Um modelo ortotópico de câncer de bexiga murino

Summary

Tumores de bexiga são estabelecidos em camundongos fêmeas, de uma forma minimamente invasiva através de cateterismo, cauterização local, ea adesão posterior de células de carcinoma aos locais queimar.

Abstract

Neste procedimento simples, tumores de bexiga são estabelecidos em camundongos fêmeas C57 através do uso de cateterismo, cauterização local, e adesão celular subseqüente. Após a sua bexigas são transurethrally cateterizada e escorrido, os animais são novamente cateterizada para permitir a inserção de um fio de platina em bexigas sem danificar a uretra ou bexiga. Os cateteres são feitos de Teflon para servir como um isolante para o fio, que irá conduzir a corrente elétrica para a bexiga para criar um ferimento de queimadura. Uma unidade de eletrocautério é usada para fornecer 2,5 W para a extremidade exposta do fio, queimando camadas extracelular e proporcionando locais de fixação para células de carcinoma que são entregues em suspensão para a bexiga através de um cateterismo subseqüente. Células permanecem na bexiga durante 90 minutos, após o que os cateteres são retirados e as bexigas permitido para drenar naturalmente. O desenvolvimento de tumor é monitorado através de ultra-som. Especial atenção é dada à técnica de cateterismo no vídeo que acompanha.

Protocol

1. Animais

1. Feminino C57BL/6J camundongos (Mus musculus) são verificados livres de ectoparasitas contagiosa, helmintos endoparasitas e anticorpos para 17 vírus murino pelo fornecedor antes do envio. Os ratos são alojados nas instalações animais AAALAC credenciados da Universidade de Tulane, em conformidade com o Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório ^1.
2. Especificamente, os ratos são alojados em grupo (4-5 ratos / gaiola) em policarbonato individualmente ventilado tops microisolation cageswith filtro na cama de madeira. Elas são fornecidas ad libitum de alimentos de roedores peletizada e água da torneira.
3. Ratos são permitidos 7 dias para se aclimatar antes do início do estudo.

2. Células

1. A célula de transição murino linhagem de células de carcinoma MB49 é usado para produzir os tumores da bexiga.
2. As células são cultivadas em meio Dulbecco modificado Eagle, suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades / ml de penicilina e 100 unidades / ml de estreptomicina.
3. Culturas são mantidos a 37 ° C e 5% CO ₂ com a mídia muda a cada 2-3 dias.

3. Modelo de animais Tumor ortotópico

A instilação do modelo de tumor de bexiga descrito aqui é uma modificação do procedimento descrito por Gunther et al. ²

1. A anestesia é induzida com isoflurano a 2% (MWI / VetOne, Meridian, ID, Cat # 501017) em oxigênio e mantida a 0,75-1,25%. (Animais múltiplas podem ser tratadas simultaneamente, o que exigiria um aumento nos níveis de isoflurano.) Para evitar o ressecamento da córnea, os olhos são lubrificados com uma pomada oftálmica lágrimas artificiais. O calor do corpo é mantida com uma almofada de aquecimento sob uma cortina de papel.
2. A pele da parte inferior das costas é cortado para promover o contacto com a placa de aterramento metal, e da área raspada é revestido com gel electroconduction.
3. Cada rato é, então, colocados individualmente em recumbancy dorsal em uma placa de aterramento metal, e da bexiga é cateterizada transurethrally usando uma lubrificada calibre 24, 3 / 4 de polegada, over-the-agulha de cateter IV com o estilete removido.
4. A bexiga urinária é drenado de urina, e um fio de platina é inserido através do cateter na bexiga urinária deixando fios expostos em cada extremidade do cateter - cerca de 2 mm na extremidade lumenal do cateter. O fio é feito de platina por causa da resistência do material à oxidação.
5. Um atuais 2,5 W é então aplicado para a bexiga por aproximadamente 0,5 segundo, tocando a parte exterior do fio com uma unidade de eletrocautério definido para a coagulação.
6. O fio é então transferido para uma segunda posição na bexiga e mais 2,5 W carga aplicada.
7. O fio é removido, e 100 l de MB49 células a uma concentração de 1x10 ⁶ células / ml é instilada através do cateter até a bexiga através de uma seringa de 1ml.
8. As seringas são deixados ligados ao cateteres para evitar efluxo das suspensões de células, e os ratos são mantidos cateterizada sob anestesia por 90 minutos para permitir que as células para anexar aos locais queimar.
9. 100-200 mL de solução salina estéril é administrado por injecção IP para cada rato, antes da recuperação.
10. No final do período de incubação os cateteres são retirados e os animais estão autorizados a se recuperar no teclado aquecida até reflexos de endireitamento retorno, altura em que os ratos são devolvidos para suas gaiolas de casa.

