Summary
HIV Tropismus kann aus der V3-Region der Virushülle abgeleitet werden. V3 ist die PCR in dreifacher Ausfertigung mit nested RT-PCR, Sequenzierung verstärkt und interpretiert mit Bioinformatik-Software. Proben mit mit 1 oder mehreren Sequenz (en) mit niedrigen G2P Partituren sind als nicht-R5-Virus klassifiziert.
Abstract
Hintergrund: Vor dem Empfang eines Medikaments aus CCR5-Antagonisten-Klasse in der HIV-Therapie, muss sich ein Patient eine HIV-Tropismus-Test, um zu bestätigen, dass seine virale Population der CCR5 Korezeptor verwendet für die zelluläre Eintrag, und nicht eine Alternative Korezeptor. Ein Ansatz zur Tropismus Tests ist es, die Reihenfolge der V3-Region des HIV-Envelope, die mit dem Korezeptor interagiert untersuchen.
Methoden: Viral RNA wird aus Blutplasma gewonnen. Die V3-Region ist in dreifacher Ausfertigung mit verschachtelten Reverse-Transkriptase-PCR amplifiziert. Die Verstärkungen werden dann sequenziert und analysiert die Verwendung der Software RE_Call. Die Sequenzen werden dann zu einer bioinformatischen Algorithmen wie geno2pheno auf virale Tropismus aus der V3-Region schließen eingereicht. Die Sequenzen werden geschlossen, um nicht-R5 werden, wenn ihre geno2pheno False Positive-Rate unterschritten 5,75%. Wenn einer der drei Sequenzen aus einer Probe wird entnommen, um Nicht-R5 werden, wird der Patient wahrscheinlich nicht zu einer CCR5-Antagonisten reagieren.
Protocol
Vorgehensweise:
1. Extraction:
Mindestens 500 ul von Blutplasma als Probe Input für diese genotypische HIV Tropismus-Test erforderlich.
- Auszug HIV-RNA aus 500μL von Plasma mit einem easyMAG (bioMérieux) automatisierte Extraktor, oder die bevorzugten Extraktionsverfahren von Ihrem Labor.
Eluieren der extrahierten Virus-RNA in einem 60 ul-Aliquot. Lagerung bei -20 Grad Celsius beginnen oder Reverse-Transkriptase-PCR sofort nach der Extraktion.
2. RT-PCR:
4μL der Probenlösung wird in dreifacher Ausfertigung mit nested RT-PCR-Methoden verstärkt werden. Die RT-PCR-Reaktion muss in einem PCR-Reinraum eingerichtet werden.
- Berechnen Sie die Menge an Reagenz für die Anzahl der Proben verstärkt werden müssen. Folgen Sie der unten stehenden Tabelle zeigt Reagenzienvolumina für 1-Reaktion.
Tabelle 1. Reagenzienvolumina für 1 Reaktion des One-Step RT-PCR erforderlich.Reagens Volume (ul)
(1X-Reaktion)DEPC behandeltem Wasser 10,56 2x Reaktionspuffer 20 50% Saccharose und 0,04% Bromphenolblau-Mix 4 Forward primer gezielt die HIV V3-Region 0,32 Reverse-Primer 0,32 Enzyme - SuperScript III One-Step RT-PCR-System mit Platinum Taq DNA Polymerase 0,8 Gesamt 36
Jeder Schritt RT-PCR-Reaktion erfordert das folgende Rezept:- 10,56 ul DEPC behandeltem Wasser
- 20 uL 2x Reaktionspuffer
- 4μL von 50% Saccharose und 0,04% Bromphenolblau-Mix
- 0,32 ul der Vorwärts-Primer gezielt die HIV V3-Region
- 0,32 ul der Reverse-Primer
- 0,8 ul des Enzyms
- Line up Probenextrakt Röhren in einer Reihe neben einem leeren, etikettiert 96-well PCR-Platte.
- Mit einem Repeater Pipette 36 ul Probe-Mix in jede Vertiefung der PCR-Platte, so dass es 3 Brunnen für jede Probe zu extrahieren vorbereitet.
