Una analitica Tool-box per la valutazione completa biochimici, strutturali e trascrittoma di biofilm orale mediata da Mutans Streptococchi

Summary

Biofilm formato sulla superficie dei denti sono molto complesse ed esposte a continue sfide innata ed esogeni ambientali, che modulano la loro architettura, fisiologia e trascrittoma. Abbiamo sviluppato una serie di strumenti per esaminare la composizione, l'organizzazione strutturale e di espressione genica dei biofilm orali, che possono essere adattati ad altre aree di ricerca biofilm.

Abstract

Biofilm sono altamente dinamici, comunità organizzate e strutturate di cellule microbiche invischiato in una matrice extracellulare di densità variabile e composizione ^{1, 2.} In generale, i biofilm si sviluppano da iniziale attaccamento microbica su una superficie seguita dalla formazione di ammassi di cellule (o microcolonie) e l'ulteriore sviluppo e la stabilizzazione del microcolonie, che si verificano in una complessa matrice extracellulare. La maggior parte dei esopolisaccaridi porto matrici biofilm (EPS), e biofilm dentali non fanno eccezione, in particolare quelli associati con la malattia di carie, che sono per lo più mediati da streptococchi mutans ^3. L'EPS sono sintetizzati da microrganismi (S. mutans, un contributo fondamentale) per mezzo di enzimi extracellulari, come glucosyltransferases utilizzando saccarosio principalmente come substrato ^3.

Studi di biofilm formato sulla superficie dei denti sono particolarmente impegnativo a causa della loro esposizione costante ai problemi ambientali associati alle complesse dieta-host-microbica interazioni che avvengono nella cavità orale. Una migliore comprensione dei cambiamenti dinamici della organizzazione strutturale e la composizione della matrice, della fisiologia e trascrittoma / proteoma profilo di biofilm-cellule in risposta a queste complesse interazioni avrebbe ulteriormente avanzare le conoscenze attuali di come biofilm orale modulare patogenicità. Pertanto, abbiamo sviluppato un strumento analitico-box per facilitare l'analisi biofilm a livello strutturale, biochimico e molecolare, combinando le tecniche comunemente disponibili e nuovi con misura software per l'analisi dei dati. Standard di analisi (test colorimetrici, RT-qPCR e microarray) e nuove tecniche di fluorescenza (per l'etichettatura simultanea di batteri e EPS) sono stati integrati con software specifico per l'analisi dei dati per affrontare la complessa natura della ricerca biofilm orali.

Il tool-box è composto da 4 fasi distinte ma interconnesse (Figura 1): 1) saggio biologico, 2) Raw Data Input, 3) Data Processing, e 4) Analisi dei dati. Abbiamo utilizzato il nostro modello in vitro di biofilm e alle specifiche condizioni sperimentali per dimostrare l'utilità e la flessibilità dello strumento-box. Il modello di biofilm è semplice, riproducibile e più replicati di un singolo esperimento può essere fatto contemporaneamente ^{4, 5.} Inoltre, permette la valutazione temporale, l'inclusione di varie specie microbiche ⁵ e la valutazione degli effetti delle diverse condizioni sperimentali (trattamenti ad esempio ^6; confronto di mutanti knockout vs ceppo parentale ^5; carboidrati disponibilità ^7). Qui, descriviamo due componenti specifiche del tool-box, tra cui (i) un nuovo software per microarray data mining / organizzazione (MDV) e l'analisi di imaging di fluorescenza (DUOSTAT), e (ii) in situ EPS di etichettatura. Forniamo anche un caso sperimentale che mostra come il tool-box può aiutare con l'analisi biofilm, i dati di organizzazione, integrazione e interpretazione.

