Summary
Eine Methode zur Einbettung von Hefe-Kolonien ermöglicht Schnitte für Licht-und Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll erlaubt die Bestimmung der Verteilung der sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen innerhalb Kolonien bietet ein neues Werkzeug zum Verständnis der Organisation von Zelltypen innerhalb eines Pilz-Gemeinschaft.
Abstract
Strukturierung von verschiedenen Zelltypen im Embryo ist ein wichtiger Mechanismus in Metazoen Entwicklung. Gemeinschaften von Mikroorganismen, wie Kolonien und Biofilmen zeigen auch Muster von Zelltypen. Zum Beispiel in der Hefe S. cerevisiae, sind sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen nicht gleichmäßig in Kolonien verteilt. Die funktionelle Bedeutung der Strukturierung und der molekularen Mechanismen, die diese Muster zugrunde liegen, sind noch weitgehend unverstanden.
Eine Herausforderung in Bezug auf die Untersuchung Muster von Zelltypen in Pilzkolonien ist, dass im Gegensatz zu vielzelligen Gewebe, Zellen in Kolonien relativ schwach miteinander verbunden. Insbesondere sollten Sie Pilzkolonien nicht die gleichen umfangreichen Ebene der extrazellulären Matrix in den meisten Geweben gefunden. Hier berichten wir über eine Methode zum Einbetten und Schneiden Hefekolonien, dass das Innere Muster von Zelltypen zeigt in diesen Kolonien. Die Methode kann verwendet werden, um dicke Abschnitte vorbereiten (0,5 μ) sinnvoll für die Lichtmikroskopie und dünne Schnitte (0,1 μ) für Transmissions-Elektronenmikroskopie werden. Asci und pseudohyphal Zellen können leicht von eiförmige Hefezellen mittels Lichtmikroskopie unterschieden werden, während die innere Struktur dieser Zellen können mit Hilfe von EM.
Die Methode basiert auf umliegenden Kolonien mit Agar-Agar, infiltrieren sie mit Spurr das Medium, und dann Schnitte basieren. Kolonien mit einem Durchmesser im Bereich von 1-2 mm eignen sich für dieses Protokoll. Zusätzlich zu visualisieren das Innere der Kolonien, erlaubt das Verfahren die Visualisierung der Region der Kolonie, dass die zugrunde liegenden Agar eindringt.
Protocol
1. Colony Isolierung und Fixierung
- Inkubieren 300 Kolonien auf Agar-Medium für die angegebene Zeit (eine isolierte Kolonie sollte 1-2 mm im Durchmesser).
- Entfernen Kolonie (face up) und die zugrunde liegenden Medium mit einem schmalen Spachtel.
- Einige Tropfen von 2% Agar 42 ° C auf einem Objektträger mit 1 mL Pipetman Spitze und sofort Platz Kolonie auf Agar Gesicht, bevor es erstarrt.
- Einige Tropfen von 2% Agar 42 ° C auf Kolonie und damit zu verfestigen.
- Tragen Sie Handschuhe für alle Schritte für den Rest dieses Protokolls
- Trimmblock mit Rasierklinge und legen Sie sie in einem 3,5 ml Borosilikatglas Schraubverschluss Fläschchen mit 2% Paraformaldehyd / 2% Glutaraldehyd Fixativ für 7 Tage bei 4 ° C.
2. Wäscht und Osmium-Behandlung
- Nach ca. 1 Woche, waschen Agarblöcken auf Eis unter Laborabzug durch Inkubation zweimal für 15 Minuten mit genügend 0,15 Natriumcacodylat (pH 7,2), um vollständig zu bedecken die Kolonie (ca. 1,5 mL), dann noch zweimal für 5 Minuten mit dem gleichen Volumen 1X OS-Puffer (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0).
- Fügen Sie das gleiche Volumen von 1% OsO 4 [2 mL OsO 4 (2%) + 2 mL 2x OS Buffer], um Fläschchen (auf Eis) auf die Agar-Blöcke unter Laborabzug für 1 Stunde decken dann zweimal waschen mit der gleichen Menge 1X OS-Puffer für jeweils 10 Minuten.
- Lassen Sie Vials über Nacht bei 4 ° C in 1X OS-Puffer.
- Fixativ und alle Wäschen in diesem Schritt sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen. Alle Pipetten mit OsO 4 gespült 3X mit Pflanzenöl.
3. Waschen und Dehydration
- Am nächsten Morgen waschen Agarblöcken zweimal auf dem Eis mit dem gleichen Volumen wie oben mit kaltem Wasser für jeweils 10 Minuten mit Pasteurpipette.
