Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans

Summary

Biofilms formados en la superficie de los dientes son muy complejas y expuestas a constantes desafíos ambientales innata y exógenos, que modulan su arquitectura, la fisiología y transcriptoma. Hemos desarrollado un conjunto de herramientas para examinar la composición, organización estructural y la expresión génica de los biofilms orales, que pueden adaptarse a otras áreas de investigación del biofilm.

Abstract

Los biofilms son muy dinámicos, las comunidades organizadas y estructuradas de las células microbianas inmersos en una matriz extracelular de la densidad y la composición variable de ^{1, 2.} En general, los biofilms se desarrollan a partir fijación microbiana inicial sobre una superficie seguido por la formación de grupos de células (o microcolonias) y el desarrollo y la estabilización de las microcolonias, que se producen en una matriz extracelular complejo. La mayoría de los exopolisacáridos del biofilm matrices puerto (EPS), y las biopelículas dentales no son una excepción, especialmente los relacionados con la enfermedad de caries, que son en su mayoría mediada por estreptococos mutans ^3. Las EPS son sintetizadas por los microorganismos (S. mutans, un contribuyente clave) por medio de enzimas extracelulares, tales como la sacarosa principalmente glucosiltransferasas utilizando como sustrato ^3.

Estudios de biofilms formados en la superficie de los dientes son particularmente difíciles debido a su exposición constante a los problemas ambientales asociados con la dieta compleja microbiana de acogida interacciones que ocurren en la cavidad oral. Una mejor comprensión de los cambios dinámicos de la organización estructural y composición de la matriz, la fisiología y transcriptoma / profile proteoma del biofilm las células en respuesta a las complejas interacciones permitirían mejorar el conocimiento actual de cómo los biofilms orales modular patogenicidad. Por lo tanto, hemos desarrollado una caja de herramientas analíticas para facilitar el análisis del biofilm en los planos estructurales, bioquímicos y moleculares mediante la combinación de las técnicas comúnmente disponibles y la novela con hechos a medida de software para análisis de datos. Estándar de análisis (ensayos colorimétricos, RT qPCR y microarrays) y nuevas técnicas de fluorescencia (para el etiquetado simultánea de bacterias y EPS) se han integrado con un software específico para el análisis de datos para hacer frente a la compleja naturaleza de la investigación biofilm oral.

La caja de herramientas se compone de 4 pasos distintos pero conectados entre sí (Figura 1): 1) Los bioensayos, 2) datos primarios de entrada, 3) Procesamiento de Datos, y 4) Análisis de datos. Hemos utilizado nuestro modelo in vitro de biopelículas y condiciones experimentales para demostrar la utilidad y la flexibilidad de la caja de herramientas. El modelo de biofilm es simple, reproducible y múltiples repeticiones de un mismo experimento se puede hacer al mismo tiempo ^{4, 5.} Además, permite la evaluación temporal, la inclusión de especies microbianas diversas ⁵ y la evaluación de los efectos de las distintas condiciones experimentales (por ejemplo, tratamientos de ^6, la comparación de mutantes knockout contra la cepa parental ^5; disponibilidad de hidratos de carbono ^7). Aquí se describen dos componentes específicos de la caja de herramientas, incluyendo (i) un nuevo software para minería de datos de microarrays / organización (MDV) y el análisis de fluorescencia de imagen (DUOSTAT), y (ii) in situ EPS-etiquetado. También ofrecemos un caso experimental que muestra cómo la caja de herramientas puede ayudar con el análisis de biofilms, los datos de la organización, integración e interpretación.

