Summary
빛과 전자 현미경에 대한 sectioning 수 있도록 효모 식민지를 포함하는 방법. 이 프로토콜은 곰팡이 지역 사회 내에서 세포 유형의 조직을 이해하는 방향으로 새로운 도구를 제공하는 식민지 이내 sporulated 세포 pseudohyphal 세포의 분포의 결정 수 있습니다.
Abstract
배아 다른 세포 유형의 Patterning는 metazoan 개발에 중요한 메커니즘입니다. 이러한 식민지와 biofilms과 같은 미생물의 커뮤니티는 세포 유형의 패턴을 표시합니다. 예를 들어, 효모의 S. cerevisiae는 sporulated 세포 pseudohyphal 세포 균일 식민지에서 배포되지 않습니다. patterning 이러한 패턴을 기초 분자 메커니즘의 기능 중요성은 아직도 제대로 이해하고 있습니다.
곰팡이 식민지의 세포 유형의 패턴을 조사에 관한 한 과제는 metazoan 조직과는 달리, 식민지의 세포가 상대적으로 약하게 서로 연결된 것입니다. 특히, 곰팡이 식민지는 대부분의 조직에서 발견 세포외 기질 같은 광범위한 수준을 포함하지 않습니다. 여기이 식민지에서 세포 유형의 내부 패턴을 보여줍니다 효모 식민지를 포함하고 sectioning하는 방법에 대한 리포트입니다. 방법은 가벼운 현미경 및 전송 전자 현미경에 적합한 얇은 섹션 (0.1 μ)에 유용 (0.5 μ) 두꺼운 부분을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 세포의 내부 구조가 EM으로 시각 수 있지만 Asci과 pseudohyphal 세포는 쉽게, 가벼운 현미경으로 난형의 효모 세포를 구분할 수 있습니다.
방법은 한천과 식민지를 둘러싼 스퍼의 중간 그들을 침투하고, 다음 sectioning을 기반으로합니다. 1~2mm의 범위에있는 직경이 식민지는이 프로토콜에 적합합니다. 식민지의 내부를 시각화뿐만 아니라, 방법은 기본 한천을 침공 식민지 지역의 시각화 수 있습니다.
Protocol
1. 콜로니 분리 및 고정
- 표시된 시간을 한천 배지에 300 식민지 (격리 식민지가 직경 1~2mm한다) 알을 품다.
- 콜로니 (얼굴까지)와 좁은 주걱을 사용하여 기본 매체를 제거합니다.
- 2 % 한천의 여러 방울을 플레이스 42 ° C가 굳은 한천 전에 얼굴 1 ML pipetman 팁 즉시 장소 식민지를 사용하여 현미경 슬라이드에.
- 42 ° C 식민지에서 2 % 한천의 여러 방울을 넣고 응고 수 있습니다.
- 이 프로토콜의 나머지 부분을 통해 모든 단계에 대한 장갑을 착용
- 트림 면도날로 블록과 4에서 7 일 동안 2 % paraformaldehyde / 2 % 글루 타 알데히드 정착액을 포함하는 3.5 ML borosilicate 나사 캡 병에 넣어 ° C.
2. 세척 및 오스뮴 트리 트먼트
- 약 1 주 후, 완전히 동일한 볼륨 5 분 후 식민지 (약 1.5 ML) 두 번 이상을 감추기에 충분 할만큼 0.15M 나트륨 cacodylate (산도 7.2)로 15 분 동안 두 번 잠복기에 의해 화학 퓸 후드 아래에 얼음 한천 블록을 씻어 1X OS 버퍼 (100 MM KH 2 PO 4 10 MM MgCl 2, 산도 6.0).
- 1 시간 동안 화학 퓸 후드 아래에있는 한천 블록을 커버하기 위해 1% 오소 4의 같은 볼륨 [2 ML 오소 4 (2 %) + 2 ML 2X OS 버퍼] 튜브로 (얼음) 추가 후 같은 양의 두 번 씻어 십분 각 1X OS 버퍼.
- 4 튜브가 하룻밤 사이에 남겨 ° 1X 운영 체제 버퍼에 C.
- 정착액이 단계의 모든 세척은 유해 폐기물로 폐기됩니다. 오소 네를 포함한 모든 pipettes은 식물성 기름과 함께 배 씻어서되었습니다.
3. 씻고 탈수
- 십분 파스퇴르 피펫을 사용하여 각각에 대해 차가운 물 위의 동일한 볼륨 두 번 얼음 다음날 아침 와시 한천 차단합니다.