* Hinweis: Diese Prozedur muss in dreifacher Ausführung durchgeführt werden, mindestens, um eine angemessene Probenahme der viralen Bevölkerung zu gewährleisten. - Mit einem 8-Kanal-Mehrkanal-Pipette 4μL der Probe zu extrahieren, um jedem seiner 3 Brunnen. Ändern Spitzen zwischen jeder Zugabe.
- Decken Sie die Vertiefungen mit PCR Streifen Kappen.
- Wenn die Übertragung comlete ist, legen Sie die PCR-Platte in einem Thermocycler. Setzen Sie den Thermocycler mit folgendem Programm laufen: 30 Minuten bei 52 ° C 2 Minuten bei 94 ° C 40 Zyklen (15 Sekunden bei 94 ° C, 30 Sekunden bei 55 ° C und 1,5 Minuten bei 68 ° C) 5 Minuten bei 68 ° C
- Nehmen Sie PCR-Platte aus Thermocycler. Platte kann bei Raumtemperatur gelagert werden.
Gehen Sie in die zweite Runde PCR-Schritt
3. Zweitrundeneffekte PCR:
- Berechnen Sie die Menge an Reagenz für die Anzahl der Proben verstärkt werden müssen. Folgen Sie der unten stehenden Tabelle zeigt Reagenzienvolumina für 1-Reaktion.
Tabelle 2. Reagenzienvolumina für 1 Reaktion der 2. Runde PCR benötigt wird.Reagens Volume (ul)
(1X-Reaktion)DEPC behandeltem Wasser 13,45 60% Saccharose, 0,08% Kresolrot Mix 2 Roche HiFi-System Buffer 2 2 MgCl 2 0,8 dNTP 0,16 Vorwärts PCR-Primer 0,15 Reverse-PCR-Primer 0,15 Expand HiFi-Enzym 0,29 Gesamt 19
Jeder zweite Runde PCR-Reaktion erfordert das folgende Rezept:- 13,45 ul DEPC behandeltem Wasser
- 2 ul 60% Saccharose, 0,08% Kresolrot Mix
- 2 ul von Roche Hifi-System Buffer 2
- 0,8 ul 25 mM MgCl 2
- 0,16 uL 25 mM dNTP
- 0,15 ul sowohl der Vorwärts-und Rückwärts-PCR-Primer
- 0,29 ul Expand HiFi-Enzym
- In einer Post-Amplifikation Zimmer, mit einem 8-Kanal-Mehrkanal-Pipette 1 ul der RT-PCR-Vorlage in der zweiten Runde PCR-Puffer. Ändern Spitzen zwischen jeder Zugabe.
- Decken Sie die Vertiefungen mit PCR Streifen Kappen und übertragen die zweite Runde PCR-Platte auf einem Thermocycler.
- Setzen Sie den Thermocycler mit dem folgenden Programm ausführen: 2 Minuten bei 94 ° C 35 Zyklen (15 Sekunden bei 94 ° C, 30 Sekunden bei 55 ° C, 1 Minute bei 72 ° C) 7 Minuten bei 72 ° C
- Entfernen Platte von Thermocycler nachdem die Temperatur auf 25 zurückgekehrt ist ° C.
4. Gel-Elektrophorese:
Um zu bestätigen, dass die V3-Region wurde erfolgreich verstärkt, ist ein Gel-Elektrophorese Schritt durchgeführt.
- Bereiten Sie ein Agarosegel mit 0,8 g Agarose Pulver in 50 ml 1X TAE-Puffer. Umrühren und schmelzen in der Mikrowelle für ca. 1 Minute oder bis Agarose vollständig gelöst ist.
- Add 6 ul SYBR Safe-Gel-Färbung und Drall zu mischen.
- Gießen Lösung in ein Gel Tray, und fügen Sie genug Gel Kämme, die Anzahl der PCR Brunnen unterzubringen.
- Nachdem das Gel trocken ist, entfernen Sie Kämme und Stelle das Gel in die Gel-Apparatur ein, dass sie vollständig in 1X TAE-Puffer getaucht.
- Mit einem 10 l Mehrkanal-Pipette 8μL jeder PCR-Probe, um einen eigenen Brunnen im Gel. Decken Sie die PCR-Platte nach der Verstärkungen auf das Gel hinzugefügt worden sein.
