Summary
Un metodo per l'integrazione di colonie di lievito che permette di sezionamento per la microscopia ottica ed elettronica. Questo protocollo consente di determinare la distribuzione delle cellule sporigeni e cellule pseudohyphal all'interno di colonie disposizione un nuovo strumento per comprendere l'organizzazione di tipi di cellule all'interno di una comunità fungine.
Abstract
Patterning di diversi tipi di cellule in embrioni è un meccanismo chiave dello sviluppo metazoi. Comunità di microrganismi, come colonie e biofilm anche visualizzare modelli di tipi di cellule. Per esempio, nel lievito S. cerevisiae, le cellule e le cellule pseudohyphal sporigeni non sono distribuite uniformemente in colonie. L'importanza funzionale di patterning e dei meccanismi molecolari che sono alla base di questi modelli sono ancora poco conosciuti.
Una sfida rispetto a indagare i modelli di tipi di cellule in colonie fungine è che a differenza dei tessuti metazoi, le cellule in colonie sono relativamente debolmente attaccati l'uno all'altro. In particolare, le colonie fungine non contengono lo stesso livello ampia di matrice extracellulare trovano nella maggior parte dei tessuti. Qui riportiamo un metodo per l'integrazione e sezionamento colonie di lievito che rivela i modelli interni di tipi di cellule in queste colonie. Il metodo può essere utilizzato per preparare sezioni spesse (0,5 μ) utile per la microscopia ottica e di sezioni sottili (0,1 μ) adatto per la microscopia elettronica a trasmissione. Cellule aschi e pseudohyphal può essere facilmente distinto da cellule di lievito ovoidale al microscopio ottico, mentre la struttura interna di queste cellule possono essere visualizzati da EM.
Il metodo si basa su colonie circostanti con agar, infiltrandosi con media Spurr, e poi sezionamento. Colonie con un diametro nel range di 1-2 mm sono adatte per questo protocollo. Oltre a visualizzare l'interno delle colonie, il metodo consente la visualizzazione della regione della colonia che invade l'agar sottostante.
Protocol
1. Colonia di isolamento e di fissaggio
- Incubare 300 colonie su agar per il tempo indicato (una colonia isolata dovrebbe essere 1-2 mm di diametro).
- Rimuovere colonia (faccia in su) e medie di fondo con una spatola stretta.
- Mettere alcune gocce del 2% agar 42 ° C su un vetrino da microscopio utilizzando 1 ml Pipetman punta e subito colonia posto sul volto di agar prima si solidifica.
- Mettere alcune gocce del 2% agar 42 ° C in colonia e lasciare solidificare.
- Indossare guanti per tutte le fasi per il resto di questo protocollo
- Blocco assetto con lama di rasoio e metterli in un mL 3,5 borosilicato con tappo a vite fiala contenente 2% paraformaldeide / fissativo glutaraldeide 2% per 7 giorni a 4 ° C.
2. Lavaggi e trattamenti Osmio
- Dopo circa 1 settimana, lavare blocchi di agar su ghiaccio sotto cappa incubando per 15 minuti due volte con abbastanza cacodilato di sodio 0,15 m (pH 7,2) per coprire completamente la colonia (circa 1,5 ml), poi altre due volte per 5 minuti con lo stesso volume di OS 1X tampone (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0).
- Aggiungere lo stesso volume di 1% OsO 4 [2 ml OsO 4 (2%) + 2 ml 2x OS Buffer] per fiale (sul ghiaccio) per coprire i blocchi agar sotto cappa per 1 ora poi lavare due volte con la stessa quantità di OS 1X tampone per 10 minuti ciascuno.
- Lascia fiale notte a 4 ° C in tampone 1X OS.
- Fissativo e tutto lava in questa fase vengono smaltiti come rifiuti pericolosi. Tutte le pipette contenenti OsO 4 sono stati sciacquati 3X con olio vegetale.
3. Lavare e disidratazione
- Il mattino dopo agar blocchi lavare due volte sul ghiaccio con lo stesso volume di cui sopra di acqua fredda per 10 minuti ciascuno utilizzando pipetta Pasteur.