Protocol

1. FASE 1 - biotest

Il metodo di biofilm utilizza dischi di idrossiapatite (HA) come surrogato del dente (Clarkson Cromatografia Products, Inc., Sud Williamsport, PA, USA; superficie = 2.7 ± 0.2 cm ²⁾ ricoperto con la saliva (imitando la presenza della pellicola acquisita), posta in posizione verticale ^{4, 5, 8.}

1. Saggi biochimici.
   1. I biofilm sono (i) omogeneizzato da sonicazione ⁹ o (ii) mantenuto intatto per le analisi biochimiche ^8. La sospensione omogeneizzato biofilm può essere utilizzato per la determinazione della biomassa (peso secco), proteine ​​totali, inorganico, ed extracellulari e intracellulari polisaccaridi composizione / contenuti (vedi dettagli in Lemos et al. Protocolli per studiare la fisiologia di biofilm orale ^8). Il biofilm intatto possono essere analizzati per il loro risposte fisiologiche di pH utilizzando le normali glicolitico-drop, l'acido-uccisione, permeabilità protonica e F-ATPasi saggi di attività (vedi dettagli nel Lemos et al. Protocolli per studiare la fisiologia di biofilm orale ^8).
2. Analisi del trascrittoma.
   1. Standard di cDNA microarray e RT-qPCR protocolli (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html ad esempio) possono essere usati in combinazione per la determinazione del trascrittoma-risposta di patogeni specifici (ad esempio S. mutans) biofilm all'interno di varie sfide ambientali e terapeutiche in vari stadi di sviluppo ^{6, 7, 10, 11.} Nella casella degli strumenti, abbiamo inserito due metodi che sono fondamentali per l'analisi del trascrittoma di biofilm dentali: 1) la qualità dell'RNA (a causa della eterogeneità delle popolazioni biofilm e la presenza di EPS-matrice), e 2) di data mining e l'interpretazione (a causa di set di dati di grandi dimensioni generati dai microarray).
      • Isolamento del RNA. Per affrontare la questione della qualità di RNA estratto da biofilm, si usa un protocollo ottimizzato sviluppato appositamente per l'isolamento e la purificazione di RNA da cellule batteriche invischiati in EPS ricco di matrice ¹² (http://dx.doi.org/10.1016/j . ab.2007.03.021). Questo protocollo fornisce Numero di integrità dell'RNA (RIN) superiore a 8,5, che è considerato ottimale per l'analisi del trascrittoma utilizzando sia RT-qPCR e Microarrays (per gli esempi, vedere ^{6, 11).}
3. Imaging di fluorescenza. Organizzazione strutturale dei biofilm.
   1. La maggior parte dei protocolli di imaging di fluorescenza confocale disponibili in letteratura si concentra sulla etichettatura microbica. L'analisi di EPS come componente principale di biofilm è stata largamente trascurata nella ricerca biofilm orale, che coinvolge l'imaging di fluorescenza, con poche eccezioni ^{5, 13, 14.} Abbiamo sviluppato una tecnica di etichettatura romanzo e software specifici per la visualizzazione riproducibile e la quantificazione delle cellule batteriche e di EPS simultaneamente all'interno biofilm intatto. Amira 5 (Visage Imaging GmbH, Berlino, Germania) è utilizzato per la ricostruzione 3D del biofilm, mentre COMSTAT (disponibile presso http://www.imageanalysis.dk) e DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) forniscono il analisi quantitativa.
      1. Imaging di organizzazione strutturale di EPS-batteri nel biofilm. Il Alexa Fluor 647-etichettati destrano coniugato viene utilizzato per visualizzare le EPS-matrice. Il fluorescente marcato destrano funge da primer per streptococco glucosyltransferases-gtfs (in particolare GtfB e GtfC), e può essere contemporaneamente incorporati durante la sintesi della matrice exopolysaccharide nel corso di biofilm sviluppo ^11.
         