- Add 6 ul der DNA-Leiter, um mindestens eine Vertiefung pro Zeile.
- Führen Sie die Gel-Apparatur bei ~ 100V für ca. 10 Minuten, um sicherzustellen, dass die Bänder nicht laufen aus dem Gel.
- Legen Sie das Gel auf einem UV-trans-Hilfslicht und ein Bild des Gels.
Wells mit PCR-amplifizierten DNA erscheint Licht, was auf eine erfolgreiche Amplifikation. - Notieren Sie sich alle Proben, wo drei Amplifikationen wurden Erfolg. Falls erforderlich, wiederholen RT-PCR für die Proben mit weniger als 3 Amplifikationen.
Gehen Sie zur Sequenzierung
5. Sequenzierung:
Nachdem verstärkt viralen cDNA, können die Proben für die Sequenzierung vorbereitet werden. Die Sequenzierreaktion sollte idealerweise in einem post-Verstärkung Zimmer nehmen.
- Entfernen BigDye aus dem Gefrierschrank und Sequenzierung Primer aus dem Kühlschrank. Lassen Sie die BigDye bei Raumtemperatur auftauen, nicht länger als 1 Stunde.
- Berechnen Sie die Menge an Reagenz für die Anzahl der Proben ausgeführt werden müssen. Folgen Sie der unten stehenden Tabelle zeigt Reagenzienvolumina für 1-Reaktion.
Tabelle 3. Reagenzienvolumina für 1 Reaktion der Sequenzierung erforderlich.Reagens Volume (ul)
(1X-Reaktion)BigDye 0,3 BigDye Buffer 2,1 Grundierung 2,6 Gesamt 5,0
* Hinweis: Bereiten Sie eine separate Mischung für jeden Primer.
** Hinweis: Die BigDye Buffer in die Sequenzierreaktion eingesetzt werden können wie folgt hergestellt werden: Mix 17,5 ml Trizma Hydrochlorid-Puffer-Lösung (1 M) (pH9.0) und 0,125 ml Magnesiumchlorid (1 M). Bringen Sie das endgültige Volumen auf 100 ml mit Reinstwasser. Dies sollte bei 2-8 ° C gelagert werden - Mit den Berechnungen von 3,3, bereiten die Sequenzierreaktion Mixe für jeden Primer und Wirbel für nicht mehr als 5 Sekunden. Aliquot in 0,2 ml Streifen Röhren.
- Aliquot 5 ul Sequenzierreaktion Mix in die entsprechende Platte Brunnen mit einer Mehrkanalpipette. Die Platte (n) mit Sequenzierreaktion Mix mit einem Kimwipe und beiseite stellen.
- Bereiten Sie eine Verdünnung von 01.15 amplifizierte PCR-Produkt durch Zugabe von 180 ul Baxter steriles Wasser, um die verbleibenden PCR-Produkt.
- Pipette 1 ul der verdünnten Probe auf den Boden der entsprechenden Platte Brunnen, Veränderung Pipettenspitzen.
- Wenn Sie fertig Übertragung Probe, versiegeln Sie die Platte mit Streifen Kappen und Wirbel für 1 Sekunde
- Die Platte wird in einer Zentrifuge. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 145g, wenn die Schleuderdrehzahl 145g erreicht, stoppen Sie den Spin.
- Die Platte wird in einem Thermocycler (s) auf den folgenden Programm: 25 Zyklen (10 sec bei 96 ° C, 5 sec bei 50 ° C, 55 sec bei 60 ° C...) Das Volumen sollte mindestens 6μL . Der Zyklus sollte etwa 1,2 Stunden.
Gehen Sie zur Fällung
6. Niederschlag:
Um "clean-up" der viralen cDNA nach der Sequenzierreaktion, führen Ethanolfällung mit 95% Ethanol.
- Abrufen Platte aus dem Thermocycler und bringen eine post-Verstärkerfication Raum.
- Entfernen Streifen Kappen und legen Sie sie, um auf einer sauberen Papiertuch oder Kimwipe.