- Lavare in sequenza con lo stesso volume del 25%, 50%, 75%, 95% di etanolo per 10 minuti ciascuno seguito da 2 lavaggi con 100% di etanolo per 10 minuti. Lasciar riposare fino a 4 ° C in 100% di etanolo.
- Tutti i lavaggi in questa fase vengono smaltiti come rifiuti pericolosi.
4. Preparazione di Spurr
- La mattina seguente (il più presto possibile) pesano le seguenti soluzioni (Scienze EM) in un bicchiere di plastica usa e getta sotto una cappa aspirante per la preparazione del reagente Spurr. Per tutti i lavori successivi usando questo reagente, continuare a utilizzare una cappa aspirante.
(ERL 4221 soluzione al 5 grammi)
(DER 736 soluzione di 4 grammi)
(Soluzione NSA 13 grammi) - mix di queste soluzioni (lentamente) per 20 minuti nel cofano con un ancoretta
- Aggiungere la soluzione DMAE 0,15 grammi e mescolare 20 minuti come sopra.
- Degas miscela sopra per 1-2 ore nel cappuccio.
5. Infiltrazione di Spurr
- Appena Spurr è fatta lavare blocchi agar 5 volte con lo stesso volume come sopra del 100% etanolo temperatura ambiente per 10 minuti ciascuno. Dopo il lavaggio etanolo ultima rimuovere l'etanolo con una pipetta Pasteur in modo che l'etanolo residuo copre solo i blocchi di agar.
- Aggiungere circa una pari quantità di reagente Spurr di (circa 0,5 ml) e ruotare fiale sulla ruota per 15 minuti a temperatura ambiente e poi lasciare riposare per 30 minuti. Dopo 30 minuti togliere completamente la soluzione con una pipetta Pasteur, aggiungere Spurr per coprire bloccare agar (circa 1,5 ml), ruotare fiale sulla ruota per 15 minuti a temperatura ambiente e lasciare riposare per 30 minuti. Ripetere la sostituzione della Spurr, la rotazione e l'incubazione altri 3 volte.
- Dopo la finale 30 minuti, rimuovere reagente Spurr e aggiungere nuove Spurr per coprire i blocchi. Lasciare i blocchi agar riposare a temperatura ambiente per 4 ore.
- Sostituire il Spurr e ruotare durante la notte.
- In mattinata sostituire Spurr e lasciare a rotazione fino al giorno successivo.
- Il prossimo Spurr posto mattina in stampi in silicone numerata (Fisher Scientific) solo per coprire il fondo di stampi poi aggiungere blocchi agar per gli stampi. Incubare a 60 ° C per 4 ore
- Dopo 4 ore, in alto fuori gli stampi, con la Spurr più e incubare a 60 ° C durante la notte.
- Se dopo aver rimosso i blocchi dalle muffe i blocchi sono ancora leggermente flessibile, ritorno al stampi e incubare un ulteriore 2 giorni
6. Sezionamento
- Un Ultracut microtomo Leica S è stato usato per tagliare sezioni 0,5 μ di spessore per la microscopia ottica e 0,1 μ sezioni sottili per EM trasmissione.
- Per la microscopia ottica, come sezioni sono stati tagliati, sono stati collocati su una goccia di dH 2 O, ed essiccato su un blocco di calore ° 52 C. Sezioni secchi sono stati poi colorati con un calo del 1,0% blu di toluidina, borato di sodio 1% per 5-15 secondi. Dopo la colorazione, le sezioni sono state lavate immediatamente sotto un getto d'acqua, secchi, coperti di mezzo di montaggio (KPL), e una scivolata busta chiusa sopra il campione.
La rilevanza gamma di misurazione formazione di pattern nel lievito e altri microrganismi sono stati esaminati in precedenza 1. Di particolare nota è la maggiore funzionalità delle colonie microbiche organizzate rispetto alle comunità disorganizzato.
Il metodo descritto è una modifica di un metodo per l'incorporamento più grandi colonie specializzate 2, e una breve descrizione delle nostre modifiche sono state pubblicate 3.
Un esempio di un microscopio luce di una sezione attraverso il centro di una colonia di S. selvaggio lievito Saccharomyces colonia è mostrata in Figura 1. Aschi, pseudoife e lievito ovoidale sono facilmente distinguibili, e la regione della colonia invadere l'agar sottostante è anche evidente.
