 | 0.0 | |
| एन | 11.6 | 29.7 | |
| एन जी | 33.7 | 19.2 | |
| एन टी | 10.5 | 12.1 | |
| एन सी | 40.0 | 39.0 | |
| Ts | 73.7 | 72.0 | |
| टीवी | 22.1 | 28.0 | |
| Indels | 4.2 | 0 |
तालिका 2. उत्परिवर्तन के प्रत्यक्ष चढ़ाना और तरल mutagenesis के लिए मेट्रिक्स तालिका मनाया म्यूटेशनों की संख्या (संख्या में) और उत्परिवर्तन mutagenesis की एक एकल चक्र के बाद स्पेक्ट्रम (% में) प्रस्तुत करता है . स्पेक्ट्रम पूरक जोड़े द्वारा नीचे टूटी हुई है, nucleotide परिवर्तन के द्वारा, और उत्परिवर्तन के प्रकार के अनुसार.
Discussion
यह लेख एक mutagenesis के प्रोटोकॉल है कि क्लोनिंग या पीसीआर के लिए आवश्यकता के बिना बड़े यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की पीढ़ी की अनुमति देता प्रस्तुत करता है. यह विधि एक प्लाज्मिड ब्याज की एक अनुक्रम एन्कोडिंग त्रुटि प्रवण प्रतिकृति पर आधारित है. सिद्धांत रूप में, म्यूटेशनों मोटे तौर पर 100-300 तुरंत स्विच / शाही सेना डीएनए के बहाव स्थित बीपी के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए, नेता कतरा मध्यवर्ती के आकार 2,10 मैं पोल द्वारा उत्पादित . हमने पाया है कि इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत की शर्तों के तहत, पोल मैं म्यूटेशनों सभी प्लाज्मिड अधिक होते हैं, हालांकि प्लाज्मिड मूल बढ़ जाती है (चित्रा 3) से दूरी के रूप में आवृत्ति में ह्रासमान. यह निष्कर्ष निकलता है कि संक्रमण या पोल मैं से ColE1 प्लाज्मिड प्रतिकृति के दौरान पोल III के लिए "स्विच" हमारे प्रयोगात्मक 2 शर्तों के तहत कम से कम अधिक क्रमिक से पहले की रिपोर्ट है, और पहले अध्ययन पोल मैं और पोल के बीच एक कार्यात्मक अतिरेक सुझाव के साथ सहमत 11 क्ष्क्ष्क्ष्.
हमारा मूल प्रोटोकॉल तरल संस्कृतियों (4) में वर्णित mutagenesis. यह प्रोटोकॉल 1000 बीपी शाही सेना / स्विच डीएनए (तालिका 1) करने के लिए आसन्न के भीतर 0.41 म्यूटेशनों / घ <1000 यानी, के लिए केबी पैदावार. प्रकार के बरतन में 3 दिनों के लिए किसी भी ताजा मीडिया के अलावा बिना तरल संस्कृति छोड़ने के द्वारा Hypersaturation 0.70 म्यूटेशनों / केबी लेकिन परिणाम बहुत गरीब प्लाज्मिड उपज में (1% से कम 1 दिन की तुलना में, नहीं दिखाया डेटा) को उठाती उत्परिवर्तन आवृत्ति ( तालिका 1). यहाँ हम एक सरलीकृत सीधे 37 पर लक्ष्य के ठोस अगर प्लाज्मिड परिवर्तन चढ़ाना पर आधारित प्रोटोकॉल वर्तमान डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1). यह प्रक्रिया उत्परिवर्तन / mutagenesis के चक्र (0.92 / म्यूटेशनों <घ 1000 के लिए केबी) का सबसे बड़ा आवृत्ति पैदा करता है और बहुत चलना की सुविधा. ठोस मीडिया को संस्कृति शर्तों बदलना भी उत्परिवर्तन (तालिका 2) स्पेक्ट्रम को प्रभावित करता है. प्रत्यक्ष चढ़ाना mutagenesis कम चिह्नित पूरक आधार जोड़ी तरल संस्कृति में देखा substitutions के बीच विषमता (C → टी बनाम जी → एक और एक → → जी बनाम टी सी की तुलना). दूसरी ओर, प्रत्यक्ष चढ़ाना अधिक indels (कम से कम 0.5% 4% से) का उत्पादन किया है और 3 गुना द्वारा एक → जी म्यूटेशनों की संख्या में कमी, जी / सी (74%) म्यूटेशनों के एक overrepresentation के लिए अग्रणी. कुल मिलाकर, हम मानते हैं कि अधिक से अधिक और प्रत्यक्ष चढ़ाना यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल की वृद्धि की दक्षता सादगी थोड़ा और अधिक संतुलित उत्परिवर्तन तरल mutagenesis के द्वारा उत्पादित स्पेक्ट्रम के लाभ outweighs.