Protocol

1. PASO 1 - bioensayos

El método de biofilm utiliza discos de hidroxiapatita (HA) como sustituto del diente (Clarkson Productos Cromatografía, Inc., South Williamsport, Pensilvania, EE.UU.; superficie = 2,7 ± 0,2 cm ²⁾ cubierto con saliva (simulando la presencia de la película adquirida), puesto en posición vertical, ^{4, 5, 8.}

1. Los ensayos bioquímicos.
   1. Los biofilms son: (i) homogeneizadas por sonicación ⁹ o (ii) mantenerse intacta para los ensayos bioquímicos ^8. La suspensión homogeneizada biofilms pueden ser utilizados para la determinación de la biomasa (peso seco), proteínas totales, inorgánicos, y polisacáridos extracelulares e intracelulares composición / contenido (ver detalles en Lemos et al., Protocolos para estudiar la fisiología de las biopelículas oral ^8). Las biopelículas intactas pueden ser analizados por sus respuestas fisiológicas utilizando estándares glucolítica pH baja, el ácido para matar, la permeabilidad de protones ATPasa y F-ensayos de actividad (ver detalles en Lemos et al., Protocolos para estudiar la fisiología de las biopelículas oral ^8).
2. El análisis del transcriptoma.
   1. Estándar los protocolos de cDNA microarrays y RT-PCR cuantitativa (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html, por ejemplo) se puede utilizar en combinación para la determinación del transcriptoma de respuesta de patógenos específicos (por ejemplo, S. mutans) dentro de los biofilms a varios retos ambientales y terapéuticos en diferentes etapas de desarrollo ^{6, 7, 10, 11.} En la caja de herramientas, hemos incluido dos métodos que son críticos para el análisis de transcriptoma de las biopelículas dentales: 1) la calidad del ARN (debido a la heterogeneidad de las poblaciones de biofilm y la presencia de EPS-matriz), y 2) la minería de datos y la interpretación (debido a la grandes conjuntos de datos generados por microarrays).
      • El aislamiento de ARN. Para abordar el tema de la calidad del ARN extraído de las biopelículas, se utiliza un protocolo optimizado específicamente desarrollado para el aislamiento y purificación de ARN de las células bacterianas enredado en EPS matriz rica en ¹² (http://dx.doi.org/10.1016/j . ab.2007.03.021). Este protocolo proporciona el número de la integridad del ARN (RIN) por encima de 8,5, lo que se considera óptimo para el análisis de transcriptoma utilizando RT-PCR cuantitativa y reactivos (por ejemplo, véase ^{6, 11).}
3. Fluorescencia de imagen. Organización estructural de las biopelículas.
   1. La mayoría de los protocolos de imagen confocal de fluorescencia en la literatura se centra en la etiqueta microbiana. El análisis de las EPS como un componente importante de la biopelícula se ha descuidado mucho en la investigación del biofilm orales implican imágenes de fluorescencia, con pocas excepciones, ^{5, 13, 14.} Hemos desarrollado una técnica de etiquetado de la novela y un software específico para la visualización y cuantificación reproducible de las EPS y las células bacterianas al mismo tiempo dentro de los biofilms intacto. Amira 5 (Visage Imaging GmbH, Berlín, Alemania) se utiliza para la reconstrucción en 3D de las biopelículas, mientras que COMSTAT (disponible en http://www.imageanalysis.dk) y DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) proporcionan la el análisis cuantitativo.
      1. Imagen de la organización estructural de la EPS-bacterias en las biopelículas. El Alexa Fluor 647-dextrano marcado con el conjugado se utiliza para visualizar la EPS-matriz. El marcado con fluorescencia dextrano sirve como un manual para estreptococos glucosiltransferasas-gtfs (especialmente GtfB y GtfC), y puede ser al mismo tiempo, incorporados durante la síntesis de la matriz de exopolisacáridos en el transcurso de biofilm de desarrollo ^11.
         