Un esempio di un microscopio elettronico di un ceppo di lievito di laboratorio (W303 sfondo) è illustrato nella figura 2. L'immagine viene da una regione della colonia che contiene una elevata frequenza di cellule sporigeni.
Figura 1. Microscopia ottica di una colonia di lieviti selvaggi. Questo lievito (YPS133) è stato isolato recentemente da essudati albero 4. La colonia è stato incubato per 6 giorni in media 5 YNA prima di sezionamento. Le frecce indicano aperto rappresentante aschi, frecce piene indicano rappresentante cellule ovoidali vegetativo, punte di freccia pieni indicano catene di cellule allungate (pseudoife) e aschi.
Figura 2. Microscopia elettronica di un ceppo di lievito di laboratorio. La colonia di SH1020 (W303 sfondo) è stata incubata per 6 giorni in media YNA prima di sezionamento 3. Immagine mostra una regione della sezione con una frequenza elevata di aschi. Una freccia indica la bi-strato la struttura della parete spore.
Figura 3. La quantificazione della distribuzione di cellule sporigeni in colonie: A) una griglia contenente 15 rettangoli adiacenti sovrapposti lungo il lato lungo si sovrappone la regione centrale di una immagine di una sezione colonia. La griglia è in scala, mantenendo le proporzioni costante, per ricopra solo la parte superiore e inferiore della colonia. (B & C) la frazione di cellule sporigeni in ogni rettangolo rispetto alle cellule totali in quel rettangolo è determinato mediante ispezione visiva delle immagini da 4 giorni di età (B) e 8 giorni di età (C) colonie. Ad esempio, il rettangolo in alto della colonia (contrassegnata con "1") corrisponde al lato sinistro del grafico. Media di 4 colonie è mostrato, le barre di errore di visualizzazione std. errore.
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Discussion
Il metodo presentato rivela la struttura interna delle colonie. Poiché il metodo è efficace nel determinare i modelli di tipi di cellule in una gamma di S. ceppi di Saccharomyces con diverse morfologie di colonia, e anche in una specie legate S. paradoxus 5, il metodo è anche probabile che il lavoro su una vasta gamma di funghi e altri microrganismi.
Un passo fondamentale per il successo del metodo è quello di garantire che l'intera colonia, compresa la parte superiore della colonia, è racchiuso in agar in tutto il protocollo. Se le colonie sono completamente racchiusi in agar può essere determinato dopo sezionamento per la microscopia ottica e colorazione con blu di toluidina. Quando sezioni colorate sono visti al microscopio ottico, l'agar è macchiato leggermente più scuro del mezzo di inclusione. Perché riduce agar durante le fasi disidratazioni, al fine di recuperare l'intera colonia assicurarsi di: 1) aggiungere 4-5 gocce di agar per coprire affidabile la colonia al passo 1.2, e 2) tagliare la agar solo sui lati, non su parte superiore e inferiore, e solo tagliare abbastanza per permettergli di rientrare in stampi a passo 1.5.
Una seconda fase del protocollo che è fondamentale per le sezioni ottimale comporta la durezza del blocco di embedding media. Di solito i blocchi sono esaminati dopo incubazione durante la notte, togliendo loro dagli stampi. Se i blocchi sono ancora flessibili quando si svolgono tra le due mani e flesso, che probabilmente non sono abbastanza per sezionamento. In questo caso vengono restituiti al incubatore alla stessa temperatura per ulteriori 48 ore e ripetere il test come sopra.
L'importanza di essere in grado di individuare modelli di tipi di cellule all'interno di colonie microbiche è probabile che questi modelli rispecchiano una organizzazione funzionale delle cellule in comunità. Infatti, patterning microbica può riflettere meccanismi antichi e fondamentale attraverso il quale gli organismi della stessa specie interagiscono. Insieme con i metodi di monitoraggio per i modelli di espressione genica in colonie 3,6, la capacità di rilevare pattern di differenziazione delle cellule in queste comunità può aiutare a testare potenziali meccanismi di formazione microbica modello.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
La ricerca è stata finanziata dal NIH 1R15GM094770.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
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