Murine मूत्राशय कैंसर के एक Orthotopic मॉडल

Summary

मूत्राशय ट्यूमर कैथीटेराइजेशन, स्थानीय दाग़ना, और जला साइटों के लिए कार्सिनोमा कोशिकाओं के बाद आसंजन के माध्यम से एक न्यूनतम इनवेसिव फैशन में मादा चूहों में स्थापित कर रहे हैं.

Abstract

इस सरल प्रक्रिया में, मूत्राशय ट्यूमर महिला C57 चूहों में कैथीटेराइजेशन का उपयोग, स्थानीय दाग़ना, और बाद में कोशिका आसंजन के माध्यम से स्थापित कर रहे हैं. के बाद उनके bladders transurethrally catheterized हैं और सूखा, जानवरों फिर मूत्रमार्ग या मूत्राशय को नुकसान पहुँचाए बिना bladders में एक प्लैटिनम तार की प्रविष्टि की अनुमति catheterized हैं. कैथेटर Teflon तार, जो मूत्राशय में बिजली के वर्तमान आचरण के लिए एक जला चोट पैदा करेगा के लिए एक विसंवाहक के रूप में सेवा के बने होते हैं. एक electrocautery इकाई के लिए तार के उजागर अंत करने के लिए 2.5W देने, दूर जल बाह्य परतों और कार्सिनोमा कोशिकाओं है कि निलंबन में बाद में एक कैथीटेराइजेशन के माध्यम से मूत्राशय के लिए वितरित कर रहे हैं के लिए अनुलग्नक साइटों को उपलब्ध कराने के लिए प्रयोग किया जाता है. कक्ष 90 मिनट के लिए मूत्राशय में रहते हैं, जिसके बाद कैथेटर को हटाया और bladders के लिए स्वाभाविक रूप से नाली की अनुमति. अल्ट्रासाउंड के माध्यम से ट्यूमर के विकास पर नजर रखी है. विशेष ध्यान के साथ वीडियो में कैथीटेराइजेशन तकनीक के लिए भुगतान किया जाता है.

Protocol

1. पशु

1. स्त्री C57BL/6J चूहों (मुसलमानों मस्कुलस) संक्रामक ectoparasites, पेट का कीड़ा endoparasites, और एंटीबॉडी के मुक्त शिपिंग करने के लिए पहले विक्रेता द्वारा 17 murine वायरस को सत्यापित कर रहे हैं. चूहे AAALAC Tulane विश्वविद्यालय की मान्यता प्राप्त प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के साथ अनुसार पशु सुविधा में रखे जाते हैं ^1.
2. विशेष रूप से, चूहों व्यक्तिगत हवादार दृढ़ लकड़ी बिस्तर पर polycarbonate cageswith microisolation फिल्टर में सबसे ऊपर में रखे समूह (4-5 चूहों / पिंजरे) कर रहे हैं. वे विज्ञापन libitum pelleted कृंतक भोजन और पानी के नल प्रदान की जाती हैं.
3. चूहे अध्ययन के शुरू होने से पहले 7 दिनों acclimate करने के लिए अनुमति दी जाती है.

2. कक्ष

1. murine संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा सेल लाइन MB49 मूत्राशय ट्यूमर का उत्पादन किया है.
2. कक्ष Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन, और 100 इकाइयों / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में संवर्धित कर रहे हैं.
3. संस्कृतियों 37 पर रखा जाता है डिग्री सेल्सियस और 5% है मीडिया के _साथ सीओ 2 हर दो तीन दिन में परिवर्तन.

3. पशु Orthotopic ट्यूमर मॉडल

मूत्राशय ट्यूमर मॉडल यहाँ वर्णित के टपकाना गुंठर एट अल द्वारा वर्णित की प्रक्रिया के एक संशोधन ^है 2 .