         EPS etiquetado:
         1. Discos de capa de hidroxiapatita con la saliva, esterilizada por filtración durante 1 hora, después de la "Preparación Biofilm" protocolo ^8.
         2. Pipetear 2,8 ml de medio de cultivo en cada pocillo de placas de 24 pocillos, y llevar a un cuarto oscuro.
         3. Añadir una M de dextrano conjugado con Alexa Fluor en medio de cultivo, la mezcla de contraste en medio de cultivo con la pipeta hacia arriba y abajo (10 veces).
         4. Dip-lavar la cubierta de saliva-HA (SHA) discos (después de 1 h de incubación) dos veces en buffer estéril AB y colocarlos en el medio que contiene dextrano conjugado con Alexa Fluor.
         5. Cubrir la placa con papel de aluminio e incubar a 37 ° C, 5% de CO _2. La duración del tiempo de incubación depende de cada diseño experimental. La etiqueta fluorescente dextrano no mancha las células bacterianas en las concentraciones utilizadas en este comodecir ^11. Otros EPS-técnicas de coloración, como con calcofluor ^14, se puede utilizar en combinación.
      2. Las bacterias en el etiquetaje:
         1. Componentes de las bacterias en biofilms son etiquetados en la final de la formación de biopelículas con estándar de ácido nucleico mancha fluorescente (por ejemplo, SYTO 9), otras técnicas de fluorescencia (por ejemplo, especies específicas marcadas con fluorescencia de anticuerpos ¹⁵ o que expresan GFP ¹⁶ células) puede ser, por supuesto, utilizar para detectar una o más especies de bacterias en las biopelículas. La figura 2 muestra el etiquetado simultáneo de EPS (rojo) y las bacterias / microcolonias (verde) en una imagen 3D de una S. de 24 h de edad mutans biofilm formado en la superficie de un disco del SCS.
         2. Adquisición de las imágenes: Cada biofilm es escaneado de 5 a 10 posiciones elegidas al azar, y la serie Z son generados por el corte óptica a cada una de estas posiciones por microscopía confocal de barrido láser a través de protocolos estándar. Nosotros usamos una Olympus FV 1000 de dos fotones microscopio (Olympus, Tokio, Japón) equipado con x10 (Carl Zeiss, apertura numérica 0,45; trabajo mm distancia entre 3-4) o x25 (Olympus LPlan N, NA 1,05; WD 2 mm) de agua objetivos de inmersión. La longitud de onda de excitación 810 nm, longitud de onda de emisión y de filtro para SYTO 9 (bacteria) es 495/540 OlyMPFC1 filtro, mientras que el filtro de Alexa Fluor 647 (EPS) es HQ655/40M-2P filtro. Guardar y almacenar imágenes en bruto.

2. PASO 2 - entrada de datos primarios

Datos de la entrada bruta de ensayos bioquímicos y RT-qPCR directamente en archivos de datos en bruto (RDF-archivo de MS Excel). Para los datos de microarrays, la carga de un solo canal imágenes de las diapositivas escaneadas en JCVI Spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) o software similar. Crear una red de punto de acuerdo a las especificaciones de JCVI y luego ajustar manualmente para adaptarse a todos los puntos dentro de la cuadrícula. Medir los valores de intensidad de cada punto y guardar en ". Mev" los archivos y se almacena en "Raw Microarray datos".

3. PASO 3 - INFORMÁTICA

Organizar los datos en bruto (bioquímicos y RT-qPCR) en el RDF para el análisis estadístico. Transferirlos a "archivo de datos procesados" (DPF - archivo de MS Excel). Para el análisis de imágenes de microarrays y de fluorescencia, un software específico (actualmente disponibles o hechos a medida) se utilizan para procesar los datos.