- 25 % 동일한 볼륨, 50 %, 75 % 10 분 10 분 100 % 에탄올 2 세척하여 다음 각 95 % 에탄올로 순차적으로 씻으십시오. 4 박 남겨 ° C 100 % 에탄올 인치
- 이 단계의 모든 세척은 유해 폐기물로 폐기됩니다.
4. 스퍼의 준비
- 다음날 아침 (최대한 빨리)은 스퍼의 시약을 준비 퓸 후드 아래 일회용 플라스틱 비커에 다음 솔루션을 (EM 과학)의 무게. 이 시약을 사용하는 모든 후속 작업 들어, 퓸 후드를 사용하여 계속 진행합니다.
(ERL 4,221 솔루션 5g)
(DER 736 솔루션 4g)
(NSA 솔루션 13g) - 저어 막대를 사용하여 모자에 20 분 이러한 솔루션 (천천히) 믹스
- DMAE 솔루션에게 0.15 그램을 추가하고 위의 20 분 저어.
- 모자에 1-2 시간에 대한 데가스 상기 혼합물.
5. 스퍼의 침투
- 스퍼의 위의 십분 각각에 대해 100 % 객실 임시 에탄올의 동일 볼륨 한천 블록에게 5 번 씻어 만든 마자. 마지막으로 에탄올 세척 후 남아있는 에탄올 그냥 한천 블록을 커버하므로 파스퇴르 피펫을 사용하여 에탄올을 제거합니다.
- 스퍼의 시약 (약 0.5 ML)의 약 동일한 금액을 추가하고 30 분 동안 서있게 다음 실온에서 15 분 동안 바퀴에 튜브를 회전합니다. 30 분 완전히 파스퇴르 피펫을 사용하여 솔루션을 제거한 후에 추가 스퍼는 한천 블록 (약 1.5 ML)를 커버하는이야, 실온에서 15 분 동안 바퀴에 튜브를 회전하고 30 분 동안 서있게합니다. 스퍼의 교체, 회전, 그리고 부화 3 번 이상 반복합니다.
- 마지막 30 분 후에, 스퍼의 시약을 제거하고 블록을 충당하기 위해 새로운 스퍼의를 추가합니다. 한천 블록 4 시간에 대한 온도는 실온에 서 수 있습니다.
- 스퍼의를 교체하고 하룻밤 회전.
- 아침에 스퍼의를 교체하고 다음 날까지 회전 둡니다.
- 다음날 아침 플레이스 스퍼는 다음 금형의 하단 커버 금형에 한천 블록을 추가하는 번호의 실리콘 금형 (피셔 과학)에 있어요. 4 시간 동안 60 ° C에서 알을 품다
- 더 많은 스퍼이고, 부화 60 ° C 하룻밤에있는 금형에서 맨 후 4 시간,.
- 금형에서 블록을 제거 후 블록 아직도 약간 유연 경우, 금형으로 돌아가 추가 이일 품어
6. Sectioning
- Leica Ultracut S 마이크로톰는 가벼운 현미경과 0.1 μ 전송 EM을위한 얇은 섹션 0.5 μ 두꺼운 부분을 절단하는 데 사용되었다.
- 섹션 컷 것처럼 가벼운 현미경 들어, 그들은 DH 2 O의 드롭에 게재되었고, 52 ° C 열 블록에 건조. 말린 섹션은 다음 1.0 % toluidine 파랑, 5~15초 1 %의 나트륨 Borate의 드롭 물들일되었습니다. 얼룩 후 섹션은 즉시 물의 흐름에 따라 씻어 건조, 설치 미디어 (KPL)에서 설명하고 커버 용지는 샘플을 통해 봉인했다.
효모 및 기타 미생물의 패턴 형성을 측정하는 광범위한 관련는 이전에 다음 ID로 한 검토되었습니다. 특히주의의 분열 사회에 대한 상대 조직 미생물 식민지의 증가 기능입니다.
설명한 방법은 큰 전문 식민지 2 삽입하는 방법의 변경이며, 우리의 수정에 대한 간단한 설명 3 게시되었습니다.
야생 S.의 식민지의 중심을 통해 섹션의 가벼운 현미경의 예 cerevisiae 효모 콜로니는 그림 1에 표시됩니다. Asci, pseudohyphae 및 난형 효모 쉽게 구별할 수 있으며, 기본 한천을 침해 식민지의 지역도 분명 있습니다.