         EPS etichettatura:
         1. Idrossiapatite dischi cappotto con la saliva, sterilizzata per filtrazione per 1h, seguendo la "Preparazione biofilm" protocollo ^8.
         2. Pipettare 2,8 mL di terreno di coltura in ciascun pozzetto di 24 piastre, e portare a una stanza buia.
         3. Aggiungere 1 microM di destrano coniugato Alexa Fluor in terreno di coltura, miscela colorante in terreno di coltura pipettando su e giù (circa 10 volte).
         4. Dip-lavare la saliva rivestite HA (SHA) dischi (dopo 1 ore di incubazione), due volte in tampone sterile AB e metterli in mezzo contenente destrano coniugato con Alexa Fluor.
         5. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare a 37 ° C, 5% di CO _2. La durata del tempo di incubazione dipende da ogni disegno sperimentale. Il destrano fluorescente non macchia le cellule batteriche in concentrazioni utilizzate in questo comedire ^11. Altri EPS-tecniche di colorazione, come nel caso Calcofluor ^14, può essere utilizzato in combinazione.
      2. Batteri etichettatura:
         1. Componenti batteri nel biofilm sono etichettate al termine della formazione di biofilm utilizzando acido nucleico macchia fluorescente (per esempio SYTO 9), altre tecniche di fluorescenza (ad esempio determinate specie fluorescenti anticorpi marcati ¹⁵ o GFP-cellule che esprimono ¹⁶⁾ può essere ovviamente utilizzato per individuare una o più specie batteriche nel biofilm. La Figura 2 mostra l'etichettatura simultanea di EPS (rosso) e batteri / microcolonie (verde) in una immagine 3D di un 24-h vecchio S. biofilm mutans formata sulla superficie del disco SHA.
         2. Acquisizione delle immagini: ogni biofilm è scansionato a 5 a 10 posizioni selezionati in modo casuale, e z serie sono generati da sezionamento ottico a ciascuna di queste posizioni di microscopia confocale a scansione laser utilizzando protocolli standard. Usiamo un Olympus FV 1000 microscopio a due fotoni (Olympus, Tokyo, Giappone) equipaggiato con x10 (Carl Zeiss; apertura numerica 0,45; lavoro 3-4 mm di distanza) o x25 (Olympus LPlan N; NA 1,05; WD 2 mm) di acqua immersione obiettivi. La lunghezza d'onda di eccitazione è 810 nm, e d'onda di emissione filtro per SYTO 9 (batteri) è 495/540 OlyMPFC1 filtro, mentre il filtro per Alexa Fluor 647 (EPS) è HQ655/40M-2P filtro. Salvare e archiviare immagini raw.

2. FASE 2 - RAW INGRESSO DEI DATI

I dati di input prime da test biochimici e RT-qPCR direttamente nel file di dati grezzi (CDR-MS Excel). Per i dati di microarray, caricare un solo canale le immagini di diapositive scansionate in JCVI spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) o software simili. Creare una griglia posto secondo le specifiche JCVI e poi regolare manualmente per adattarsi a tutti i punti all'interno della griglia. Misurare i valori di intensità di ogni spot e salva in ". MeV" file e memorizzati in "I dati grezzi Microarray".

3. FASE 3 - INFORMATICA

Organizzare i dati grezzi (biochimici e RT-qPCR) in RDF per l'analisi statistica. Trasferirli in "file di dati elaborati" (DPF - MS Excel). Per l'imaging di fluorescenza e analisi microarray, software specifici (attualmente disponibili e su misura) sono utilizzati per elaborare i dati.