1. Los datos de microarrays:
   1. Presentar los datos en bruto generado en el paso 2 (almacenada en "datos de Microarrays Raw") de paso de normalización de datos mediante un software específico. Normalizar los datos utilizando el JCVI microarrays de análisis de datos de software MIDAS (http://www.tm4.org/midas.html). Use LOWESS y regularización desviación estándar con la configuración predeterminada, seguido por análisis repetidos en diapositivas. Almacenar los archivos que contiene los datos normalizados. En esta etapa (archivos de datos y archivos de datos normalizado lista), el depósito de datos de microarrays en una base de datos de acceso público (por ejemplo, NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) de bases de datos en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo), y registrar el número de acceso para futura referencia.
2. Fluorescencia de imágenes de datos
   1. Biofilm cuantificación estructura.
      1. Los datos cuantitativos correspondientes a cada componente estructural (EPS y bacterias) de las biopelículas se calcula COMSTAT y el DUOSTAT de nuevo desarrollo, que fueron escritas como secuencias de comandos de MATLAB 5.1. Las imágenes de fluorescencia primas se cargan en el software y analizados de la siguiente manera:
         • Use COMSTAT para calcular la biomasa, el grosor, la capa de distribución y otros parámetros que cuantificar y caracterizar la estructura tridimensional de las biopelículas (consulte el manual en http://www.imageanalysis.dk).
         • Use DUOSTAT para calcular la co-localización de los dos componentes del biofilm, como EPS y las bacterias (o diferentes especies microbianas y / o componentes extracelulares):
           1. Establecer el camino de la DUOSTAT en MATLAB 5.1, y abrir las carpetas de imágenes que incluyen las imágenes de los dos componentes del biofilm.
           2. Elija los dos canales que se correlacionan y analizan. Las dos pilas de la imagen también debe tener idénticos tamaños de píxeles en las tres dimensiones (x, y, z), y el mismo número de imágenes en cada pila.
           3. Establecer los umbrales para cada canal de acuerdo con el hombreindividuales de COMSTAT. Siga las instrucciones en la interfaz de software de operación (véase el artículo de vídeo, manual de DUOSTAT en http://www.imageanalysis.dk). Entrada de los datos obtenidos en DPF. Véase el ejemplo en la Figura 4.4.
      2. Tridimensional biofilms reconstrucción.
         1. La arquitectura tridimensional de las biopelículas se visualiza usando Amira. Importe las imágenes de fluorescencia almacenados en "carpeta de imágenes en bruto" en el software, y utilizar la representación Voltex e iso de superficie para crear versiones en 3-D de cada uno de los componentes en las biopelículas (ver manual de Amira en http://www.amira.com / Documentación / manuales-y-soltar-notes.html). Vea el ejemplo en la Figura 4.4.

4. PASO 4 - ANÁLISIS DE LOS DATOS

Los datos cuantitativos de la bioquímica, la RT-PCR cuantitativa y ensayos COMSTAT-DUOSTAT en el DPF están listos para el análisis estadístico. Después de que el análisis estadístico se lleva a cabo, gráficos y / o tablas se pueden construir (ver "Los resultados representativos" sección).

1. Microarrays de datos de la organización el uso de software de datos de microarrays visualizador (MDV).

Debido a la complejidad y la salida de grandes conjuntos de datos cuando el uso de microarrays y múltiples condiciones experimentales, se ha diseñado un software de minería de datos y organización de datos de microarrays llamado visualizador (MDV) ⁷ (disponible en http://www.oralgen.lanl.gov/) .

Después de llevar a cabo el análisis estadístico utilizando CUB-ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) con un valor de p de corte de 0,001 para la predicción de la clase y la clase de comparación, los datos generados pueden ser presentadas a MDV, de la siguiente manera:

1. El uso de Excel, convertir los datos en archivos de BRB MDV texto delimitados por tabuladores. Eliminar todas las cartas que vienen con la etiqueta el número de genes Locus, por ejemplo: SMU.1423c, eliminar la letra "c".
2. Abrir MDV. Vaya a Archivo y seleccione "Seleccionar origen de anotación". Seleccione la opción "archivo plano". Cuando aparece el cuadro de diálogo, utilice los botones Examinar para seleccionar los archivos que contienen la anotación para el nombre de genes, Gene Ontology (GO) número, camino, y los datos de clasificación funcional.
3. Vaya a Archivo, y la importación de cada uno de los archivos de la partida 1. Cada uno de los archivos representa las condiciones experimentales para el análisis. Si hay varias condiciones para el análisis, por ejemplo, dos tratamientos distintos (tratamiento 1 y 2) y control (vehículo) pase al punto 4.
4. En este caso, las comparaciones posibles son: (A) un tratamiento frente al control (de los genes expresados ​​diferencialmente debido al tratamiento 1), (B) 2 vs tratamiento de control, y (C) vs tratamiento un tratamiento 2. Dependiendo de la hipótesis de trabajo, conjunto diferente de genes pueden ser seleccionados.
5. Seleccionar sólo los genes expresados ​​diferencialmente en una comparación. (Genes únicos afectados por el tratamiento sólo 1) En este caso, utilizar la función de restar en el menú Conjunto de funciones. Restar los genes de B respecto de A, y guardar el resultado. A continuación, restar C de los datos resultantes. Las mismas acciones se pueden hacer para que sólo los genes B (genes únicos afectados por el tratamiento 2.)
6. Para seleccionar sólo los genes detectados, tanto en A y B, utilice la función de la Unión en el menú Conjunto de funciones para combinar los resultados de las comparaciones A y B, y guardar el resultado. Luego reste C de los datos del resultado.
7. Estas acciones se pueden visualizar mediante diagramas de Venn, que aparece en MDV, que es más intuitivo y facilita la hipótesis impulsada por la organización de datos. El diagrama de Venn de datos de salida se mostrará en la pantalla (ver la vista de pantalla en la Figura 3 y el artículo de vídeo).
   
