Summary
En metod för att bädda jäst kolonier möjliggör snittning för ljus-och elektronmikroskopi. Detta protokoll möjliggör bestämning av fördelningen av sporbildande celler och pseudohyphal celler i kolonierna som ger ett nytt verktyg till att förstå organisationen celltyper i en svamp gemenskap.
Abstract
Mönstring av olika celltyper i embryon är en viktig mekanism i flercelliga utveckling. Samhällen av mikroorganismer, såsom kolonier och biofilm visas också mönster av celltyper. Till exempel i jästen S. cerevisiae, är sporbildande celler och pseudohyphal celler inte jämnt fördelad i kolonier. Den funktionella betydelsen av mönstring och de molekylära mekanismer som ligger bakom dessa mönster är fortfarande dåligt kända.
En utmaning när det gäller att undersöka mönster av celltyper i svampkolonier är att till skillnad flercelliga vävnader, celler i kolonier relativt svagt knutna till varandra. I synnerhet innehåller svampkolonier inte samma omfattande grad av extracellulära matrix finns i de flesta vävnader. Här rapporterar vi om en metod för inbäddning och snittning jäst kolonier som avslöjar det inre mönster av celltyper i dessa kolonier. Metoden kan användas för att förbereda tjocka sektioner (0,5 μ) användbara för ljusmikroskopi och tunna sektioner (0,1 μ) lämplig för transmissionselektronmikroskopi. ASCI och pseudohyphal celler kan lätt skiljas från ovala jästceller med ljusmikroskop, medan den inre strukturen av dessa celler kan visualiseras av EM.
Metoden bygger på omgivande kolonier med agar, infiltrera dem med Spurr medellång och sedan snittning. Kolonier med en diameter i storleksordningen 1-2 mm är lämpliga för detta protokoll. Förutom att visualisera det inre av kolonierna, kan metoden visualisering i regionen av kolonin som invaderar den underliggande agar.
Protocol
1. Colony Isolering och Fixering
- Inkubera 300 kolonier på agar medium för den angivna tiden (en isolerad koloni bör vara 1-2 mm i diameter).
- Ta bort koloni (uppåt) och underliggande mediet med en smal spatel.
- Placera några droppar 2% agar 42 ° C på ett objektsglas med 1 mL pipetman spets och placera omedelbart koloni på agar ansikte upp innan det stelnar.
- Placera några droppar 2% agar 42 ° C på koloni och låt stelna.
- Använd handskar för alla steg genom återstoden av detta protokoll
- Trimma block med rakblad och placera dem i en 3,5 ml borosilikatglas skruvkork injektionsflaska innehållande 2% paraformaldehyd / 2% glutaraldehyd fixativ i 7 dagar vid 4 ° C.
2. Tvättar och osmium behandling
- Efter ca 1 vecka, tvätta agar block på isen under kemiska dragskåp genom inkubering två gånger under 15 minuter med tillräckligt med 0,15 natrium cacodylate (pH 7,2) för att helt täcka kolonin (ca 1,5 ml) sedan två gånger till under 5 minuter med samma volym 1X OS buffert (100 mm KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0).
- Tillsätt samma volym på 1% OSO 4 [2 mL Oso 4 (2%) + 2 ml 2x OS buffert] till flaskor (på is) för att täcka agar klossar under kemiska dragskåp i 1 timme tvätta sedan två gånger med samma belopp 1X OS buffert i 10 minuter vardera.
- Lämna flaskor över natten vid 4 ° C i 1X OS buffert.
- Fixativ och alla tvättar i det här steget tas om hand som farligt avfall. Alla pipetter innehåller Oso 4 var sköljas 3X med vegetabilisk olja.
3. Tvätta och Dehydrering
- Nästa morgon tvätta agar block två gånger på is med samma volym som ovan för kallt vatten i 10 minuter vardera med pasteurpipett.