1. Microarray di dati:
   1. Inviare i dati grezzi generati nella fase 2 (memorizzata in "dati grezzi Microarrays") per la normalizzazione passo dati utilizzando un software specifico. Normalizzare i dati utilizzando il JCVI microarray dati di analisi del software MIDAS (http://www.tm4.org/midas.html). Usa Lowess e regolarizzazione deviazione standard con le impostazioni predefinite, seguita da in-scivolo analisi ripetute. Memorizzare i file contenenti i dati normalizzati. In questa fase (prime file di dati e file di dati normalizzati pronto), deposito di dati di microarray in una banca dati di accesso del pubblico (ad esempio NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo), e registrare il numero di accesso per riferimento futuro.
2. Dati di imaging di fluorescenza
   1. Biofilm struttura quantificazione.
      1. I dati quantitativi corrispondenti a ciascun componente strutturale (EPS e batteri) dei biofilm è calcolato COMSTAT e DUOSTAT di nuova concezione, che sono stati scritti come script in MATLAB 5.1. Le immagini raw fluorescenza vengono caricate nel software e analizzati come segue:
         • Usa COMSTAT per calcolare biomassa, spessore, distribuzione strato e altri parametri che quantificano e caratterizzano la struttura tridimensionale dei biofilm (consultare il manuale a http://www.imageanalysis.dk).
         • Usa DUOSTAT per calcolare la co-localizzazione delle due componenti biofilm, come EPS e batteri (o specie microbiche diverse e / o componenti extracellulari):
           1. Impostare il percorso di DUOSTAT in MATLAB 5.1, e le cartelle di un'immagine aperta che includono le immagini dei due componenti biofilm.
           2. Scegliere i due canali che verranno correlati e analizzati. Le due pile immagine deve avere dimensioni di pixel identici in tutte le tre dimensioni (x, y, z), e lo stesso numero di immagini in ogni stack.
           3. Impostare le soglie per ogni canale, secondo l'uomoUAL di COMSTAT. Seguire le istruzioni nell'interfaccia funzionamento del software (vedi articolo video, manuale DUOSTAT a http://www.imageanalysis.dk). Ingresso i dati ottenuti in DPF. Vedi esempio in Figura 4.4.
      2. Tridimensionale biofilm ricostruzione.
         1. L'architettura tridimensionale del biofilm viene visualizzato per mezzo Amira. Importare le immagini memorizzate in fluorescenza "Cartella prime immagini" in software e usare il rendering voltex e iso-superficie per creare rendering 3-D di ciascuno dei componenti del biofilm (vedi Amira manuale a http://www.amira.com / documentazione / manuali-and-release-notes.html). Vedi esempio in Figura 4.4.

4. FASE 4 - ANALISI DEI DATI

I dati quantitativi da biochimici, RT-qPCR e COMSTAT-DUOSTAT saggi nel DPF sono pronti per l'analisi statistica. Dopo l'analisi statistica viene eseguita, grafici e / o tabelle possono essere costruite (vedi sezione "Risultati Rappresentante").

1. Microarray dati dell'organizzazione utilizzando un software di Microarray dati Visualizer (MDV).

A causa della complessità e l'uscita di grandi insiemi di dati quando si utilizzano microarray e molteplici condizioni sperimentali, abbiamo progettato un software di data mining e organizzazione denominata Microarray dati Visualizer (MDV) ⁷ (disponibile all'indirizzo http://www.oralgen.lanl.gov/) .

Dopo aver effettuato l'analisi statistica usando BRB-ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) con un valore di cutoff P di 0,001 per la previsione di classe e per il confronto di classe, i dati generati possono essere presentate a MDV, come segue:

1. Utilizzando Excel, convertire i dati in BRB MDV delimitato da tabulazioni file di testo. Rimuovere tutte le lettere che vengono con il numero di tag Gene Locus, ad esempio: SMU.1423c, eliminare la lettera "c".
2. MDV aperto. Andate su File, e selezionare "Seleziona origine Annotazione". Scegliere "File Flat". Quando appare la finestra di dialogo, utilizzare i pulsanti Sfoglia per scegliere i file che contengono annotazioni per il nome del gene, Gene Ontology (GO) il numero, percorso e dati di classificazione funzionale.
3. Andate su File, e importare tutti i file dal punto 1. Ognuno dei file rappresenta le condizioni sperimentali per l'analisi. Se ci sono più condizioni per l'analisi, per esempio due distinti trattamenti (trattamento 1 e 2) e controllo (veicolo) andare al punto 4.
4. In questo caso, i confronti possibili sono: (A) trattamento 1 vs controllo (per i geni espressi in modo differenziale a causa del trattamento 1); (B) il trattamento 2 vs controllo; e (C) 1 trattamento trattamento vs 2. A seconda delle ipotesi di lavoro, diverso set di geni che possono essere selezionati.
5. Selezionare solo i geni differenzialmente espressi in confronto A (geni unici influenzati dal trattamento 1 solo). In questo caso, utilizzare la funzione di sottrarre dal menu Set di funzioni. Sottrarre i geni da B rispetto ad A, e salvare il risultato. Poi, sottrarre C dai dati risultanti. Le stesse azioni si può fare per ottenere solo i geni in B (unica geni influenzati dal trattamento 2 solo).
6. Per selezionare solo i geni individuati sia in A e B, utilizzare la funzione Unione dal menu Set di funzioni per combinare il risultato per i confronti A e B, e salvare il risultato. Poi sottrarre C dai dati risultato.
7. Queste azioni possono essere visualizzate utilizzando diagrammi di Venn, presenti in MDV, che è più intuitiva e facilita l'ipotesi-driven organizzazione dei dati. Il diagramma di Venn dati in uscita vengono visualizzati nella schermata (vedi la visione dello schermo in Figura 3 e dell'articolo video).
   