8. Para guardar los datos en archivos de texto delimitados por tabuladores, vaya a Archivo y seleccione Exportar.
9. Exportar los archivos de texto delimitados por tabuladores. Abierta usando Excel, y organizar la salida de datos de MDV en tablas y / o encubierta a una pantalla gráfica (ver figuras 4.2, 4.3 y el artículo de vídeo).

5. Los resultados representativos

Aquí ofrecemos un ejemplo de cómo la caja de herramientas de análisis integra los ensayos distintos de un estudio bio-película con múltiples variables y condiciones experimentales.

Experimentales de caso:

Dinámica de Streptococcus mutans transcriptoma en respuesta al almidón y la sacarosa durante el desarrollo del biofilm ^7.

Antecedentes:

Las interacciones de almidón de la dieta y la sacarosa con la amilasa salival y anfitrión glucosiltransferasas estreptococo podría mejorar la formación y la virulencia de S. mutans en los biofilms por incrementosAsing síntesis de exopolisacáridos, el metabolismo del azúcar y acidogenicidad ^11. Este complejo huésped-patógeno-dieta puede modular la interacción de la formación de biofilms patógenos relacionados con la enfermedad de la caries dental. Se realizó un análisis exhaustivo bioquímicos y transcriptómica (incluyendo perfil genómico total) para entender mejor cómo S. mutans responde al almidón y la sacarosa en las distintas etapas de desarrollo del biofilm en la presencia de amilasa ^7.

La caja de herramientas de análisis se utilizó para que nos ayuden en la integración de los ensayos bioquímicos y moleculares de los biofilms formados bajo diferentes condiciones experimentales y los puntos de tiempo. La salida de datos general con la caja de herramientas de análisis se presenta de una manera secuencial en la Figura 4 (4.1 a 4.4). Es de destacar que el principal objetivo es demostrar la utilidad de la caja de herramientas en lugar de interpretación de los datos y la discusión.

1. La combinación de los ensayos bioquímicos y RT-qPCR para seleccionar las condiciones experimentales para el análisis de microarrays más. En un principio, hemos probado seis distintos sacarosa y almidón de 5 diferentes combinaciones de sacarosa para seleccionar las concentraciones óptimas de los hidratos de carbono para el desarrollo de biopelículas de S. mutans usando nuestro modelo in vitro. La posibilidad de examinar de manera simultánea la salida de datos de los bioensayos nos guió en la selección de tres concentraciones específicas (resaltado en la Figura 4.1), basado en (elevada) cantidad de exopolisacáridos insoluble y (mejorada) expresión de gtfB (responsable de la síntesis de glucano insoluble) en las biopelículas .
2. Análisis de microarrays. El seleccionado (tres) las concentraciones de los carbohidratos de la dieta se utilizaron para formar biopelículas, que fueron retirados en determinados puntos de tiempo que refleja las distintas etapas del proceso de desarrollo de biofilms. Los biofilms (divididos en 3 grupos experimentales y 4 puntos de tiempo) se sometieron a análisis de transcriptoma mediante la combinación de perfil genómico completo (cDNA microarrays) con las herramientas y matrices CUB-MDV.
   