1. संज्ञाहरण 2 ऑक्सीजन में isoflurane% (MWI / VetOne, मेरिडियन, आईडी, बिल्ली 501,017 #) के साथ प्रेरित है और 0.75-1.25% पर बनाए रखा. (एकाधिक जानवरों समवर्ती इलाज किया जा सकता है, जो isoflurane स्तर में वृद्धि की जरूरत होगी.) Corneal सुखाने को रोकने के, आँखें एक कृत्रिम आँसू नेत्र मरहम के साथ lubricated हैं. शरीर की गर्मी एक गर्म पैड के साथ एक कागज टांगना के तहत बनाए रखा है.
2. पीठ के निचले हिस्से के फर अस्तर धातु की थाली के साथ संपर्क को बढ़ावा देने के लिए काटा गया है, और मुंडा क्षेत्र electroconduction जेल के साथ लेपित है.
3. तो प्रत्येक माउस व्यक्तिगत पृष्ठीय recumbancy में एक धातु ग्राउंडिंग थाली पर रखा है, और मूत्राशय transurethrally हटाया ख़ंजर के साथ lubricated 24 गेज, 3 / 4 इंच, पर-the-सुई चतुर्थ कैथेटर का उपयोग catheterized है.
4. मूत्राशय मूत्र के सूखा है, और एक प्लैटिनम तार कैथेटर के माध्यम से मूत्र कैथेटर के प्रत्येक के अंत पर उजागर तार छोड़ने मूत्राशय में डाला जाता है - इस कैथेटर के lumenal अंत पर लगभग 2 मिमी. तार ऑक्सीकरण के लिए सामग्री के प्रतिरोध की वजह से प्लैटिनम का बना है.
5. एक 2.5 डब्ल्यू वर्तमान तो दूसरे के लिए लगभग 0.5 है एक electrocautery इकाई जमावट के लिए सेट के साथ तार के बाहरी भाग को छू द्वारा मूत्राशय के लिए लागू है.
6. तार तो मूत्राशय में एक दूसरे स्थान और एक और 2.5 डब्ल्यू लागू प्रभारी ले जाया जाता है.
7. तार हटा दिया है और 1x10 ⁶ कोशिकाओं / एमएल कैथेटर के माध्यम से एक 1ml सिरिंज के माध्यम से मूत्राशय में डाले है की एकाग्रता में MB49 कोशिकाओं के 100 μl.
8. सीरिंज छोड़ दिया जाता है कैथेटर से जुड़ी सेल निलंबन के तपका को रोकने, और चूहों catheterized संज्ञाहरण के अंतर्गत 90 मिनट के लिए रखा जाता है कोशिकाओं को जला साइटों की अनुमति देते हैं.
9. बाँझ सामान्य नमक के 100-200 μl आईपी इंजेक्शन द्वारा प्रत्येक वसूली के लिए पहले माउस को दिलाई है.
10. ऊष्मायन अवधि के अंत में कैथेटर को हटा रहे हैं और पशुओं के लिए गर्म पैड पर ठीक करने के लिए अनुमति दी जाती है जब तक ठीक सजगता वापस, पर जो बात चूहों अपने घर पिंजरों के लिए लौट रहे हैं.

4. अल्ट्रासाउंड

1. ट्यूमर के लिए 3-5 दिनों के लिए विकसित पहले चूहों मूत्राशय की अल्ट्रासाउंड परीक्षा से गुजरना ट्यूमर के विकास पर नजर रखने के लिए अनुमति दी जाती है है.
2. प्रारंभिक अल्ट्रासाउंड परीक्षाओं के लिए, जानवरों anesthetized ऊपर वर्णित के रूप में कर रहे हैं. चूहे पृष्ठीय recumbancy में रखा जाता है, और पेट की त्वचा फर कतरन द्वारा तैयार की है.
3. एक 24 गेज चतुर्थ कैथेटर transurethrally मूत्राशय में डाला जाता है. इस बिंदु पर, मूत्राशय और सूखा जा सकता है मूत्र आगे के विश्लेषण के लिए एकत्र.
4. बाँझ सामान्य नमक के 100 μl मूत्राशय में कैथेटर के माध्यम से डाले अल्ट्रासाउंड पर मूत्राशय दृश्यता में सुधार है.
5. अल्ट्रासाउंड प्रवाहकत्त्व जेल पेट के लिए लागू किया जाता है, और अल्ट्रासोनोग्राफी मूत्राशय दीवार और लुमेन का आकलन किया जाता है.