8. Per salvare i dati delimitato da tabulazioni file di testo, andare su File e scegliere Esporta.
9. Esportare il file delimitati da tabulazioni testo. Aprirli con Excel, e organizzare i dati in uscita da MDV in tabelle e / o di optare per un display grafico (si vedano le figure 4.2, 4.3 e articolo video).

5. RAPPRESENTANTE RISULTATI

Qui abbiamo un esempio di come il tool analitico-box integra i vari metodi di uno studio di biofilm con più variabili e delle condizioni sperimentali.

Caso sperimentale:

Dinamica di Streptococcus mutans trascrittoma in risposta a amido e saccarosio durante biofilm sviluppo ^7.

Di fondo:

Le interazioni di amido e saccarosio nella dieta con l'amilasi salivare e ospitare glucosyltransferases streptococco potrebbe migliorare la formazione e la virulenza di S. mutans nel biofilm da incrementiAsing esopolisaccaridi sintesi, metabolismo degli zuccheri e acidogenicity ^11. Questo complesso ospite-patogeno-diet interazione può modulare la formazione di biofilm patogeni legati alla malattia carie dentale. Abbiamo condotto un'analisi completa biochimici e trascrittomica (incluso il profilo genomico intero) per capire meglio come S. mutans risponde a amido e saccarosio in fasi distinte di sviluppo biofilm in presenza di amilasi ^7.

Il tool di analisi-box è stato usato per aiutarci ad integrare i test biochimici e molecolari del biofilm formati in varie condizioni sperimentali e punti di tempo. La produzione complessiva dei dati utilizzando il tool analitico-box si presenta in un modo sequenziale in figura 4 (4,1-4,4). È interessante notare che il focus principale è quello di dimostrare l'utilità dello strumento-box piuttosto che l'interpretazione dei dati e la discussione.

1. Combinando i test biochimici e RT-qPCR per selezionare le condizioni sperimentali per ulteriori analisi microarray. Inizialmente, abbiamo testato 6 saccarosio distinti e 5 amido diverse combinazioni di saccarosio e di selezionare le concentrazioni ottimali di carboidrati per lo sviluppo di biofilm di S. mutans utilizzando il nostro modello in vitro. La capacità di analizzare simultaneamente i dati in uscita dal biotest ci ha guidati nella scelta di tre concentrazioni specifiche (evidenziato in Figura 4.1) sulla base (elevato) quantità di esopolisaccaridi insolubili e (interpolati) espressione di gtfB (responsabili della sintesi glucano insolubile) nel biofilm .
2. Microarray analisi. Selezionati (tre) le concentrazioni dei carboidrati alimentari sono stati utilizzati per formare biofilm, che sono stati rimossi in tempo specifico i punti che riflettono le varie fasi del processo di sviluppo del biofilm. Il biofilm (divisi in 3 gruppi sperimentali e 4 tempi punti) sono stati sottoposti ad analisi del trascrittoma, combinando profiling tutto genomica (cDNA microarray) con-BRB Array Tools e MDV.
   