- Tvätta sekventiellt med samma volym av 25%, 50%, 75%, 95% etanol i 10 minuter varje följt av 2 tvättar med 100% etanol i 10 minuter. Lämna över natten vid 4 ° C i 100% etanol.
- Alla tvättar i detta steg tas om hand som farligt avfall.
4. Spurr förberedelser
- Följande morgon (så tidigt som möjligt) Väg av följande lösningar (EM Sciences) i en disponibel plastbägare I ett dragskåp för att förbereda Spurr reagens. För alla efterföljande arbete med denna reagens, fortsätta att använda ett dragskåp.
(ERL 4221-lösning 5 gram)
(DER 736 lösning 4 gram)
(NSA lösning 13 gram) - Blanda dessa lösningar (långsamt) i 20 minuter i köksfläkten med en omrörare
- Lägg DMAE lösning 0,15 gram och rör om 20 minuter enligt ovan.
- Degas över blandningen i 1-2 timmar i huva.
5. Spurr är Infiltration
- Så snart Spurr s görs tvätta agar block 5 gånger med samma volym som ovan för 100% rumstemp etanol i 10 minuter vardera. Efter den sista etanol tvätta bort etanolen med hjälp av en pasteurpipett så att den kvarvarande etanolen bara täcker agar block.
- Tillsätt ungefär en lika stor mängd Spurr reagens (ca 0,5 ml) och rotera flaskorna på hjul i 15 minuter i rumstemperatur och låt stå i 30 minuter. Efter 30 minuter bort lösningen fullständigt genom att pasteurpipett är lägga Spurr att täcka agar blocket (ca 1,5 ml), rotera flaskorna på hjul i 15 minuter i rumstemperatur och låt stå i 30 minuter. Upprepa Spurr ersättare, rotation och inkubation 3 gånger.
- Efter den sista 30 minuter, ta Spurr reagens och tillsätt färsk Spurr är att täcka block. Låt agar blocken stå i rumstemperatur i 4 timmar.
- Byt Spurr s och rotera över natten.
- På morgonen byter Spurr s och lämna rotera till nästa dag.
- Nästa morgon plats Spurr är i numrerade silikon formar (Fisher Scientific) bara för att täcka botten av formarna sedan lägga agar kvarter till mögel. Inkubera vid 60 ° C i 4 timmar
- Efter 4 timmar, toppen på formarna, med mer Spurr s och inkubera vid 60 ° C över natten.
- Om du efter att ta bort block från formarna blocken är fortfarande en aning flexibel, tillbaka till formar och inkubera ytterligare 2 dagar
6. Sektionering
- En Leica Ultracut S mikrotom användes för att skära 0,5 μ tjocka sektioner för ljusmikroskopi och 0,1 μ tunna sektioner för överföring EM.
- För ljusmikroskop, som delar skars, var de placeras på en droppe dH 2 O, och torkas på ett 52 ° C värme block. Torkade sektioner färgas sedan med en nedgång på 1,0% toluidinblått, 1% natriumborat i 5-15 sekunder. Efter färgning var avsnitten omedelbart tvättas under rinnande vatten, torkade, täckt av montering media (KPL), och ett täckglas förseglat under provet.
Den breda betydelsen av att mäta mönster bildas i jäst och andra mikroorganismer har granskats tidigare 1. Av särskilt intresse är den ökade funktionaliteten organiserade mikrobiell kolonier i förhållande till oorganiserad samhällen.
Den beskrivna metoden är en modifiering av en metod för att bädda större specialiserade kolonier 2, och en kort beskrivning av våra ändringar har publicerats 3.
Ett exempel på en ljus mikroskop av ett avsnitt genom centrum av en koloni av vilda S. cerevisiae jäst koloni visas i figur 1. ASCI, pseudohyphae och äggformade jäst är lätta att urskilja, och regionen kolonin invaderar underliggande agar är också uppenbar.