4. Ultra-som

1. Tumores são permitidos a crescer por 3-5 dias antes os ratos submetidos a um exame de ultra-som da bexiga urinária para monitorar o crescimento do tumor.
2. Para os exames de ultra-som inicial, os animais são anestesiados, como descrito acima. Os ratos são colocados em recumbancy dorsal, e pele abdominal é preparado por recorte a pele.
3. Um cateter de calibre 24 IV é inserido transurethrally na bexiga urinária. Neste ponto, a bexiga pode ser drenado e da urina coletada para análise posterior.
4. 100 ml de soro fisiológico estéril é instilada na bexiga através do cateter para melhorar a visibilidade da bexiga ao ultra-som.
5. Gel de condução de ultra-som é aplicado ao abdome e ultra-sonografia é realizada para avaliar a parede da bexiga e na luz.

5. Resultados representativos:

Tecido tumoral começarão a aparecer 3-5 dias após a inoculação. Em nossa experiência, em um grupo de 12 ratos, 50% ou mais rotineiramente têm uma massa de tecido detectável dentro da bexiga (0,5-1,0 mL, usando V = π / 6 · L · W · H) por cinco dias. Ao usar células 49 MB, tumores vai continuar a crescer ea eutanásia será exigido pelo dia 24 se os ratos não tratados. A eutanásia é recomendada quando os ratos se tornar letárgico ou caquéticos, display de pele enrugada, hunching e não-responsivos comportamento, ou quando perdem 20% do seu peso corporal inicial. </ P>

Os tumores crescem rapidamente e terá centros necróticos após atingirem uma massa de 200 mg ou mais, ³ ostensivamente porque as células do tumor proliferam desenvolvimento mais rápido do que o que pode ser atendida pelo fornecimento de sangue angiogênico. Pode-se também indiretamente monitorar a progressão do tumor através do nível de hematurea, que é presumivelmente relacionado com a angiogênese em tumores rápido desenvolvimento. Ele foi consistentemente observou que a urina não tratada de camundongos portadores de tumor continha sangue por 14 dias. A concentração de células vermelhas do sangue pareceu aumentar ao longo do tempo nesses camundongos, e os volumes de urina coletadas diminuída. Tumores em excesso de 50 mg também pode ser palpada com relativa facilidade, normalmente 14 dias após a inoculação.

Discussion

Este método minimamente invasivo de estabelecer tumores de bexiga ortotópica em camundongos fêmeas também pode ser aplicado para outros tipos de células que MB49, embora os resultados divergentes devem ser antecipados. Quando as células menos agressiva do tumor são usados, aumentando a potência ligeiramente (usando incrementos de 0,5 W para estabelecer o ótimo novo) trará uma área mais passíveis de penhora de células tumorais, e mais tempo de incubação da bexiga para as células instilado vai render uma quantidade maior de adesão celular nos locais de queima (dados não publicados). Apesar de alguns protocolos recomendam entregar 10 W via eletrocautério, ^2, esta quantidade de energia deve ser considerada um limite superior, e, talvez, ser evitada. Aumento da concentração de células entregues também pode aumentar as chances de sucesso quando outros tipos de células são usadas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J mice	Jackson Laboratory	000664	3-5-wk-old
Polycarbonate cages and ventilated rack	Lab Products	Super Mouse 750	327mm x 190mm x 143mm
Hardwood Bedding	Harlan Laboratories	Laboratory –grade SaniChips
Rodent diet	Harlan Laboratories	Rodent Diet 2019
IV Catheter	MWI Veterinary Supply	009231	24 G x ¾ in.
Electrocautery unit	Bovie Medical Corporation	Aaron 900
Ultrasound unit	Sonosite	180 Plus (Vet)
MB49 cell line	Wake Forest University Baptist Medical Center	N.A.
DMEM	Invitrogen	21063-029
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products	100106 500A57B
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-163