- Pipette 4μL der Arbeitsgruppe EDTA-Natriumacetatlösung an der Seite von jeder Probe gut. Tippen Sie auf die Platte vorsichtig, so dass die EDTA-Natrium-Lösung auf den Grund des Brunnens fällt. Das gleiche Tipps können so verwendet werden, solange sie nicht kontaktieren, die Probe am Boden des Brunnens.
* Hinweis: Die Arbeitsgruppe EDTA-Natrium-Acetat-Lösung kann wie folgt hergestellt werden:- Bereiten 3M Natriumacetat durch Auflösen von 246,1 g Natriumacetat in 1 l Reinstwasser. Filter die Lösung durch einen 0,45 Mikrofilter und bereiten 50 mL Aliquots.
- Bereiten Lager EDTA-Natrium-Acetat-Lösung (1,5 M NaOAc, 250 mM EDTA) durch Mischen gleicher Volumina von Natriumacetat (3 M) und EDTA-Lösung (500 mM) pH 8,0.
- Bereiten Sie arbeiten EDTA-Natriumacetatlösung durch Mischen von einem Teil Lager EDTA-Natriumacetatlösung mit drei Teilen analysenreines Wasser (10 ml + 30 ml).
- Pipette 40 ul von gekühlten 95% igem Ethanol auf den gegenüberliegenden Seite der Probe Brunnen und ersetzen Sie den Streifen Kappen.
- Seal die Kappen und Wirbel der Platte für 10 Sekunden. Tippen Sie auf die Platte keine Luftblasen zu entfernen.
- Die Platte wird in der Tiefkühltruhe bei -20 ° C für mindestens 30 Minuten und maximal 2 Stunden.
- Sobald Niederschläge aufgetreten ist, entfernen Sie die Platte aus dem Gefrierschrank und in einer Zentrifuge für 20 Minuten bei 3700 Umdrehungen pro Minute.
- Entfernen Sie den entsprechenden Betrag von Hallo-Di Formamid (Applied Biosystems) aus der Tiefkühltruhe, damit sie vor Denaturierung auftauen.
- Nach dem Drehen der Platte zu entfernen und entsorgen Sie die Streifen Kappen. Drehen Sie die Platte über den Abfallbehälter (zB Mülltonne) und Dekantieren des Überstandes. Rid der verbleibenden Überstand, indem man die umgekehrte Platten auf ein Papiertuch.
- Falten Sie 2 Blatt Küchenpapier und auf der Oberfläche der Platte. Legen Sie die Platte nach unten in die Zentrifuge und Spin bei 145g, Stoppen der Ball bei 145g erreicht.
- Entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge und überprüfen Sie, ob Brunnen sind leer. Pipette 155μL von gekühlten 95% Ethanol in die Vertiefungen.
- Verwerfen Sie den Überstand in den Abfallbehälter und Schandfleck auf Küchenpapier und wiederholen Sie die Zentrifugation in 4.10.
- Nach dem Entfernen der Platte aus der Zentrifuge, verwerfen verwendet Papiertuch und lassen Teller stehen offen für 2-5 Minuten, damit alle verbleibenden Ethanol zu verdampfen.
Gehen Sie zur Denaturierung
7. Denaturierung
- Rufen Sie die aufgetauten Hidi Formamid und dekantieren in einen Behälter groß genug für eine Mehrkanal-Pipette
* Hinweis: Wenn Sie pre-aliquotiert Maßnahmen in 6,7 B erwähnt, eine Röhre ist für jeden 96-Well-Platte ausgeführt werden müssen. - Mit einer Mehrkanal-Pipette, verteilen 10 &mgr; l der Hidi Formamid in alle Vertiefungen auf der Platte, einschließlich derjenigen, die leer sind.
- Die Platte mit einem Septen Matte, um eine Dichtung zu bilden.
- Die Platte wird in einem Thermocycler bei 90 ° C für 2 Minuten.
- Nach Denaturierung wird die Platte in einem Plattenhalter laden Sie dann in den Sequenzer. Laden Sie eine vorbereitete Sequenzierung Layout. Die Platten können bei -20 ° C aufbewahrt werden bis zu einer Woche vor der Durchführung der Sequenzierung laufen.