   El ARN fue extraído y purificado utilizando biopelículas específicas de protocolo ^12, y luego se somete a los microarrays de análisis a través del paso 4, el proceso de análisis de la caja de herramientas. La Figura 4.2 ilustra cómo el MDV ayudaron a seleccionar los genes de interés de acuerdo con nuestra hipótesis de trabajo que la combinación de sacarosa y almidón desencadena una respuesta específica de la transcripción asociados con la virulencia mayor (potencial cariogénico) de S. mutans en los biofilms. La información bruta obtenida por BRB-ArrayTools (Figura 4.2a) fue procesado por el MDV con el diagrama de Venn (Figura 4.2b). En este estudio, el grupo de genes relacionados con nuestra hipótesis son aquellos expresados ​​diferencialmente en comparación con un (0,5% de sacarosa + 1% de almidón frente a 1% de sacarosa) y B (0,5% de sacarosa + 1% de almidón frente a 0,5% de sacarosa), pero no los genes en comparación con C (0,5% de sacarosa frente al 1% de sacarosa) (Figura 4.2ay 4.2b). Como se muestra en la figura 4.2c, el MDV reducido enormemente el número total de genes que analizar y al mismo tiempo, filtrada a los genes no directamente relacionados con la influencia de la sacarosa y el almidón en combinación. La salida de datos MDV se convirtió también en una pantalla gráfica que muestra los datos organizados por la clase funcional de cada uno de los genes expresados ​​diferencialmente (arriba y abajo-regulados) en el almidón de sacarosa + biofilms (vs. crecido sacarosa biofilms) en cada de los 4 puntos de tiempo (Figura 4.3). El software de MDV es fácil de usar y facilita la extracción / organización de los datos grandes y complejos conjuntos de experimentos de microarrays nuestro.
3. . Biofilm de imágenes Al mismo tiempo, la organización estructural de las biopelículas se analizó mediante COMSTAT-DUOSTAT-Amira incluido en la caja de herramientas (ver un ejemplo de la reconstrucción en 3D y el análisis cuantitativo del almidón + sacarosa crecido biofilm en la figura 4.4, también se ve artículo de vídeo). La morfología, la distribución y la relación estructural de las EPS y microcolonias se pueden visualizar mediante la representación 3D de la superficie de Amira. Vistas en primer plano de la zona seleccionada se puede generar, lo que ilustra las relaciones estructurales específicas de las bacterias-EPS en la microescala (Figura 4.4). Además, el mismo conjunto de imágenes confocal puede ser procesado por COMSTAT-DUOSTAT para las mediciones de la biomasa / microcolonias, distribución espacial y la colocalización de las células bacterianas y EPS de manera simultánea. Por ejemplo, la distribución vertical de las EPS y las bacterias de la superficie del disco de fase líquida se calculó a partir de cada sección óptica de las imágenes en tres dimensiones biofilm confocal utilizando COMSTAT-DUOSTAT (gráfico de la figura 4.4;. Véase el artículo de vídeo). Los datos muestran una mayor proporción de EPS (línea roja) que las bacterias (línea verde) a través de la profundidad de las biopelículas. Además, la mayoría de las células bacterianas se asocian con EPS (línea azul), sobre todo en las capas media y externa de la biopelícula. Esta observación indica que las biopelículas crecido en el almidón y la sacarosa son particularmente ricos en exopolímeros, que entremezclar (en primer contacto con la mayoría) de las células bacterianas, la organización estructural, mejora la estabilidad y la cohesión de las biopelículas ^13. Las representaciones tridimensionales y las mediciones cuantitativas de imágenes confocal proporcionar información adicional sobre la estructura del biofilm, que complementa los datos de expresión génica y bioquímicos (mayor GtfB de tipo insoluble-glucano síntesis de S. mutans en almidón + biofilms sacarosa crecido) (para ver ejemplos ^{5, 6, 11, 13).}
   
   La caja de herramientas de análisis nos ayuda a obtener, organizar e integrar los datos de los ensayos biológicos diferentes, que proporcionan un análisis exhaustivo de cómo S. mutans puede responder a los complejos cambios del medio ambiente como resultado de las interacciones huésped-dieta en la cavidad oral (ver detalles en Klein et al, 2009 ^11;.. Klein et al, 2010 ^7).

Figura 1. Diagrama de flujo de la caja de herramientas analíticas para el análisis de biofilm.

