HIV指向性は、ウイルスエンベロープのV3領域から推測することができます。 V3は、PCRには、ネストされたRT – PCR、配列決定を用いてtriplicateで増幅し、バイオインフォマティクスのソフトウェアを使用して解釈されます。低G2Pスコア1以上のシーケンス(S)とを有するサンプルは、非R5ウイルスとして分類されています。
背景:前HIV治療のCCR5アンタゴニストのクラスから薬を受け取るために、患者は彼または彼女のウイルスの人口は、別のコレセプターを細胞侵入のためにCCR5コレセプターを使用し、ないことを確認するために、HIVの親和性の試験を受ける必要があります。親和性のテストへの一つのアプローチは、コレセプターと相互作用するHIVのエンベロープのV3領域の配列を調べることです。
方法:ウイルスRNAは、血漿から抽出されます。 V3領域は、ネストされた逆転写酵素- PCRによる三重に増幅されます。増幅を配列決定し、ソフトウェア、RE_Callを用いて分析している。シーケンスは、V3領域からウイルス親和性を推測するなどgeno2phenoなどのバイオインフォマティクスのアルゴリズムに送信されます。配列は、そのgeno2pheno偽陽性率は、以下の5.75パーセントを下回る場合は、非R5と推定されています。サンプルからの3つのシーケンスのいずれかが非R5ように推論される場合は、患者はCCR5拮抗薬に反応するそうです。
ここで紹介する方法は、トロピズムのテストに適用される標準的なシーケンシング法です。ウイルス親和性を予測するための順序HIVエンベロープV3ループの臨床応用は遅れて限定されているまで。このメソッドは、最低でも臨床的に使用される他、検証アッセイと比較してウイルス親和性を予測することも同様にできるように、マラビロック(Viivソフトウェアヘルスケア)の臨床試験のレトロスペクティブ分析では、示されている。
親和性の予測のためのV3ループの遺伝子型解析を行うために多くの利点があります。まず第一に、この手順を大幅にアクセシビリティを向上させ、親和性のテストの所要時間を削減、運用シーケンシング装置でどんな施設で行うことができます。比較では、親和性試験のためのゴールドスタンダードとなってきた表現型の強化された感度のTrofileアッセイ(ESTA)(モノグラムバイオサイエンス)は、南カリフォルニアに1拠点で実施される。その他の利点は、以下の出発材料と500copies/mLの最低限必要な血漿中ウイルス量の要件が含まれています。同様に、遺伝子型分析を実行するの運用コストは、表現型アッセイのものに比べて相対的に低くなっています。特にリコールのソフトウェアの使用は、遺伝子型解析の労働集約的な部分になりがちマニュアルシーケンスの見直し、必要がなくなります。
ここで紹介する方法は重要で、別のoutweighingなく特定のステップで、非常に簡単です。我々は、PCRを実行すると、サンプルのウイルス集団内でのキャプチャ少数の種のオッズを向上させるために三重にシーケンシングを示唆している。 3以上がしかし、私たちが発見した、実行可能な複製は、効率的で信頼性の両方に三連。我々はまた、高い感度と特異性を維持しながら、同じ反応で、RT – PCRと第一ラウンドのPCRの両方を実行するワンステップ逆転写PCRキット(キアゲン)を使用することをお勧めします。
The authors have nothing to disclose.
このアッセイの開発は、Viivソフトウェアヘルスケアと健康研究(CIHR)のカナダの協会によっておよび博士ハリのための臨床ウイルス学のグラクソスミスクライン/ CIHR議長を通じてサポートされていました。
ファイザーとViivソフトウェアヘルスケアが提供するサポートしています。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0 | ||||
NucliSens easyMAG Magnetic Silica | bioMerieux | cat. # 280133 | (48 x 0.6 ml) | |
NucliSens easyMAG Lysis Buffer | bioMerieux | cat. # 280134 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 | bioMerieux | cat. # 280130 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 | bioMerieux | cat. # 280131 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 | bioMerieux | cat. # 280132 | (4 x 1000 ml) | |
NucliSens easyMAG version 1.0 | bioMerieux | |||
Class II A2 biological safety cabinet | ||||
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR | ||||
DEPC-treated water | Ambion Corp. | cat. # 9922 | ||
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty | Invitrogen | cat#12574-035 | Kit components used: – SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix – 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4) |
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Expand High Fidelity PCR System | Roche Diagnostics | cat. # 1 759 078 | Kit components used: – Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2) – Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl) – MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4) |
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dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP | Roche Diagnostics | cat. # 11969064001 | (100 mM) | |
Sucrose | Sigma | cat. # S0389-500G | ||
Bromophenol blue sodium salt | Sigma | cat.# B5525 | ||
Cresol Red | Sigma | cat.# 114472-5G | indicator grade | |
Thermocycler | ||||
Gel Electrophoresis | ||||
50X TAE buffer | Invitrogen | cat. # 24710030 | (1000 ml) | |
SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen Life Technologies | cat. # S33102 | ||
Agarose (ultra pure) | Invitrogen | cat. # 15510-027 | ||
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder | Invitrogen Life Technologies | cat. # 12373-031 | ||
Reagent Grade Type II water | ||||
Gel apparatus | ||||
Sequencing | ||||
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit | Applied Biosciences | cat. # 4337458 | (25000 reactions) | |
Hi-Di Formamide | Applied Biosciences | cat. # 4311320 | ||
Sodium Acetate (NaOAc) | Sigma | cat. # S-2889 | ||
EDTA | Sigma-Aldrich | Cat.# 03690-100ML | 0.5M, pH=8.0 | |
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution | Sigma | cat. # T-2819 | 1 M, pH 9.0 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | cat. # M-1028 | 1 M | |
95% Ethanol | ||||
Running Buffer (10X) with EDTA | Applied Biosystems | cat. # 4335613 | 500 mL | |
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) | Applied Biosystems | cat. # 44363929 or cat. # 4352759 | ||
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit | Applied Biosciences | Cat# 4336943 | ||
Thermocycler | ||||
Centrifuge with plate holders | ||||
3730xl DNA Analyzer | Applied Biosciences |