प्लाज्मिड लक्ष्य के भीतर, हमारे विधि द्वारा उत्पन्न परिवर्तन वांछित लक्ष्य अनुक्रम के लिए सीमित नहीं हैं. हालांकि, उपन्यास जैव रासायनिक गतिविधियों के विकास लक्ष्य जीन के भीतर परिवर्तन पर निर्भर हो सकता है, के रूप में यह बजाय एक मात्रात्मक परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है एक गुणात्मक चाहिए. इस प्रकार, ढाल प्लेटों पर म्यूटेंट की स्क्रीनिंग के साथ हमारे प्लाज्मिड mutagenesis के संयोजन नए जैव रासायनिक गुणों के विकास के लिए हमारे सिस्टम (बड़े पुस्तकालयों और चयन की उपलब्धता) की ताकत पर capitalizes. मौजूदा enzymatic गतिविधियों अनुकूलन या एक जीन की विशिष्ट क्षेत्रों randomizing जैसे यादृच्छिक mutagenesis के अन्य अनुप्रयोगों क्लोनिंग यादृच्छिक mutagenesis के निम्नलिखित की आवश्यकता है. इस मामले में, एक प्लाज्मिड में पुस्तकालय के रूप में एक पीसीआर प्रवर्धन उत्पाद विरोध प्रवर्धन और प्रतिबंध की सुविधा के द्वारा क्लोनिंग की दक्षता में सुधार.
संक्षेप में, हम करने के लिए दिए गए लक्ष्य जीन है कि अपनी सादगी के लिए और उत्पन्न पुस्तकालयों की विविधता के लिए बाहर खड़ा के लिए एक यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालय बनाने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. हम बताते हैं कि कैसे इस विधि नए जैव रासायनिक गतिविधियों के कुशल विकास के लिए कार्यात्मक चयन के साथ युग्मित किया जा सकता है. इसके अलावा, हमारे में vivo उत्पन्न पुस्तकालयों आसानी से क्लोन हो सकता है, साइट विशेष या मौजूदा गतिविधियों के mutagenesis के अनुकूलन की अनुमति कर सकते हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम K08 पुरस्कार एम सी के लिए CA116429-04 और जीतना कैंसर से अब नींव (चिंता) 8501 # अनुदान द्वारा समर्थित किया गया है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| carbenicillin | Cellgro | 46100R6 | 0.1mg/ml final |
| tetracycline | Fisher Scientific | BP7640 | 0.05mg/ml final |
| chloramphenicol | Genlantis | M120100 | 0.03mg/ml final |
| LB Agar Miller | Fisher Scientific | BP1425 | |
| LB Broth Miller | Difco Laboratories | 244620 | |
| Soft Agar | Difco Laboratories | 214580 | Made in house |
| Acridine Orange | Sigma-Aldrich | A38401-1 | |
| Antifoam B emulsion | Sigma-Aldrich | A5757 | |
| Glycerol | Acros Organics | 332030025 | |
| 100x100x15mm sq dish | Fisher Scientific | 0875711A | |
| 100mm rnd dish | Fisher Scientific | 0875712A | |
| Microscope slide 25x75x1mm | Gold Seal | 3048 | |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| 2mm gap tubes | Molecular BioProducts | 5520 | |
| Zippy mini prep kit | Zymo Research Corp. | D4020 |
References
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