- Wash nacheinander mit dem gleichen Volumen von 25%, 50%, 75%, 95% Ethanol für jeweils 10 Minuten um 2 Waschgänge mit 100% Ethanol für 10 Minuten. Lassen Sie über Nacht bei 4 ° C in 100% Ethanol.
- Alle Wäschen in diesem Schritt sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen.
4. Spurr der Vorbereitung
- Am nächsten Morgen (so früh wie möglich) wiegen die folgenden Lösungen (EM Sciences) in einen Einweg-Plastikbecher unter einer Abzugshaube zu Spurr-Reagenz vorbereiten. Für alle weiteren Arbeiten mit diesem Reagens, weiterhin einen Abzug verwenden.
(ERL 4221-Lösung 5 Gramm)
(DER 736-Lösung 4 Gramm)
(NSA Lösung 13 Gramm) - Mischung dieser Lösungen (langsam) für 20 Minuten in der Kapuze mit einem Rührstab
- Add DMAE-Lösung 0,15 Gramm und rühren 20 Minuten wie oben.
- Degas obigen Mischung für 1-2 Stunden in der Kapuze.
5. Spurr die Infiltration
- Sobald Spurr ist gemacht waschen Agarblöcken 5 mal mit gleichem Volumen wie oben von 100% Raumtemp Ethanol für jeweils 10 Minuten. Nach dem letzten Ethanol waschen entfernen Sie den Ethanol mit einer Pasteurpipette, so dass die restliche Ethanol deckt gerade die Agar-Blöcke.
- Fügen Sie etwa die gleiche Menge Spurr-Reagenz (ca. 0,5 mL) und drehen am Rad Fläschchen für 15 Minuten bei Raumtemperatur und dann lassen Sie es 30 Minuten stehen. Nach 30 Minuten entfernen Sie die Lösung vollständig mit einer Pasteurpipette, fügen Spurr auf Agar-Block (ca. 1,5 ml) Deckel ist, drehen Fläschchen auf Rad für 15 Minuten bei Raumtemperatur und lassen Sie es 30 Minuten stehen. Wiederholen Sie die Spurr Nachfolger, Rotation und Inkubation 3 weitere Male.
- Nach der letzten 30 Minuten, entfernen Spurr-Reagenz und fügen frische Spurr ist, um die Blöcke zu decken. Lassen Sie die Agar-Blöcke, um bei Raumtemperatur für 4 Stunden stehen.
- Ersetzen Sie die Spurr und drehen über Nacht.
- Am Morgen ersetzen Spurr und verlassen rotierenden bis zum nächsten Tag.
- Am nächsten Morgen statt Spurr ist in nummerierte Silikonformen (Fisher Scientific) nur auf den Boden der Formen bedecken dann add Agarblöcken die Formen. Inkubation bei 60 ° C für 4 Stunden
- Nach 4 Std., runden die Formen, mit mehr Spurr und Inkubieren bei 60 ° C über Nacht.
- Wenn nach dem Entfernen der Blöcke aus den Formen der Blöcke noch leicht flexibel, um die Formen wieder und inkubieren eine zusätzliche 2 Tage
6. Sectioning
- Ein Leica Ultracut S Mikrotom wurde auf 0,5 μ dicke Schnitte für die Lichtmikroskopie und 0,1 μ dünne Schnitte für die Übertragung EM schneiden.
- Für die Lichtmikroskopie, wie Abschnitte geschnitten wurden, wurden sie auf einen Rückgang von dH 2 O gelegt und getrocknet auf einer 52 ° C Wärme zu blockieren. Getrocknete Schnitte wurden dann mit einem Rückgang um 1,0% Toluidinblau, 1% Sodium Borate für 5-15 Sekunden gefärbt. Nach der Färbung wurden die Schnitte sofort unter einem Strom von Wasser gewaschen, getrocknet, bedeckt in Eindeckmittel (KPL) und ein Deckglas über die Probe versiegelt.
Die breite Relevanz der Messung von Musterbildung in der Hefe und anderen Mikroorganismen wurden bisher 1 Bewertung. Besonders hervorzuheben ist die verbesserte Funktionalität der organisierten Mikrobenkolonien relativ unorganisiert Gemeinden.
Das beschriebene Verfahren ist eine Abwandlung einer Methode zur Einbettung von größeren spezialisierten Kolonien 2 und eine kurze Beschreibung unserer Modifikationen wurde 3 veröffentlicht.
Ein Beispiel für eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Schnitts durch das Zentrum einer Kolonie von wilden S. cerevisiae Hefe Kolonie ist in Abbildung 1 dargestellt. Asci, Pseudohyphen und eiförmig Hefe sind leicht zu unterscheiden, und die Region der Kolonie Eindringen in die zugrunde liegenden Agar ist auch offensichtlich.