8. Die Analyse der erhaltenen Daten mit Basis Aufruf Software.
- Mit ReCall eine automatische Basis Aufruf ohne menschlichen Eingriff, ist ledig Grundierung Abdeckung akzeptabel. Recall ist eine eigene Basis ruft Software, die unter folgender URL zu finden: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
* Hinweis: Ein Konto ist erforderlich, um sich einzuloggen. Um ein Konto einzurichten, klicken Sie auf den Button "Anmelden" auf der Login-Seite. Sobald ein Konto erstellt wurde können Sie die Upload-Seite zugreifen. - Wenn Sie angemeldet sind, können Sie Beispiel-Dateien für den Upload. Mit der Option zum Durchsuchen Sie Ihre RAW-Sequenzierung Daten finden kann, für die mit maximal 20 MB Upload hochladen.
* Hinweis:... Web Recall akzeptiert nur Dateien wie ABI und SCF-Dateien in einem zip, tar oder tar.gz-Datei - Sobald die Dateien für den Upload ausgewählt wurden, wählen Sie Referenz-Sequenz. In diesem Fall müssen Sie die Referenz-Sequenz eingestellt ist "V3". Sie sind nun bereit, klicken Sie auf "Process Data".
- Verarbeitete Daten werden auf der rechten Seite der Seite unter der Überschrift erscheinen "Past Samples." Jeder Lauf oder Sample-Set verarbeitet werden in einem Ordner mit dem Datum gekennzeichnet in Verkehr gebracht werden. Diese können durch Klicken auf die Schaltfläche "Umbenennen" neu etikettiert werden.
- Klick auf den Ordner öffnet sich eine Liste der Proben. Diejenigen, die rot sind gescheitert, diejenigen, die grün sind vergangen. Durch einen Klick auf eine bestimmte Probe und die Schaltfläche "View", können Sie die Reihenfolge zu überprüfen. Befolgen Sie die Anweisungen auf der rechten Seite der Seite, auf throu navigierengh der Sequenz.
* Hinweis: Für diese Methode ist es akzeptabel, Sequenzen, die daran erinnern Pass (grün dargestellt) automatisch, ohne manuelle Eingriffe zu exportieren. - Wenn Sie mit dem Ergebnis zufrieden sind können Sie wählen, um die Weitergabe Sequenzen durch Anklicken herunterladen "Download". Die Dateien werden in einem ZIP-Ordner heruntergeladen werden.
* Hinweis: Unter "Einstellungen" können Sie herunterladen und per E-Mail-Optionen, einschließlich Datei-Typ aus. - Die Proben andernfalls zu reinigen dreifacher Ausfertigung Sequenzen produzieren sollten in dreifacher Ausfertigung aus Extrakt reamplifiziert werden. Wenn RePCR nicht um einen sauberen Ablauf zu schaffen, ist ein Minimum von 2 Sequenzen für die Verwendung in Tropismus Inferenz.
9. Herleiten virale Tropismus von Sequenzen von Populations-basierte Sequenzierung unter Verwendung des Geno2pheno Co-Rezeptor-Algorithmus erzeugt.
- Http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php: Sequenzen können durch die geno2pheno Korezeptor Service unter der folgenden URL ausgeführt werden.
- Die Proben zum Hochladen kann als gut befunden gekennzeichnet werden. Wählen Sie im Dropdown-Menü der Bedeutung Einstellung, wählen Sie die "optimale Cutoff auf der Analyse der klinischen Daten basieren MOTIVATE (2% und 5,75% FPR)"
- Wählen Sie den Upload oder fügen Sie eine Sequenz für die Analyse sind fasta Dateien akzeptabel.
- Die geno2pheno FPR kann wie folgt interpretiert werden: G2P FPR> 5,75 ist repräsentativ für einen R5-virale Bevölkerung wahrscheinlich zu CCR5-Antagonisten reagieren G2P FPR <5,75 ist repräsentativ für eine nicht-virale R5 Bevölkerung kaum zu CCR5-Antagonisten reagieren. G2P <2 ist sehr unwahrscheinlich, dass jede Reaktion auf CCR5-Antagonisten. Wenn einer der drei Sequenzen aus einer Probe wird entnommen, um Nicht-R5 werden, wird der Patient wahrscheinlich nicht zu einem CCR5-Antagonisten reagieren.