Ett exempel på en elektron mikroskop av ett laboratorium stam av jäst (W303 bakgrund) visas i Figur 2. Bilden är från en region i kolonin som innehåller en hög frekvens av sporbildande celler.
Figur 1. Ljusmikroskopi av en vild jäst koloni. Denna jäst (YPS133) isolerades nyligen från träd exudat 4. Kolonin var inkuberas i 6 dagar på YNA medelstora 5 innan snittning. Öppna pilarna visar representant ASCI, fyllda pilar anger representant äggformade vegetativa celler, fyllda pilar anger kedjor av långsträckta celler (pseudohyphae) och ASCI.
Figur 2. Elektronmikroskopi av ett laboratorium jäst stam. Den koloni av SH1020 (W303 bakgrunden) var inkuberas 6 dagar på YNA medelstora före snittning 3. Bilden visar ett område av avsnittet med en hög frekvens av ASCI. En pil indikerar bi-lager struktur spore väggen.
Figur 3. Kvantifiering av fördelningen av sporbildande celler i kolonier: A) är ett rutnät med 15 angränsande rektanglar staplade längs ena långsidan ovanpå de centrala delarna av en bild av en koloni avsnitt. Rutnätet skalas, samtidigt som dess proportioner konstant, bara täcker toppen och botten av kolonin. (B & C) Den fraktion av sporbildande celler i varje rektangel förhållande till den totala celler i denna ruta bestäms genom visuell inspektion av bilder från 4-dagars gammal (B) och åtta dagar gamla (C) kolonier. Till exempel motsvarar en rektangel på toppen av kolonin (märkt "1") till den vänstra sidan av grafen. Medelvärde av fyra kolonier visas, den felstaplarna visa std. fel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden som presenteras visar det inre strukturer kolonier. Eftersom metoden är effektiv för att bestämma mönster av celltyper i en rad S. cerevisiae stammar med olika koloni morfologier, och även i en besläktad art S. paradoxus 5, är metoden också sannolikt att arbeta på ett brett spektrum av svamp och andra mikroorganismer.
Ett kritiskt steg för att lyckas med metoden är att se till att hela kolonin, bland annat toppen av kolonin, är inkapslad i agar hela protokollet. Vare sig kolonier är helt inneslutet i agar kan bestämmas efter sektionering för ljusmikroskopi och färgning med toluidinblått. När färgade snitt ses av ljusmikroskop, är agarsubstratet färgade lite mörkare än inbäddning medium. Eftersom agar krymper under dehydrations steg, för att få tillbaka hela kolonin se till att: 1) Lägg 4-5 droppar agar ett tillförlitligt täcka kolonin i steg 1,2, och 2) trimma agar bara på sidorna, inte på upptill och nedtill, och bara trimma tillräckligt för att kunna passa in i formar i steg 1,5.
En andra etapp av det protokoll som är avgörande för optimal sektioner innebär hårdhet av blocket för att bädda in medium. Normalt block granskas efter natten inkubation, genom att ta bort dem från formarna. Om blocken är fortfarande flexibla när hålls mellan båda händerna och spände, de är förmodligen inte tillräckligt hårt för sektionering. I det här fallet de återsänds till inkubatorn i samma temperatur i ytterligare 48 timmar och testas på nytt enligt ovan.
Betydelsen av att kunna upptäcka mönster av celltyper inom mikrobiella samhällen är att dessa mönster sannolikt återspeglar en funktionell organisation av celler i samhällen. I själva verket kan mikrobiell mönstring spegla gamla och grundläggande mekanismer genom vilka organismer av samma art samverkar. Tillsammans med metoder för övervakning mönster av genuttryck i kolonier 3,6, kan förmågan att upptäcka mönster av celldifferentiering i dessa samhällen bidra till att testa potentiella mekanismer mikrobiella mönster bildas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Forskningen har finansierats av NIH 1R15GM094770.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genetics. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
