Summary
光および電子顕微鏡用切片可能に酵母のコロニーを埋め込むための方法。このプロトコルは、真菌、コミュニティ内での細胞型の組織を理解するための新しいツールを提供してコロニー内に胞子形成細胞と偽菌糸細胞の分布を決定することができます。
Abstract
胚の異なる細胞型のパターニングは、後生動物の発生において重要なメカニズムです。このようなコロニーやバイオフィルムのような微生物のコミュニティは、また、細胞の種類のパターンが表示されます。例えば、酵母のS.出芽酵母は 、胞子形成細胞と偽菌糸細胞が一様にコロニーで配布されていません。パターニングとこれらのパターンの根底にある分子機構の機能的重要性はまだよく理解されています。
真菌コロニーの細胞型のパターンを調査に関して、1つの課題は、後生動物の組織とは異なり、コロニー内の細胞は比較的弱く、お互いに接続されていることです。特に、真菌のコロニーはほとんどの組織に見られる細胞外マトリックスの同じ豊富なレベルが含まれていません。ここでは、これらのコロニーの細胞型の内部のパターンを明らかに酵母のコロニーを埋め込むとセクショニングの方法で報告する。方法は、光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡に適した薄切片（0.1μ）のために有用（0.5μ）厚い切片を作製するために使用することができます。これらの細胞の内部構造はEMによって可視化することができますがASCIと偽菌糸の細胞が容易に、光学顕微鏡で卵形の酵母の細胞と区別することができます。
メソッドは、寒天でコロニーを囲むスパーの培地でそれらを浸潤し、切片に基づいています。 1〜2ミリメートルの範囲の直径を持つコロニーは、このプロトコルに適しています。コロニーの内部を可視化することに加えて、メソッドは基になる寒天に侵入するコロニーの領域を可視化できる。
Protocol
1。コロニーの単離と固定
- 指定された時間のために寒天培地に300コロニーをインキュベートする（孤立コロニーは直径に1-2 mmにしてください）。
- コロニー（顔のアップ）と狭いヘラを使用して、基礎となる培地を削除します。
- 2％寒天、42℃、それが固化する前に、寒天の表面に1 mLのpipetmanの先端と、すぐに場所のコロニーを用いて顕微鏡スライド上にCを数滴を置きます。
- 42 ° Cコロニーに2％の寒天を数滴を配置し、固化することができます。
- このプロトコルの残りの部分を通じてすべてのステップのための手袋を着用してください
- かみそりの刃を持つブロックをトリムし、4℃で7日間、2％パラホルムアルデヒド/ 2％グルタルアルデヒド固定液を含む3.5mLのホウケイ酸塩のスクリューキャップ付きバイアルの中に置いてください
2。洗浄およびオスミウム処理
- 約1週間後、完全に同じボリュームで5分間、その後、植民地（約1.5mL）をさらに2回をカバーするのに十分な0.15Mカコジル酸ナトリウム（pH7.2）で15分間二回インキュベートすることにより、化学煙フードの下に氷の上の寒天ブロックを洗う1X OSバッファー（100mMのKH 2 PO 4 10mMのMgCl 2、pH6.0）での。
- [2 mLのOSO 4（2％）+ 2 mLの2倍のOSのバッファ] 1％の同じ体積OSO の追加4バイアル（氷上で）に1時間化学煙フード下の寒天ブロックをカバーするために、同じ金額で2回洗浄10分ごとに1X OSバッファの。
- 4℃バイアルは一晩おきます° 1X OSのバッファでC。
- 固定し、このステップですべての洗浄は、危険廃棄物として廃棄されています。 OSO 4を含むすべてのピペットは、植物油と3Xすすいだ。
3。洗浄と脱水
- 翌朝は、パスツールピペットを用いて、10分ごとに冷たい水の上と同じボリュームで氷の上で二回寒天ブロックを洗う。
- 25％の同じ体積で順次洗浄、10分ごとに50％、75％、95％エタノールで10分間100％エタノールで2回洗浄した。 4℃で一晩おきます〜100％エタノールでCを。
- このステップのすべての洗浄は、危険廃棄物として廃棄されています。
4。スパーの準備
- 次の朝は、（可能な限り早期）スパーの試薬を準備するヒュームフードの下で使い捨てのプラスチック製ビーカーに入れ、以下のソリューションを（EMサイエンス）重量を量る。この試薬を使用する後続のすべての作業では、ヒュームフードを使用し続ける。
（ERL 4221溶液5グラム）
（DER 736溶液4グラム）
（NSAの溶液13グラム） - これらのソリューションは、（ゆっくり）攪拌棒を使用してフードで20分間混ぜる
- DMAEのソリューションを0.15グラムを追加し、上記のような20分をかき混ぜる。
- フード内の1〜2時間のためのドガ上記の混合物。
5。スパーの浸透
- スパーのが上記の10分ごとに100％の室温のエタノールのと同じボリュームで寒天ブロックを5回洗浄なされるとすぐに。最後にエタノールで洗浄後に残っているエタノールは、ちょうど寒天ブロックを覆うように、パスツールピペットを用いてエタノールを除去します。
- 約スパーの試薬（約0.5mL）を同量を追加し、30分間放置するし、室温で15分間ホイール上にバイアルを回転させると。 30分は完全にパスツールピペットを用いて溶液を除去した後、追加スパーは、寒天ブロック（約1.5 mL）をカバーするもの、室温で15分間ホイールにバイアルを回転させ、30分間放置する。スパーの交換、回転、およびインキュベーションさらに3回繰り返します。
- 最後の30分後、スパーの試薬を除去し、ブロックをカバーするために新鮮なスパーのを追加します。寒天ブロックは4時間室温で放置する。
- スパーのを交換し、一晩回転する。