10. Repräsentative Ergebnisse
Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird sollte man erwarten, erfolgreich zu Folge 2 oder 3 Wiederholungen für jede Probe. Negativ neben Proben laufen sollte keinen Hinweis auf RNA. Die Mehrheit der Sequenzen sollten "pass" basecalling mit Menge.
Basierend auf der Verteilung der R5-und Nicht-R5 in der Gemeinde virale Bevölkerung, würde die Mehrheit der zufällig ausgewählten Patienten-Proben zu erwarten haben, R5-mit Virus sein. Deshalb sei denn, der Projektierung sonst schlagen, sollte man erwarten, mehr R5 als non-R5 Proben haben.
Tabelle 1. A) Die Reagenzienvolumina für 1 Reaktion von One Step RT-PCR und B) der Thermocycler-Programm notwendig, um die Durchführung der RT-PCR-Reaktion erforderlich.
A)
Reagens | Volume (ul) (1X-Reaktion) |
| DEPC behandeltem Wasser | 10,56 |
| 2x Reaktionspuffer | 20 |
| 50% Saccharose und 0,04% Bromphenolblau-Mix | 4 |
| Forward primer SQV3F1 | 0,32 |
| Reverse-Primer CO602 | 0,32 |
| Enzyme - SuperScript III One-Step RT-PCR-System mit Platinum Taq DNA Polymerase | 0,8 |
| Gesamt | 36 |
* Hinweis:
SQV3F1 Primer-Sequenz: 5 'GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3'
CO602 Primer-Sequenz: 5 'GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3'
B)
| Anzahl der Zyklen | Zeit | Temperatur |
| 1 | 30 Minuten | 52 ° C |
| 1 | 2 Minuten | 94 ° C |
| 40 | 15 Sekunden | 94 ° C |
| 30 Sekunden | 55 ° C | |
| 1,5 Minuten | 68 ° C | |
| 1 | 5 Minuten | 68 ° C |
Tabelle 2. A) Die Reagenzienvolumina für 1 Reaktion der zweiten Runde PCR und B) der Thermocycler-Programm notwendig, um die Durchführung der zweiten Runde PCR-Reaktion erforderlich.
A)
Reagens | Volume (ul) (1X-Reaktion) |
| DEPC behandeltem Wasser | 13,45 |
| 60% Saccharose, 0,08% Kresolrot Mix | 2 |
| Roche HiFi-System Buffer 2 | 2 |
MgCl | 0,8 | |
| dNTP | 0,16 |
| Forward primer SQV3F2 | 0,15 |
| Reverse-Primer CD4R | 0,15 |
| Expand HiFi-Enzym | 0,29 |
| Gesamt | 19 |
* Hinweis:
SQV3F2 Primer-Sequenz: 5 'TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG AT 3'
CD4R Primer-Sequenz: 5 'TAT AAT TCA CTT CTC CAA TTG TCC 3'
B)
Anzahl der Zyklen | Zeit | Temperatur |
| 1 | 2 Minuten | 94 ° C |
| 35 | 15 Sekunden | 94 ° C |
| 30 Sekunden | 55 ° C | |
| 1 Minute | 72 ° C | |
| 1 | 7 Minuten | 72 ° C |
Tabelle 3. A) Die Reagenzienvolumina für 1 Reaktion der Sequenzierung und B) der Thermocycler-Programm notwendig, um die Durchführung der Sequenzierreaktion erforderlich.