Ein Beispiel für eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Labor-Hefestamm (W303 Hintergrund) ist in Abbildung 2 dargestellt. Das Bild ist aus einer Region der Kolonie, die eine hohe Frequenz von sporenbildenden Zellen.
Abbildung 1. Lichtmikroskopie einer wilden Hefe Kolonie. Diese Hefe (YPS133) wurde vor kurzem von Baum Exsudate 4 isolierte. Die Kolonie wurde für 6 Tage auf YNA Medium 5 vor dem Schneiden inkubiert. Offene Pfeile zeigen repräsentative Asci, gefüllt Pfeile zeigen repräsentative eiförmig vegetativen Zellen, gefüllt Pfeilspitzen zeigen Ketten von langgestreckten Zellen (Pseudohyphen) und Asci.
Abbildung 2. Elektronenmikroskopie eines Labor-Hefestamm. Die Kolonie der SH1020 (W303 Hintergrund) war für 6 Tage auf YNA Medium vor dem Schneiden 3 inkubiert. Bild zeigt einen Bereich des Abschnitts mit einer hohen Frequenz von Asci. Ein Pfeil zeigt die bi-Schicht-Struktur der Spore Wand.
Abbildung 3. Die Quantifizierung der Verteilung der sporenbildenden Zellen in Kolonien: A) ein Raster mit 15 angrenzenden Rechtecke entlang ihrer Längsseite gestapelt wird auf den zentralen Bereich eines Bildes von einer Kolonie Abschnitt überlagert. Das Gitter wird so skaliert, ohne dabei die Proportionen konstant, nur deckt den oberen und unteren Rand der Kolonie. (B & C) Der Anteil der sporenbildenden Zellen in jedes Rechteck bezogen auf das Gesamtgewicht Zellen in diesem Rechteck wird durch visuelle Inspektion von Bildern aus 4-Tage alte (B) und 8-Tage-alten (C) Kolonien bestimmt. Zum Beispiel entspricht das Rechteck am oberen Rand der Kolonie (mit "1") auf der linken Seite des Diagramms. Mittel von 4 Kolonien gezeigt; die Fehlerbalken zeigen die std. Fehler.
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Discussion
Die vorgestellte Methode zeigt, die inneren Strukturen der Kolonien. Da die Methode ist effektiv bei der Bestimmung Muster von Zelltypen in einer Reihe von S. cerevisiae-Stämme mit unterschiedlichen Morphologien Kolonie, und auch in einer verwandten Spezies S. paradoxus 5, ist das Verfahren auch am ehesten auf eine breite Palette von Pilzen und anderen Mikroorganismen zu arbeiten.
Ein entscheidender Schritt für den Erfolg der Methode ist, um sicherzustellen, dass die gesamte Kolonie, einschließlich der Spitze der Kolonie, eingehüllt in Agar in das Protokoll. Ob Kolonien sind vollständig gekapselt im Agar kann nach Schneiden für die Lichtmikroskopie und Färbung mit Toluidinblau bestimmt werden. Wenn gefärbten Schnitten unter dem Lichtmikroskop betrachtet werden, ist der Agar-Medium gefärbt etwas dunkler als das Einbettmedium. Da Agar schrumpft während der Dehydratisierungen Schritte, um die gesamte Kolonie wieder sicher sein: 1) 4-5 Tropfen Agar zuverlässig decken die Kolonie in Schritt 1,2, und 2) schneiden Sie die Agar nur an den Seiten, nicht auf oben und unten, und nur so viel schneiden, damit sie innerhalb von Schimmelpilzen in Schritt 1.5 passen.
Eine zweite Stufe des Protokolls, die für eine optimale Abschnitte umfasst die Härte des Blocks von Einbettmedium. In der Regel Blöcke sind nach Inkubation über Nacht untersucht, indem sie aus den Formen. Wenn die Blöcke noch flexibel, wenn zwischen beiden Händen gehalten und gebeugt, sind sie wahrscheinlich nicht hart genug zum Schneiden. In diesem Fall sind sie in den Inkubator bei gleicher Temperatur für weitere 48 Stunden zurückgegeben und erneut wie oben beschrieben.
Die Bedeutung der in der Lage, Muster von Zelltypen innerhalb Mikrobenkolonien erkennen ist, dass diese Muster eher Ausdruck einer funktionellen Organisation von Zellen in Gemeinden. In der Tat kann mikrobielle Strukturierung widerspiegeln alten und fundamentalen Mechanismen, durch die Organismen der gleichen Art zu interagieren. Zusammen mit Methoden zur Überwachung der Genexpression in Kolonien 3,6, kann die Fähigkeit, Muster der Zelldifferenzierung in diesen Gemeinden erkennen helfen, mögliche Mechanismen der mikrobiellen Musterbildung zu testen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Forschung wurde durch die NIH 1R15GM094770 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
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