   L'RNA è stato estratto e purificato utilizzando biofilm specifico protocollo ^12, e poi sottoposto ad analisi con microarray i 4 step del processo analitico Tool-Box. Figura 4.2 illustra come la MDV aiutato a selezionare i geni di interesse secondo la nostra ipotesi di lavoro che la combinazione di saccarosio e amido di trigger specifica risposta trascrizionale associato con maggiore virulenza (potenziali cariogeni) di S. mutans nel biofilm. I dati grezzi generati da BRB-ArrayTools (Figura 4.2a) è stato elaborato dal MDV utilizzando il Diagramma di Venn (Figura 4.2b). In questo studio, il gruppo di geni legati alla nostra ipotesi sono quelle differenzialmente espressi in confronto A (0,5% di saccarosio + 1 amido% vs 1% di saccarosio) e B (0,5% di saccarosio + 1% di amido rispetto al 0,5% di saccarosio), ma non i geni a confronto C (0,5% di saccarosio vs 1% di saccarosio) (Figura 4.2ae 4.2b). Come mostrato nella Figura 4.2c, il MDV notevolmente ridotto il numero totale di geni da analizzare e allo stesso tempo, filtrata-out i geni non direttamente connessi con l'influenza di saccarosio e amido in combinazione. L'uscita MDV dati è stato anche convertito in un display grafico che mostra i dati organizzati per classe funzionale di ciascuno dei geni espressi in modo differenziale (up-e down-regolato) in amido + saccarosio-biofilm (vs saccarosio-grown biofilm) ad ogni dei 4 tempi-punti (Figura 4.3). Il software MDV è user-friendly e facilitato l'estrazione / organizzazione dei dati di grandi dimensioni e complessa serie di esperimenti microarray.
3. . Biofilm immagini Contemporaneamente, l'organizzazione strutturale del biofilm è stato analizzato utilizzando COMSTAT-DUOSTAT-Amira incluse nel tool-box (si veda l'esempio della ricostruzione 3D e analisi quantitativa dell'amido + saccarosio-biofilm cresciuto nella Figura 4.4, vedi anche il video articolo). La morfologia, la distribuzione e il rapporto strutturale di EPS e microcolonie possono essere visualizzati utilizzando il rendering di immagini 3D di superficie da Amira. Primi piani di area selezionata può essere generato, che illustra i rapporti strutturali specifici batteri-EPS a microscala (Figura 4.4). Inoltre, la stessa serie di immagini confocali potranno essere utilizzati dalla COMSTAT-DUOSTAT per la biomassa / microcolony misure, distribuzione spaziale e colocalizzazione delle cellule batteriche e di EPS contemporaneamente. Per esempio, la distribuzione verticale di EPS e batteri dalla superficie del disco alla fase fluida è stata calcolata per ogni sezione ottica delle immagini tridimensionali biofilm confocale utilizzando COMSTAT-DUOSTAT (grafico in Figura 4.4;. Vedi articolo video). I dati mostrano percentuali più alte di EPS (linea rossa) rispetto ai batteri (linea verde) in tutta la profondità di biofilm. Inoltre, la maggior parte delle cellule batteriche sono associate con EPS (linea blu), soprattutto negli strati media ed esterna del biofilm. Questa osservazione indica che i biofilm cresciuto in amido e saccarosio sono particolarmente ricche di exopolymers, che sono nelle sue maglie (in primo contatto con) la maggior parte delle cellule batteriche; tale organizzazione strutturale migliora la stabilità e la coesione del biofilm ^13. Tridimensionale rendering e misurazioni quantitative delle immagini confocale fornire ulteriori informazioni sulla struttura del biofilm, che integra i dati di espressione genetica e biochimica (aumento GtfB di tipo insolubile-glucano sintesi di S. mutans in amido + saccarosio-grown biofilm) (per ulteriori esempi si veda ^{5, 6, 11, 13).}
   
   L'analitica Tool-Box ci ha aiutato ad ottenere, organizzare e integrare i dati provenienti da test biologici diversi, che ha fornito un'analisi completa di come S. mutans possono rispondere ai cambiamenti ambientali complesse a causa della dieta interazioni ospite-trovato nella cavità orale (vedi dettagli a Klein et al, 2009 ^11;.. Klein et al, 2010 ^7).

Figura 1. Flow-chart del analitica Tool-Box per l'analisi biofilm.