A)
| Reagens | Volume (ul) (1X-Reaktion) |
| BigDye | 0,3 |
| BigDye Buffer | 2,1 |
| Grundierung Vorwärts V3FO2F Rückwärts SQV3R1 | 2,6 |
| Gesamt | 5,0 |
* Hinweis: Kombinieren Sie nicht Primer, eine separate Mischung sollte für jedes Primerpaar vorbereitet werden
V3O2F Primer-Sequenz: 5 'AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
SQV3R1 Primer-Sequenz: 5 'GAA AAA TTC CCT TCC ACA ATT AAA 3'
B)
Anzahl der Zyklen | Zeit | Temperatur |
| 25 | 10 Sekunden | 96 ° C |
| 5 Sekunden | 50 ° C | |
| 55 Sekunden | 60 ° C |
Discussion
Die hier vorgestellte Methode ist ein Standard-Sequenzierung Methode angewendet, um Tropismus Tests. Die klinische Anwendung von HIV-Envelope-V3-Loop-Sequenzierung der viralen Tropismus vorherzusagen hat bis spät in Grenzen. Diese Methode hat sich gezeigt, in retrospektiven Analysen der Maraviroc (ViiV Healthcare) klinische Studien, um mindestens ebenso in der Lage, virale Tropismus im Vergleich zu anderen validierten Tests klinisch verwendeten vorherzusagen.
Es gibt viele Vorteile für die Durchführung von genotypischen Analyse der V3-Schleife für Tropismus Vorhersage. In erster Linie können diese Prozedur an jedem Standort mit operativen Sequenzierung Ausrüstung durchgeführt werden, eine starke Erhöhung der Erreichbarkeit und der Verringerung der Durchlaufzeit von Tropismus Tests. Im Vergleich dazu ist die phänotypische Verbesserte Empfindlichkeit Trofile Assay (ESTA) (Monogram Biosciences), die als Goldstandard für Tropismus Tests gedient hat, in einem Zentrum in Südkalifornien durchgeführt. Weitere Vorteile sind die Forderung nach weniger Ausgangsmaterial und eine mindestens erforderliche Viruslast im Blut von 500copies/mL. Wie gut sind die operativen Kosten für den Betrieb der genotypische Test relativ niedrig im Vergleich zu denen eines phänotypischen Assays. Die Nutzung der Software ReCall insbesondere entfällt die Notwendigkeit für manuelle Sequenz zu überprüfen, die zu einer arbeitsintensiven Teil des Genotyps analysiert werden neigt.
Die hier vorgestellte Methode ist recht einfach, ohne besondere Schritt überwiegt eine andere Bedeutung. Wir empfehlen läuft PCR und Sequenzierung in dreifacher Ausfertigung an die Chancen für den Fang von Arten Minderheit innerhalb der viralen Population einer Stichprobe zu erhöhen. Repliziert mehr als drei durchgeführt werden kann, dreifach aber wir haben festgestellt, dass sowohl effizient und zuverlässig. Wir empfehlen die Verwendung der One-Step Reverse-Transkriptase-PCR Kit (Qiagen), die beide RT-PCR und ersten Runde PCR führt in die gleiche Reaktion bei gleichzeitig hoher Sensitivität und Spezifität.
Disclosures
P. Richard Harrigan hat Interessenkonflikte mit ViiV Healthcare, Virco, Merck, Abbott und Quest. Dieses Video-Artikel ist von ViiV Healthcare gesponsert.
Acknowledgments
Die Entwicklung dieses Tests wurde durch Viiv Healthcare und der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) und durch eine GlaxoSmithKline / CIHR Lehrstuhl für Klinische Virologie Dr. Harrigan unterstützt.