효모의 실험실 스트레인 (W303 배경)의 전자 현미경의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이미지 sporulated 세포의 높은 주파수를 포함하고있는 식민지의 영역에서이다.
그림 1. 야생 효모 식민지의 빛 현미경. 이 효모 (YPS133)는 나무 exudates 4 최근에 고립되었다. 식민지 전에 sectioning에 YNA 중간 5 6 일간 incubated했다. 오픈 화살표가 가득한 화살촉은 길쭉한 세포의 체인 (pseudohyphae)와 asci를 나타내는, 채워진 화살표 대표 난형의 식물 세포를 나타냅니다, 대표 asci를 나타냅니다.
그림 2. 실험실 효모 스트레인의 전자 현미경. SH1020 (W303 배경)의 식민지는 3 sectioning하기 전에 YNA 매체에서 6 일간 incubated했다. 이미지 asci 높은 주파수 부분의 영역을 보여줍니다. 화살표는 포자 벽의 이중 계층 구조를 나타냅니다.
그림 3. 식민지 sporulated 세포의 배포판의 부량 : A)는 자신의 긴 쪽 함께 스택 15 인접한 사각형을 포함하는 격자는 식민지 섹션의 이미지의 중심 지역에 겹쳐있다. 의 비율이 지속적으로 유지하면서 그리드는 단지 식민지의 상단과 하단을 포함하기 위해, 크기를 조정합니다. (B & C)는 직사각형의 전체 세포에 상대적으로 각 사각형의 sporulated 세포의 분율은 4 일 이전 (B)과 8 일 이전 (C) 식민지에서 이미지의 육안 검사에 의해 결정됩니다. 예를 들어, 식민지의 상단에있는 직사각형은 ( "1"표시) 그래프의 왼쪽에 해당합니다. 4 식민지의 뜻이 나타납니다, 오차 막대는 표준을 표시합니다. 오류가 발생했습니다.
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Discussion
제출 방법은 식민지의 내부 구조를 보여준다. 방법은 S.의 범위의 셀 유형의 패턴을 결정하는 효과가 있기 때문에 다른 콜로니 morphologies로 cerevisiae의 변종, 또한 관련 종 S. paradoxus 5, 방법은 곰팡이와 다른 미생물의 다양한에서 작동 가능성이 높습니다.
방법의 성공을 위해 한 중요한 단계는 식민지의 상단을 포함한 전체 식민지는, 프로토콜에 걸쳐 한천으로 쌌다는 것을 보장하는 것입니다. 식민지 한천 완전히 쌌다 여부는 toluidine과 청색의 빛을 현미경과 얼룩에 대한 sectioning 후 결정하실 수 있습니다. 얼룩진 부분이 빛을 현미경으로 볼 때, 한천 배지는 포함 매체보다 약간 어두운 얼룩이다. dehydrations 단계 중에 한천 축소, 전체 식민지를 복구하기 위해서는 반드시 그 이유는 1) 안정 단계 1.2의 식민지를 충당하기 위해 한천의 4-5 방울을 추가하고, 2)하지에 오직 측면에서 한천을 트리밍 상단과 하단, 그리고 단지 그것을 단계 1.5 금형 내에 들어갈 수 있도록 충분한 장식.
최적의 섹션에 대한 중요 프로토콜의 두번째 단계는 매체를 포함의 블록의 경도를 포함합니다. 일반적으로 블록은 금형에서 그들을 제거하여, 하룻밤 배양 후 검사합니다. 블록 양손 사이에 개최되는 경우 여전히 유연하고 근육이 수축하면, 그들은 sectioning 위해 아마 열심히하지 않습니다. 이 경우에 그들은 추가적인 48 시간 동안 동일한 온도에서 인큐베이터에 반환하고 위와 같이 retested.
미생물 식민지 내의 세포 유형의 패턴을 감지할 수있는의 의미는 이러한 패턴 가능성이 커뮤니티에 세포의 기능 조직을 반영한다는 것입니다. 사실, 미생물 patterning은 같은 종의 생물이 상호 작용을하는 고대 근본적인 메커니즘이 반영될 수 있습니다. 함께 식민지 3,6에서 유전자 발현의 모니터링 패턴에 대한 방법과 함께이 지역에서 세포 분화의 패턴을 감지하는 능력은 미생물의 패턴 형성의 잠재적인 메커니즘을 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
연구는 NIH에 의해 투자 1R15GM094770했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genetics. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