- 朝にはスパーのを交換し、翌日になるまで回転しておきます。
- 単に金型の底をカバーするために番号のシリコンモールドで翌朝の場所のスパーの（フィッシャーサイエンティフィック）は、その後、金型に寒天ブロックを追加します。 4時間60℃でインキュベートする
- より多くのスパーのインキュベート、60℃で一晩でカビオフ上部後4時間、、。
- 金型からブロックを削除した後のブロックはまだわずかに柔軟である場合、金型に戻り、追加の2日間インキュベートする
6。セクショニング
- ライカUltracut Sミクロトームは、光学顕微鏡では0.5μ厚の切片を0.1μ伝送EM用薄切片を切断するために使用された。
- セクションがカットされたとして、光学顕微鏡の場合は、、それらはのdH 2 Oのドロップで配置され、そして52℃のヒートブロック上で乾燥。乾燥のセクションは、1.0パーセントトルイジンブルー、5-15秒1％ホウ酸ナトリウムの滴で染色した。染色後、切片をすぐに、水の流れの下で洗浄し、乾燥し、マウントメディア（KPL）に覆われており、カバースリップは、試料上密封した。
酵母や他の微生物のパターン形成を測定するの広範な関連性は、以前は1日している。特に注目すべきは、無秩序な社会への相対的な組織的な微生物のコロニーの増加機能があります。
記載されている方法は大きく専門的なコロニー2を埋め込 むための方法の変更であり、そして私達の変更の簡単な説明は、3を発表されている。
野生S.の植民地の中心を通ってセクションの光顕微鏡写真の例出芽酵母の酵母のコロニーを図1に示されています。 ASCI、pseudohyphaeと卵酵母がわかりやすい、基礎となる寒天を侵略植民地の地域にも明らかである。
酵母の実験室株（W303背景）の電子顕微鏡写真の例を図2に示されています。画像は、胞子形成細胞の高周波を含むコロニーの地域からです。
図1。野生酵母のコロニーの光学顕微鏡。この酵母（YPS133）は、ツリーの滲出液4から最近単離された。コロニーは、前の切片にYNA媒体5の6日間インキュベートした。オープン矢印は、塗りつぶされた矢印は、細長い細胞のチェーン（pseudohyphae）とASCIを示す、塗りつぶされた矢印は代表的な卵形の栄養細胞を示す、代表的なASCIを示している。
図2実験室酵母株の電子顕微鏡。 SH1020（W303背景）のコロニーが3切片の前にYNAの培地上で6日間インキュベートした。画像は、ASCIの高い周波数を持つセクションの領域を示しています。矢印は胞子壁の二層構造を示している。
図3。コロニーにおける胞子形成細胞の分布の定量化：）その長辺に沿って積み重ね15に隣接する矩形を含むグリッドは、コロニーのセクションの画像の中央部に重畳する。その比率を一定に保ちながらグリッドは単に植民地の上部と下部をカバーするために、スケーリングされます。 （B＆C）その長方形の全細胞に対する各長方形の胞子形成細胞の割合は、4日齢（B）、8日齢（C）コロニーからの画像の目視検査によって決定されます。例えば、植民地の上部にある長方形は（"1"とラベルされた）のグラフの左側に対応しています。 4コロニーの平均値が表示され、エラーバーはSTDを表示します。エラー。
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Discussion
提示方法は、コロニーの内部構造を明らかにする。方法は、Sの範囲内のセルのタイプのパターンを決定する上で効果的ですので、別のコロニーの形態を持つ、とも近縁種S. paradoxus 5の出芽酵母株は 、この方法はまた、真菌や他の微生物の広い範囲で動作する可能性があります。
メソッドの成功のための一つの重要なステップは、コロニーの上部を含む全体のコロニーが、、プロトコル全体に寒天で包まれていることを確認することです。コロニーは寒天で完全に覆われているかどうかは、トルイジンブルーと光学顕微鏡と染色のために切削後に決定することができます。染色した切片を光学顕微鏡で見た場合、寒天培地は、包埋媒体よりも若干暗く染色される。脱水工程中の寒天の縮小、コロニー全体を回復するためには、必要があります。なぜなら：1）ステップ1.2のコロニーを確実にカバーするために寒天の4-5滴を追加し、2）ではないで、唯一の両側に寒天をトリム上部と下部、そして必要なだけのそれは、ステップ1.5の金型内に収まるようにトリミング。
最適なセクションのために重要なプロトコルの第二段階は、メディアを埋め込むのブロックの硬さを含む。通常はブロックを型からそれらを削除して、一晩のインキュベーションの後に検査されます。ブロックは両手の間に開催されたときにまだ柔軟性と屈曲した場合、彼らはおそらく切片のための十分なハードではありません。この場合、それらはさらに48時間同じ温度でインキュベーターに戻され、上記のように再試験。
微生物のコロニー内の細胞型のパターンを検出することができるという意味では、これらのパターンは、おそらく社会への細胞の機能的な組織を反映していることです。確かに、微生物のパターニングは、同じ種の生物が相互作用することによって、古代と基本的なメカニズムを反映しているのかもしれない。一緒にコロニー3,6の遺伝子発現のパターンをモニターする方法と、これらのコミュニティでの細胞分化のパターンを検出する能力は、微生物のパターン形成の潜在的メカニズムをテストすることができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
研究は、NIH 1R15GM094770によって資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
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