5. प्रतिनिधि परिणाम:

ट्यूमर ऊतक innoculation के बाद 3-5 दिनों दिखाई शुरू हो जाएगा. - पांच दिन से हमारे अनुभव में, 12 चूहों के एक समूह में, 50% या अधिक नियमित मूत्राशय के भीतर एक detectable ऊतक द्रव्यमान (1.0 μl, वी = / 6 π · एल डब्ल्यू · एच का उपयोग कर 0.5) है. जब एमबी 49 कोशिकाओं का उपयोग, ट्यूमर विकसित करने के लिए जारी और 24 दिन से इच्छामृत्यु की आवश्यकता होगी अगर अनुपचारित चूहों जाना होगा. इच्छामृत्यु जब चूहों सुस्त या क्षीण हो गया है की सिफारिश की है, फर झालरदार, hunching, और गैर जिम्मेदार व्यवहार, या जब वे अपने प्रारंभिक शरीर के वजन के 20% खो देते हैं. प्रदर्शित/ P>

ट्यूमर तेजी से बढ़ने और परिगलित केन्द्रों के बाद वे 200 मिलीग्राम या उससे अधिक, जाहिरा तौर ^पर 3 के एक बड़े पैमाने पर पहुँच क्योंकि विकासशील ट्यूमर में कोशिकाओं क्या angiogenic रक्त की आपूर्ति के द्वारा सेवित किया जा सकता है की तुलना में तेजी से पैदा करना होगा. एक भी hematurea, जो संभवतः विकासशील ट्यूमर के भीतर तेजी से angiogenesis के लिए संबंधित के स्तर के माध्यम से परोक्ष रूप से ट्यूमर प्रगति की निगरानी कर सकते हैं. यह लगातार कहा था कि इलाज ट्यूमर असर चूहों के मूत्र 14 दिन से रक्त निहित है. लाल रक्त कोशिकाओं की एकाग्रता इन चूहों में समय के साथ वृद्धि दिखाई है, और मूत्र की मात्रा कम एकत्र. 50 मिलीग्राम से अधिक ट्यूमर में रिश्तेदार आसानी के साथ भी palpated कर सकते हैं आमतौर पर 14 दिनों पोस्ट innoculation द्वारा हो.

Discussion

मादा चूहों में orthotopic मूत्राशय ट्यूमर की स्थापना का यह न्यूनतम इनवेसिव विधि भी सेल MB49 की तुलना में अन्य प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है, हालांकि अलग - अलग परिणाम पूर्वानुमानित किया जाना चाहिए. जब कम आक्रामक ट्यूमर कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है, थोड़ा वाट क्षमता बढ़ती है (0.5 डब्ल्यू वेतन वृद्धि का उपयोग करने के लिए नई इष्टतम स्थापित) एक और अधिक ट्यूमर सेल लगाव करने के लिए उत्तरदायी क्षेत्र उपज है, और डाले कोशिकाओं के लिए अब मूत्राशय ऊष्मायन बार एक बड़ी राशि के निकलेगा जला साइटों (अप्रकाशित डेटा) पर सेल लगाव. हालांकि कुछ प्रोटोकॉल electrocautery, ² के माध्यम से 10 डब्ल्यू पहुंचाने की सिफारिश सत्ता की इस राशि एक ऊपरी सीमा पर विचार किया जाना चाहिए, और शायद पूरी तरह से बचा जा. दिया कोशिकाओं की एकाग्रता बढ़ाने से भी सफलता की संभावना में वृद्धि जब अन्य प्रकार सेल का इस्तेमाल कर सकते हैं.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6J mice	Jackson Laboratory	000664	3-5-wk-old
Polycarbonate cages and ventilated rack	Lab Products	Super Mouse 750	327mm x 190mm x 143mm
Hardwood Bedding	Harlan Laboratories	Laboratory –grade SaniChips
Rodent diet	Harlan Laboratories	Rodent Diet 2019
IV Catheter	MWI Veterinary Supply	009231	24 G x ¾ in.
Electrocautery unit	Bovie Medical Corporation	Aaron 900
Ultrasound unit	Sonosite	180 Plus (Vet)
MB49 cell line	Wake Forest University Baptist Medical Center	N.A.
DMEM	Invitrogen	21063-029
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products	100106 500A57B
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-163