Unterstützung durch Pfizer und ViiV Healthcare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0 | |||
| NucliSens easyMAG Magnetic Silica | bioMerieux | cat. # 280133 | (48 x 0.6 ml) |
| NucliSens easyMAG Lysis Buffer | bioMerieux | cat. # 280134 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1 | bioMerieux | cat. # 280130 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2 | bioMerieux | cat. # 280131 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3 | bioMerieux | cat. # 280132 | (4 x 1000 ml) |
| NucliSens easyMAG version 1.0 | bioMerieux | ||
| Class II A2 biological safety cabinet | |||
| One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR | |||
| DEPC-treated water | Ambion | cat. # 9922 | |
| SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty | Invitrogen | cat#12574-035 | Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4) |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche Group | cat. # 1 759 078 | Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4) |
| dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP | Roche Group | cat. # 11969064001 | (100 mM) |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | cat. # S0389-500G | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-Aldrich | cat.# B5525 | |
| Cresol Red | Sigma-Aldrich | cat.# 114472-5G | indicator grade |
| Thermocycler | |||
| Gel Electrophoresis | |||
| 50X TAE buffer | Invitrogen | cat. # 24710030 | (1000 ml) |
| SYBR Safe DNA gel stain | Invitrogen | cat. # S33102 | |
| Agarose (ultra pure) | Invitrogen | cat. # 15510-027 | |
| E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder | Invitrogen | cat. # 12373-031 | |
| Reagent Grade Type II water | |||
| Gel apparatus | |||
| Sequencing | |||
| ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit | Applied Biosciences | cat. # 4337458 | (25000 reactions) |
| Hi-Di Formamide | Applied Biosciences | cat. # 4311320 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | cat. # S-2889 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | Cat.# 03690-100ML | 0.5M, pH=8.0 |
| TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution | Sigma-Aldrich | cat. # T-2819 | 1 M, pH 9.0 |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. # M-1028 | 1 M |
| 95% Ethanol | |||
| Running Buffer (10X) with EDTA | Applied Biosystems | cat. # 4335613 | 500 mL |
| Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL) | Applied Biosystems | cat. # 44363929 or cat. # 4352759 | |
| 3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit | Applied Biosciences | Cat# 4336943 | |
| Thermocycler | |||
| Centrifuge with plate holders | |||
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosciences |
References
- Feng, Y., Broder, C. C., Kennedy, P. E. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven transmembrane, G protein-coupled receptor. Science. 272, 872-877 (1996).
- Dragic, T., Litwin, V., Allaway, G. P. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature. 381, 667-673 (1996).
- Dorr, P., Westby, M., Dobbs, S. Maraviroc (UK-427,857), a potent, orally bioavailable, and selective small-molecule inhibitor of chemokine receptor CCR5 with broad-spectrum anti-human immunodeficiency virus type 1 activity. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 4721-4732 (2005).
- Gulick, R. M., Lalezari, J., Goodrich, J. Maraviroc for previously treated patients with R5 HIV-1 infection. N. Engl. J. Med. 359, 1429-1441 (2008).
- Cooper, D. A., Heera, J., Goodrich, J. Maraviroc versus efavirenz, both in combination with zidovudine/lamivudine, for the treatment of antiretroviral-naíve subjects with CCR5-tropic HIV-1. J. Infect. Dis. 201, 803-813 (2010).
- Low, A. J., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Trofile HIV co-receptor usage assay. Expert Opin. Med. Diagnostics. 3, 181-191 (2000).
- Sing, T., Low, A. J., Beerenwinkel, N. Predicting HIV co-receptor usage based on genetic and clinical covariates. Antiviral Ther. 12, 1097-1106 (2007).
- Screening for HIV tropism using population-based V3 genotypic analysis: a retrospective virological outcome analysis using stored plasma screening samples from MOTIVATE-1. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 5th International AIDS Society Conference, 2009 19-22 July, Cape Town, South Africa, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cut-points for the determination of HIV co-receptor usage to predict maraviroc responses in treatment experienced (TE) patients using population V3 genotyping. Harrigan, P. R., McGovern, R., Dong, W. 12th European AIDS Conference, 2009 11-14 Nov, Cologne, Germany, , (2009).
- Optimization of clinically relevant cutoffs for determining HIV co-receptor use by population and "deep" sequencing methods. Swenson, L. C., McGovern, R. A. 47th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, 2009 Oct 29 - Nov 1, Philadelphia, PA, USA, , (2009).
- Phenotypic screening for HIV tropism versus both population-based and "deep" sequencing. Swenson, L., McGovern, R., Dong, W. 49th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009 12-15 Sept, San Francisco, CA, , (2009).
- Swenson, L. C., Moores, A., Low, A. J., Thielen, A., Dong, W., Woods, C., Jensen, M. A., Wynhoven, B., Chan, D., Glascock, C., Harrigan, P. R. Improved Detection of CXCR4-Using HIV by V3 Genotyping: Application of Population-based and 'Deep' Sequencing to Plasma RNA and Proviral DNA. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 54, 506-510 (2010).
- Swenson, L. C., Boehme, R., Thielen, A., McGovern, R. A., Harrigan, P. R. Genotypic determination of HIV-1 tropism in the clinical setting. HIV Therapy. 4, 293-303 (2010).