Figura 2. Imagen confocal de fluorescencia de las EPS y las bacterias en biofilms. Visualización simultánea de EPS (rojo) y las bacterias / microcolonias (verde) en la representación tridimensional de Streptococcus mutans biofilm formado en la superficie del disco del SCS.

Figura 3. Microarrays minería de datos y organización utilizando los datos de microarrays visualizador (MDV) de software. El uso de la función de diagrama de Venn para seleccionar a los genes de interés, y seguido por la adición del nombre de genes y la anotación de la clase funcional.

Figura 4.1. Evaluación de la formación del biofilm de S. mutans con ensayos bioquímicos (A) y RT-PCR cuantitativa (B). Los datos del INS (exopolisacáridos insoluble) se correlacionan bien con el patrón de expresión gtfB, y con la biomasa de las biopelículas. Sacarosa al 1% fue la concentración máxima para la formación del INS, la expresión y la acumulación de biofilm gtfB en la superficie, mientras que sHA sacarosa al 0,5% fue la concentración mínima necesaria para el desarrollo del biofilm óptima gracias a nuestro modelo in vitro. S. mutans células cultivadas en presencia de sacarosa al 0,5% + 1% de almidón producido la mayor cantidad de biomasa, y presentado más de biofilms INS otros, que se correlaciona con una mayor expresión gtfB (B2). Estas concentraciones de hidratos de carbono fueron seleccionados para el análisis de transcriptoma más.

Figura 4.2. Microarrays de análisis de datos utilizando matrices CUB-Herramientas en conjunción con software de MDV. a) Representar el número de genes detectados como diferencialmente expresado en cada comparación (A, B o C) y el punto de tiempo evaluados con matriz BRB-Tools. b) los datos de microarrays visualizador (MDV) usando el diagrama de Venn para seleccionar los genes de interés. c) Los genes seleccionados de acuerdo con el análisis de MDV.

Figura 4.3. S. genes expresados ​​diferencialmente en mutans almidón + sacarosa-biopelículas (biofilms vs sacarosa) en varios puntos temporales organizadas por la clase funcional. Anotaciones de genes se basan en información proporcionada por el Laboratorio Nacional Los Alamos (www.oralgen.lanl.gov) o por la literatura publicada disponible en el mismo sitio web.

Figura 4.4. Tridimensional la representación y el análisis COMSTAT-DUOSTAT de almidón + sacarosa biofilm.

Discussion

En esta presentación, hemos demostrado dos componentes fundamentales de la caja de herramientas analíticas (EPS / bacterias de imágenes y datos de microarrays de minería / procesamiento), la versatilidad y utilidad de los diversos análisis integrado en el sistema. Claramente, la caja de herramientas facilita el análisis integral (comparativa) y simultánea de los distintos aspectos de la bioquímica de las biopelículas, la arquitectura y la expresión génica en respuesta a las diferentes condiciones experimentales utilizando un modelo in vitro. ⁷ Teniendo en cuenta los cambios dinámicos y complejos de la organización estructural, las respuestas fisiológicas y transcriptoma de S. mutans (y otros patógenos) en las biopelículas, un análisis integrado podría ayudar a comprender mejor cómo los biofilms modular la patogenicidad en la cavidad oral. En la actualidad estamos incorporando especies específicas de etiquetado y el análisis de metagenómica / metaprotemic en la caja de herramientas de análisis, lo que aumentaría la capacidad de investigar con más detalle las complejas interacciones ecológicas y los cambios estructurales en nuestro modelo de biofilm de especies mixtas ^5.

Además, esta herramienta (y todos los bioensayos) es ampliable flexible, con add-ons (metaproteome tal y superficie dura-análisis, en curso), y se puede adaptar / modificados para aplicaciones fuera de la investigación biofilm oral. Por ejemplo, el MDV podría ser particularmente útil para otros campos relacionados con la biopelícula utilizando todo el genoma de perfiles para la comparación de múltiples condiciones experimentales, como por ejemplo comparativo del transcriptoma de los distintos (mutante) de las cepas o en respuesta a los agentes terapéuticos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syto 9	Invitrogen	S34854
Syto 60	Invitrogen	S11342
Dextran conjugated alexa 647	Invitrogen	D22914
Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope	Olympus Corporation