Figura 2. Confocale Imaging di fluorescenza di EPS e batteri nel biofilm. Visualizzazione simultanea di EPS (rosso) e batteri / microcolonie (verde) nel rendering tridimensionale di biofilm Streptococcus mutans formata sulla superficie del disco SHA.

Figura 3. Microarray Data mining e organizzazione dei dati di Microarray Con Visualizer (MDV) Software. L'uso della funzione di diagrammi di Venn per selezionare i geni di interesse, e seguito con l'aggiunta del nome del gene e l'annotazione della classe funzionale.

Figura 4.1. Valutazione della formazione di biofilm di S. mutans mediante test biochimici (A) e RT-qPCR (B). I dati INS (esopolisaccaridi insolubile) correlano bene con il pattern di espressione gtfB, e con la biomassa del biofilm. Saccarosio a 1% è stata la concentrazione per la formazione INS massima espressione gtfB e l'accumulo di biofilm sulla superficie del CSA, mentre lo 0,5% di saccarosio è stata la concentrazione minima necessaria per lo sviluppo di biofilm ottimale utilizzando il nostro modello in vitro. S. mutans cellule coltivate in presenza di saccarosio 0,5% amido + 1% ha dato la più alta biomassa, e ha presentato più INS di biofilm altri, correlata alla maggiore espressione gtfB (B2). Queste concentrazioni di carboidrati sono state selezionate per ulteriori analisi del trascrittoma.

Figura 4.2. Microarray analisi dei dati utilizzando-BRB Array Tools in combinazione con il software MDV. a) Rappresenta il numero di geni individuati come differenzialmente espressi in ogni confronto (A, B o C) e il punto di volta valutati usando-BRB Array Tools. b) I dati di Microarray Visualizer (MDV) utilizzando il diagramma di Venn per selezionare i geni di interesse. c) I geni selezionati in base ad analisi MDV.

Figura 4.3. S. mutans geni differenzialmente espressi in amido + saccarosio-biofilm (vs saccarosio-biofilm) a vari punti di tempo organizzato per classe funzionale. Annotazioni gene si basano sulle informazioni fornite dal Los Alamos National Laboratory (www.oralgen.lanl.gov) o dalla letteratura pubblicata disponibili presso il sito stesso.

Figura 4.4. Tridimensionale rendering e COMSTAT-DUOSTAT analisi di amido + saccarosio-biofilm.

Discussion

In questa presentazione, abbiamo dimostrato due componenti critici del analitica Tool-Box (EPS / batteri imaging e microarray data mining / elaborazione), la versatilità e l'utilità dei vari metodi integrato nel sistema. Chiaramente, il tool-box facilitato l'analisi completa (comparativa) e simultanea dei diversi aspetti della biochimica biofilm, l'architettura e l'espressione genica in risposta alle diverse condizioni sperimentali utilizzando un modello in vitro. ⁷ Considerando i cambiamenti dinamici e complessi dei organizzazione strutturale, le risposte fisiologiche e trascrittoma di S. mutans (e di altri agenti patogeni) in biofilm, un'analisi integrata potrebbe aiutare a capire meglio come biofilm modulare patogenicità nella cavità orale. Attualmente stiamo incorporando specie-specifiche di etichettatura e di analisi metagenomica / metaprotemic nel analitica Tool-Box, che aumenterebbe la capacità di indagare più in dettaglio le complesse interazioni ecologiche e cambiamenti strutturali nel nostro misti specie modello biofilm ^5.

Inoltre, questo strumento (e tutti i biotest) è flessibile, aggiornabile con add-ons (metaproteome tale e superficie dura analisi; in corso), e può essere adattato / modificato per applicazioni al di fuori della ricerca biofilm orali. Ad esempio, il MDV potrebbe essere particolarmente utile per gli altri settori connessi biofilm utilizzando intero genoma profiling per il confronto di molteplici condizioni sperimentali, come ad esempio comparativo-trascrittoma di distinti (mutanti) ceppi o in risposta ad agenti terapeutici.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syto 9	Invitrogen	S34854
Syto 60	Invitrogen	S11342
Dextran conjugated alexa 647	Invitrogen	D22914
Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope	Olympus Corporation